Secado de la sangre y manchas de suero como una herramienta útil para el almacenamiento de la muestra a evaluar biomarcadores de cáncer

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación traslacional, como la posibilidad de estudiar biomarcadores en pacientes de países en desarrollo. La principal ventaja de esta técnica es la posibilidad de almacenar muestras de sangre y suero durante al menos dos semanas sin congelarse y proporcionar material de alta calidad para el análisis posterior, como qPCR y ELISA. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de enfermedades como el cáncer y las enfermedades infecciosas.

Este método también se puede aplicar hacia los campos de diagnóstico o investigación, como el estudio de enfermedades prenatales o el análisis de patologías infecciosas como el VIH. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando empezamos a comparar biomarcadores entre una serie de casos caucásicos y africanos para los que no se disponía de muestras congeladas. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de la extracción de sangre son difíciles de aprender.

En este procedimiento, se recogen tres mililitros de una muestra de sangre en un tubo de tres mililitros con 5,4 miligramos de EDTA. Escriba el número de código del paciente en la esquina inferior derecha de la tarjeta de ahorro. Vuelva a suspender cuidadosamente la sangre con una pipeta de cinco mililitros.

A continuación, pipetee y transfiera una mancha de sangre a la tarjeta de ahorro. Usando una nueva punta para cada alícuota de sangre, repita el manchado para obtener un total de tres a cinco manchas de sangre. Deje que las gotas de sangre seca, o DBS, se sequen durante la noche a temperatura ambiente con la tapa de la tarjeta de ahorro abierta en posición horizontal sobre una superficie abierta y no absorbente y evitando la luz solar directa.

Al día siguiente, guarde la tarjeta a temperatura ambiente en una bolsa de plástico con desecante hasta su uso. El ADN se extraerá de tres manchas de sangre seca de la tarjeta de ahorro. Comience cortando cada uno de los DBS de la tarjeta y separándolos de la tarjeta.

Corta el DBS separado en trozos pequeños de aproximadamente un milímetro de diámetro. Coloque las piezas pequeñas de un DBS en un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. Para digerir las muestras, agregue al tubo 180 microlitros de tampón de lisis de un kit de extracción de ADN disponible comercialmente, luego agregue 20 microlitros de proteinasa K.Mix por vórtice.

Coloque el tubo en una termoincubadora e incube agitando a 56 grados centígrados durante 60 minutos. Al final de la incubación, centrifugar brevemente el tubo para eliminar las gotas de la tapa. Comience el lavado agregando 200 microlitros de tampón de lisis dos y agite en vórtice durante 10 segundos.

Coloque el tubo en una termobatidora e incube a 70 grados centígrados durante 10 minutos. Coloque la columna de elusión en un nuevo tubo de recolección de dos mililitros y deseche el viejo. Agregue 500 microlitros de tampón de lavado y centrifugue a 6000 veces la gravedad durante un minuto.

Coloque la columna en un nuevo tubo de recolección de dos mililitros y deseche el viejo. Agregue 500 microlitros de tampón de lavado dos y centrifugue a 6000 veces la gravedad durante un minuto. Coloque la columna en un nuevo tubo de recolección de dos mililitros y deseche el viejo.

Centrifugar a 20.000 veces la gravedad durante tres minutos para secar la membrana. Para eluir el ADN, coloque la columna en un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 mililitros y deseche el tubo de recolección. Coloque 50 microlitros de agua destilada en el centro de la membrana e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Centrifugar el tubo a 20.000 veces la gravedad durante un minuto. Recoja el eluido y vuelva a colocarlo en el centro de la membrana. Vuelva a centrifugar el tubo a 20.000 veces la gravedad durante un minuto.

Deseche la membrana. Después de medir la concentración de ADN con un espectrofotómetro, almacene el ADN a menos 20 grados centígrados hasta su uso. Para este procedimiento, primero se recolectan siete mililitros de muestra de sangre periférica en un tubo de siete mililitros sin EDTA.

Deje que la muestra de sangre se coagule a temperatura ambiente durante 30 minutos. Escriba el número de código del paciente en la esquina inferior derecha de la tarjeta de ahorro. Centrifugar la muestra de sangre a 1100 veces la gravedad a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Retire el sobrenadante del tubo y transfiéralo a un nuevo tubo de 15 mililitros. Vuelva a suspender cuidadosamente la sangre con una pipeta de cinco mililitros. Pipetea y transfiere una mancha de suero a la tarjeta de ahorro.

Repita el manchado para tener un total de tres a cinco manchas de sangre. Deje secar las manchas de sero secas durante la noche a temperatura ambiente con la tapa de la tarjeta de ahorro abierta. Al día siguiente, guarde la tarjeta a temperatura ambiente en una bolsa de plástico con desecante hasta su uso.

Si el almacenamiento es más de 14 días, guárdelo a menos 20 grados centígrados. Prepárese para el ensayo ELISA descongelando el DSS para cada muestra si es necesario. Para eluir la proteína del DSS, corte un DSS en pedazos pequeños de aproximadamente un milímetro de diámetro y coloque los pedazos en un tubo de 1,5 mililitros.

Luego, agregue cuatro microlitros de PBS. Agite las muestras a baja velocidad a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, utilice una dilución adecuada del eluido proteico como muestra de suero para el análisis de la proteína secretada o del factor de crecimiento utilizando un kit disponible en el mercado.

En este protocolo, las muestras de sangre y suero se almacenaron como puntos secos en papel de filtro a temperatura ambiente. Se muestra una tarjeta de ahorro de proteínas representativa antes y después de la toma de muestras de sangre. Con el fin de confirmar que el almacenamiento en papel de filtro y el procedimiento para eluir la sangre no interfieren con la calidad de la muestra, se realizaron ensayos ELISA para la proteína de unión a la vitamina D, o niveles de DBP, en ocho muestras de suero recolectadas en un tubo de dos mililitros y almacenadas inmediatamente a menos 80 grados centígrados o recolectadas como manchas de suero seco.

El coeficiente de variación, o CV, entre muestras pareadas osciló entre el 2% y el 24% y la media del CV fue del 9,6%Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 10, 15 minutos si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar métodos posteriores de biología molecular o análisis de proteínas. Tras su desarrollo, esta técnica permite que la investigación en el campo de la investigación traslacional y el análisis de biomarcadores colabore con institutos de todo el mundo que no disponen de equipos de laboratorio para almacenar muestras biológicas en condiciones estándar.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo almacenar correctamente muestras de sangre en sangre seca y manchas de suero. No olvide que trabajar con sangre y reactivos químicos puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y una bata de laboratorio al realizar este procedimiento.