Visualización de la actina y los microtúbulos citoesqueletos en la sinapsis inmune de células B mediante microscopía de emisión (STED) el agotamiento

Presentamos un protocolo para el uso de microscopia de STED simultáneamente las estructuras de actina imagen, microtúbulos y proteínas microtubule plus final en las células de B que se han diseminado en cubreobjetos recubierto con anticuerpos contra el receptor de células B, un modelo para la fase inicial de formación de la sinapsis inmune.

El objetivo general de este protocolo es teñir los citoesqueletos de actina y microtúbulos en la sinapsis inmunitaria de las células B para la depleción de la emisión estimulada, o microscopía STED, y obtener imágenes de su estructura y organización en relaciones espaciales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la organización del citoesqueleto durante la activación de las células B, incluida la reorganización de los citoesqueletos de actina y microtúbulos durante la formación de sinapsis inmunitaria. La principal ventaja de la microscopía STED multicolor es que permite obtener imágenes simultáneas del citoesqueleto de actina, la red de microtúbulos y las proteínas clave asociadas al citoesqueleto con una resolución a escala nanométrica.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la activación de las células B, también se puede aplicar a la formación de sinapsis inmunitaria de otros tipos de células inmunitarias, como las células asesinas naturales y las células T. En general, las personas nuevas en este método encontrarán que la optimización de la configuración del microscopio para la obtención simultánea de imágenes y múltiples fluoróforos utilizando STED requerirá algo de práctica. Demostrando este procedimiento junto con Jia y Madison estarán Kate Choi y Caitlin Pritchard.

Comience centrifugando 2,5 veces 10 a la 6ª células de linfoma B A20 por cada transfección, y volviendo a suspender las células en 100 microlitros de reactivo de transfección suplementado con uno a 2,5 microgramos del ADN plasmático de interés. Mezcle las soluciones suavemente y transfiera cada alícuota de células a pocillos individuales de una placa de seis pocillos. Ajuste el volumen de cada pocillo a dos mililitros con un medio completo de 37 grados centígrados y coloque las celdas en una incubadora de 37 grados centígrados durante 18 horas.

A la mañana siguiente, sumerja 1,5 cubreobjetos de vidrio redondos de 18 milímetros en metanol al 100% y deje que los cubreobjetos se sequen completamente durante unos 10 minutos. Coloque los cubreobjetos secos en pocillos individuales de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos y agregue 400 microlitros de anticuerpo de inmunoglobulina G anti-ratón de cabra en el centro de cada cubreobjetos para que se forme una burbuja en el centro y se extienda a los bordes sin gotear en el pocillo. Incuba los cubreobjetos a temperatura ambiente durante 30 minutos.

A continuación, enjuague los cubreobjetos con un mililitro de PBS estéril por pocillo, tres veces, para eliminar los anticuerpos no unidos. Después del último lavado, guarde cada cubreobjetos en un mililitro de PBS fresco y estéril hasta la siembra de células. Cuando las células transfectadas estén listas, recójalas en un tubo cónico de 15 mililitros por centrifugación y vuelva a suspender los gránulos en un mililitro de solución salina tamponada HEPES modificada suplementada con FBS.

Después de contar, diluya las células a una concentración de dos por 10 a la quinta célula por mililitro y solución salina tamponada HEPES modificada más FBS, y use pinzas para transferir cada cubreobjetos a un trozo de película de parafina. Agregue 250 microlitros de células a cada cubreobjetos e incube los cubreobjetos a 37 grados centígrados durante 15 minutos en la oscuridad para permitir que las células se extiendan por las superficies recubiertas de antiinmunoglobulina G. Al final de la incubación, retire el exceso de solución salina de cada portaobjetos y cubra cada cubreobjetos con 350 microlitros de fijador, cuidando de que toda la superficie quede cubierta.

Después de 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente, utilice una micropipeta para aspirar cuidadosamente el fijador desde el borde de cada cubreobjetos y lavar los cubreobjetos con 500 microlitros de permeabilización y tampón de bloqueo. A continuación, permeabilizar y bloquear las células con 250 microlitros de permeabilización fresca y tampón de bloqueo durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, retire el exceso de tampón y etiquete las células con 50 microlitros del anticuerpo primario de interés durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.

Al final de la incubación, lavar el cubreobjetos tres veces con 500 microlitros de tampón de tinción por lavado y añadir 50 microlitros del anticuerpo secundario adecuado a cada cubreobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar el anticuerpo secundario, agregue 10 microlitros de reactivo de montaje a un portaobjetos de microscopio y monte los cubreobjetos en portaobjetos de microscopio individuales, con la célula hacia abajo. Luego, deje que los portaobjetos se sequen durante la noche en la oscuridad para obtener imágenes al día siguiente.

Para obtener imágenes de las células con microscopía STED, primero encienda el microscopio STED. Active los láseres de la lámpara de iluminación de epifluorescencia y abra el software del microscopio. Establezca los parámetros para los láseres de depleción STED y cargue la primera muestra en el microscopio.

Con el ocular, enfoque manualmente la muestra para seleccionar una celda con una expresión de GFP moderada. Acérquese a la celda seleccionada y seleccione la región de interés que desea obtener la imagen. Ajuste el enfoque para que el plano XY de la celda más cercana al cubreobjetos esté enfocado.

A continuación, en la pestaña Adquirir del software, marque la opción Entre fotogramas en el panel Escaneo secuencial para establecer la adquisición de imágenes en la adquisición secuencial de fotogramas. Establezca la potencia del láser STED para cada fluoróforo y utilice la barra deslizante para ajustar las potencias del láser de acuerdo con los fluoróforos utilizados en el experimento. Para aumentar la resolución y reducir la señal de fondo, abra la configuración de Adquisición y utilice el menú desplegable para seleccionar un valor mayor que uno para aumentar el promedio de líneas y/o fotogramas.

Compruebe la opción de ganancia para cada fluoróforo y los valores específicos de ganancia de tiempo para adquirir la señal fluorescente adecuada para STED con límite de tiempo y aumentar la potencia del láser STED para mejorar la resolución. Es fundamental optimizar el tiempo de adquisición de la muestra de microscopio y los fluoróforos que se utilizan para mejorar la resolución sin perder demasiado de la señal fluorescente. A continuación, adquiera manualmente varias imágenes para garantizar la reproducibilidad y desconvolucionar las imágenes utilizando un paquete de software de deconvolución de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

En el caso de las células de linfoma B A20, se diseminan en anticuerpos de inmunoglobulina NT inmovilizados. La microscopía STED utilizada junto con el software de deconvolución proporciona imágenes de mayor resolución de las estructuras del citoesqueleto que la microscopía confocal sola. Aunque la deconvolución de imágenes confocales produce una mejora sustancial en la resolución de la imagen, las imágenes STED desconvolucionadas proporcionan información estructural más detallada que las imágenes confocales convolucionadas.

El STED de un solo color también se puede utilizar para adquirir imágenes tridimensionales de superresolución de toda la red de citoesqueletos de células B. En estas imágenes multicolores de STED, se puede observar la tinción del anillo periférico de la actina dendrítica junto con la tinción de microtúbulos. Cuando se utilizan células transfectadas con proteínas de fusión fluorescentes, se deben tener en cuenta importantes alcanzar niveles de expresión óptimos y evitar los artefactos debidos a la sobreexpresión, mientras que una expresión demasiado baja de la proteína de fusión fluorescente también da lugar a imágenes de mala calidad.

También es esencial un enfoque cuidadoso, para incluir toda la región de interés. Por ejemplo, en esta imagen, solo partes de la red de microtúbulos estaban dentro del plano focal más cercano al cubreobjetos, lo que impedía un análisis completo de la muestra. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en dos días.

Un día para la preparación de la muestra y la tinción y un día para las imágenes de STED. Es importante recordar que hay que ajustar la cantidad de plasma que se va a utilizar para transfectar las células, de modo que se obtenga una expresión suficiente de la proteína fluorescente para su detección durante la obtención de imágenes, al tiempo que se evitan los artefactos por sobreexpresión. Siguiendo este procedimiento, se puede inducir la expresión de diferentes proteínas de fusión fluorescentes para facilitar la localización de otras proteínas que regulan la dinámica y organización del citoesqueleto, o para visualizar la distribución subcelular de proteínas involucradas en otros procesos celulares.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar la microscopía STED para obtener imágenes de las estructuras y proteínas del citoesqueleto que participan en la formación de sinapsis inmunitaria. No olvide que trabajar con fijadores como el glutaraldehído puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como trabajar en una campana de gases químicos al usar este tipo de reactivos.