Representación tridimensional y análisis de Immunolabeled, aclaró redes vasculares vellosas placentarias humanas

El objetivo general de este procedimiento es generar representaciones tridimensionales de fragmentos de árboles vellosos placentarios que sean adecuados para el análisis de sus redes vasculares contenidas. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en nuestro campo, como por qué un niño puede tener un crecimiento restringido o qué estrés y qué tan severo podría haber sido el estrés que condujo al parto prematuro. La principal ventaja de nuestro procedimiento es que ahora estamos en condiciones de inmunoetiquetar el tejido transparente de las vellosidades de la placenta y luego visualizar sus redes vasculares y utilizar esas visualizaciones para caracterizar y analizar estas redes vasculares.

Las implicaciones de esta técnica pueden extenderse a muchos diagnósticos y terapias, ya que la mayoría de las ciencias de la vida se basan en la caracterización histológica bidimensional. Valerie Schwenk, quien llevará a cabo el inmunomarcaje y la limpieza del tejido placentario, y luego el Sr. Phillip Necaise realizará la disección del tejido placentario y también la limpieza inversa del tejido. Para prepararse para la disección del árbol velloso, primero enjuague el tejido placentario formal y fijo con solución salina tamponada con fosfato.

Luego colóquelo en una placa de Petri en el escenario de un microscopio de disección. Para localizar el árbol velloso, use un bisturí y pinzas finas para desgarrar el tejido placentario. Luego, diseccione partes del árbol velloso de aproximadamente cinco milímetros de largo y transfiéralas a un microtubo que contenga un mililitro de solución salina tamponada con fosfato.

Reemplace la solución salina tamponada con fosfato por una nueva y espere 10 minutos con remolinos ocasionales. A continuación, sustituya la solución salina tamponada con fosfato por un tampón permeabilizante para permeabilizar el tejido y bloquear la unión inespecífica de los anticuerpos secundarios. Luego, incuba durante 30 minutos.

A continuación, sustituya el tampón permeable por solución salina tamponada con fosfato que contenga un dos por ciento de suero de cabra con anti CD31 monoclonal de ratón y anti CK7 de conejo. Deje el pañuelo a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, retire los anticuerpos restantes con lavados adicionales con solución salina tamponada con fosfato con suero de cabra al dos por ciento.

A continuación, se retira la solución salina tamponada con fosfato con un dos por ciento de suero de cabra y se añade el mismo tampón, suplementado con inmunoglobulina G anti-ratón de cabra junto con un fluoróforo verde e inmunoglobulina G anti-conejo de cabra junto con un fluoróforo infrarrojo. Incubar durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Luego, lave el pañuelo una vez con PBS-GS y guarde el pañuelo etiquetado en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que se aclare.

Lave las muestras tres veces con PBS a intervalos de 10 minutos. Para deshidratar el tejido, retire la solución salina tamponada con fosfato y agregue un 50% de etanol al tejido e incube durante 10 minutos. Después de la incubación, desechar y posteriormente lavar tres veces con etanol al 70% a intervalos de 10 minutos, seguidos de tres lavados con etanol al 100% a intervalos de 15 minutos.

Luego, use pinzas de punta fina para transferir el tejido a un microtubo lleno de un mililitro de solución durante cuatro horas. Después de cuatro horas, transfiera el tejido a un microtubo lleno de solución dos e incube durante otras cuatro horas. Para montar el tejido en una cámara Sykes-Moore, use pinzas de punta fina para colocar un cubreobjetos redondo de 25 milímetros en la base de la cámara.

Nuevamente, use las pinzas de punta fina para colocar una junta de goma en la base del cubreobjetos. Retire el pañuelo sumergido en la solución dos y colóquelo en el centro del cubreobjetos. A continuación, añade una gota de la solución dos, de aproximadamente 40 microlitros, sobre el pañuelo.

Luego, tome un segundo cubreobjetos y colóquelo encima de la junta. Luego, comprima el deslizamiento de la cubierta y la junta firmemente enroscando un anillo de bloqueo en la parte superior de la base. Luego, inserte una aguja de calibre 25 a través de la junta en el puerto de la base.

A continuación, llene una jeringa de tres mililitros con un punto cinco mililitros de solución dos. Luego, monte una aguja de calibre 25 en la jeringa e inserte la aguja en el puerto opuesto a través de la junta. Luego, comience a inyectar la cámara con la solución dos y verifique que el aire dentro de la cámara se ventile a través de la otra aguja de calibre 25.

Cuando la cámara esté llena, retire la aguja y la jeringa y coloque el soporte de la cámara Sykes-Moore en la platina del microscopio confocal. Utilice un objetivo 10X para enfocar el tejido colocado en la cámara. A continuación, establezca un punto de referencia para la platina y mueva la platina del microscopio hacia arriba y hacia abajo a través del plano focal para identificar y establecer la parte superior e inferior del tejido.

Establezca el tamaño del paso en dos coma cinco micrómetros y recopile un archivo de imagen confocal que contenga un conjunto de imágenes del tejido de arriba a abajo. Luego, transfiera el tejido a un microtubo que contenga más de 20 veces el volumen de etanol al 100% para revertir el aclaramiento. Luego, después de cada intervalo de una hora, reemplácelo con 70 y luego con 50% de etanol y, finalmente, solución salina tamponada con fosfato.

Almacene a cuatro grados centígrados en la oscuridad hasta que se incruste. Aquí, para mostrar la red vascular placentaria, se han adquirido imágenes microscópicas y microscópicas confocales de una placenta humana. Estas imágenes microscópicas de la placenta muestran el árbol velloso radiante que ha penetrado en el parénquima placentario.

Estas imágenes microscópicas muestran la presencia de una porción distal de trozos de árbol velloso que terminan en el grupo de vellosidades. A continuación, para mostrar la capa trofoblástica de las vellosidades, se realizó un inmunomarcado de la porción distal del árbol velloso. En la imagen, la capa externa del trofoblasto se muestra en verde y los capilares se muestran en rojo.

Luego, para revisar el tejido placentario antes y después de limpiar, se adquirieron imágenes confocales de tejidos placentarios aclarados y no aclarados. Las imágenes muestran que para un tejido no aclarado, la inmunofluorescencia se puede capturar a 100 micrómetros o menos de profundidad del tejido. Por el contrario, para limpiar el tejido placentario, la inmunofluorescencia se puede capturar a una profundidad mucho mayor.

Además, para comparar el tejido convencional con las secciones transparentes invertidas, el tejido aclarado se deshidrató en un proceso inverso con etanol. La tinción inmunohistoquímica del tejido placentario con anti CK7 antes y después del aclaramiento no demuestra alteraciones significativas en la morfología del tejido debido al aclaramiento. La animación muestra que el tejido velloso inmunoteñido se distribuye a lo largo de toda la profundidad del volumen del tejido.

Una vez que se sienta cómodo realizando el procedimiento, puede esperar que tome alrededor de 18 horas, divididas en tres días. Al intentar realizar este procedimiento, es importante recordar que requiere varios conjuntos de habilidades diferentes. Uno tiene que ser capaz de hacer patología placentaria, microscopía confocal.

Debe ser capaz de generar representaciones tridimensionales de las imágenes, y debe ser capaz de estar familiarizado con el procesamiento y el análisis inmunológicos. Siguiendo este procedimiento, se pueden llevar a cabo otros métodos como la histología tradicional, la página STS o el maldi. Con su desarrollo, esta técnica allana el camino en el campo de la medicina materno-fetal, la neonatología y la biología de trofoblastos para explorar las causas fundamentales que subyacen a la preeclampsia, el crecimiento fetal deficiente y el sufrimiento fetal.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo limpiar, renderizar y analizar el tejido velloso del árbol placentario. Muchas gracias por ver el video y buena suerte con tus experimentos.