Name: Secado de la sangre y manchas de suero como una herramienta útil para el almacenamiento de la muestra a evaluar biomarcadores de cáncer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Aprende a almacenar sangre y suero en manchas secas para análisis de biomarcadores de cáncer sin congelación. Esta técnica permite conservar muestras de alta calidad durante al menos dos semanas para estudios de qPCR y ELISA.

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Nos gustaría agradecer a Gráinne Tierney por asistencia editorial.

Suero y sangre periférica fueron recogidos y almacenados procedentes de donantes sanos y pacientes que dieron consentimiento informado para participar en el estudio. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité local de ética conforme a las normas éticas establecidas en la declaración de Helsinki de 1964.
1. sangre almacenamiento en DBS
<ol><li>
Recogida de muestras de sangre
	<ol>
<li>Recoger 3 mL de muestra de sangre periférica en un tubo de 3 mL con 5,4 mg de ácido etilendiaminotetracético (EDTA). Nota: Almacene sangre periférica como DBS tan pronto como sea posible y dentro de 8 h.</li>
		<li>Escriba el número de código del paciente en la parte inferior derecha de la tarjeta de ahorro.</li>
		<li>Resuspender cuidadosamente la sangre con una pipeta de 5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sangre manchas en DBS
	<ol>
<li>Pipeta y transferir una mancha de sangre (50 μL) en la tarjeta de ahorro (Tabla de materiales) con una punta de 50 a 200 μl.</li>
		<li>Repetir el punto 1.2.1. para tener un total de 3 a 5 puntos de sangre. Deseche la punta vieja y tomar uno nuevo para cada sangre alícuota.</li>
		<li>Deje el DBS seco durante la noche a temperatura ambiente en posición horizontal sobre una superficie no absorbente abierta, evitando la luz directa sol. Deje la tapa de la tarjeta de ahorro abierta para facilitar el secado de la sangre. Nota: Cualquier partículas en el aire o polvo durante esta etapa de sequía no afectan a aplicaciones posteriores.</li>
		<li>Guarde la tarjeta en la temperatura ambiente en una bolsa con desecante hasta su uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ADN extracción a partir de DBS según ficha técnica extracción DNA Kit (sección para manchas de sangre seca)
<ol><li>
Preparación de la muestra
	<ol>
<li>Utilice 3 manchas de sangre seca de la tarjeta. Cortar cada una de las manchas de sangre seca de la tarjeta y separarlos de la tarjeta con las pinzas. Cortar las manchas de sangre seca separado en trozos pequeños (de aproximadamente 1 mm de diámetro).</li>
		<li>Coloque las piezas pequeñas en un tubo de centrífuga de 1.5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Digestión de la muestra
	<ol>
<li>Añadir 180 μl de tampón de lisis 1 en el juego (Tabla de materiales) al tubo. Añadir 20 μl de proteinasa K. No mezcle el tampón de lisis 1 con proteinasa k antes de pipetear en el tubo de 1,5 mL de sangre vista tarjeta. Mezclar con un vórtex.</li>
		<li>Coloque el tubo en un thermoincubator e incubar a 56 ° C durante 60 minutos. Si el thermoincubator no está equipado con un agitador, vórtice la muestra cada 10 – 15 min por lo menos 10 s, teniendo cuidado de no dejar que la temperatura de la muestra disminuye. Centrifugar brevemente los tubos para eliminar las gotas de la tapa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Paso de lavado
	<ol>
<li>Añadir 200 μL de tampón de lisis 2 (Tabla de materiales) y vortex por 10 s.</li>
		<li>Coloque los tubos en un Termomezcladores o incubadora orbital climatizada e incubar a 70 ° C durante 10 minutos. Si el thermoincubator no está equipado con un agitador vortex las muestras una vez por al menos 10 s, teniendo cuidado de no dejar que la temperatura de las muestras de disminuir.</li>
		<li>Repita el paso 2.3.1. Transferir 400 μL de lisado del tubo de 1,5 mL a columna de elución (Tabla de materiales). Centrifugar la columna a 6.000 x g durante 1 minuto.</li>
		<li>Coloque la columna de elución en un nuevo tubo de recogida de 2 mL y desechar el anterior.</li>
		<li>Añadir 500 μl de tampón de lavado 1 (Tabla de materiales) y centrifugar a 6.000 x g durante 1 minuto.</li>
		<li>Coloque la columna en un tubo nuevo de colección de 2 mL y desechar el anterior.</li>
		<li>Añadir 500 μl de tampón de lavado 2 (Tabla de materiales) y centrifugar a 6.000 x g durante 1 minuto.</li>
		<li>Coloque la columna en un tubo nuevo de colección de 2 mL y desechar el anterior.</li>
		<li>Centrifugue a 20.000 x g durante 3 min secar la membrana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Paso de elución
	<ol>
<li>Coloque la columna en un nuevo tubo de centrífuga de 1.5 mL y desechar el tubo de colección.</li>
		<li>Depositar 50 μl de agua destilada en el centro de la membrana. Incubar 10 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar el tubo a 20.000 x g durante 1 minuto recoger el eluyente y coloque otra vez en el centro de la membrana.</li>
		<li>Centrifugar el tubo a 20.000 x g durante 1 minuto deseche la membrana.</li>
		<li>Medir la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro.</li>
		<li>Tienda ADN a-20 ° C hasta su uso. Nota: La DNA extraída de DBS puede utilizarse para realizar varios análisis tales como evaluación de SNP por tiempo Real PCR o ADN Sanger secuenciación.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. suero almacenamiento para DSS
<ol><li>
Recogida de muestras de sangre
	<ol>
<li>Recoge 7 mL de la muestra de sangre periférica en un tubo de 7 mL sin EDTA. Dejar la muestra de sangre a coagular durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Escriba el número de código del paciente en la parte inferior derecha de la tarjeta de ahorro.</li>
		<li>Centrifugar la muestra de sangre en el 980 x g durante 15 min a temperatura ambiente. Nota: Almacene suero como DSS tan pronto como sea posible y dentro de las 8 h.</li>
		<li>Con cuidado quite el sobrenadante del tubo y transferir a un nuevo tubo de 15 mL. Resuspender cuidadosamente la sangre con una pipeta de 5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Suero manchado en DSS
	<ol>
<li>Pipeta y transferir un punto de suero (50 μL) en la tarjeta de ahorro. Repita este paso para tener un total de 3 a 5 puntos de sangre. Nota: Tenga muy cuidado al pipetear exactamente 50 μl de suero en cada punto. Suero no debe ir más allá de la línea discontinua de la tarjeta.</li>
		<li>Deje el DSS seco durante la noche a temperatura ambiente. Deje la tapa de la tarjeta de ahorro abierta para facilitar el secado de la sangre.</li>
		<li>Guarde la tarjeta en la temperatura ambiente en una bolsa con desecante hasta su uso. Si el almacenamiento es mayor de 14 días, guarde la tarjeta a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ensayo ELISA a partir de DSS
<ol><li>
Eluir la proteína de DSS.
	<ol>
<li>Si es necesario descongelar un DSS para cada muestra. Corte la DSS (aproximadamente 1 mm de diámetro). Poner las piezas en un tubo de 1,5 mL con 400 μL de PBS.</li>
		<li>Agitar las muestras durante la noche a 4 ° C. Nota: Les sacuda a baja intensidad. PBS no debe mojar la cubierta del tubo durante el sacudimiento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizar el efluente de la proteína como una muestra de suero para el análisis de factor de crecimiento secretado proteína según las instrucciones del kit de ELISA, después de las diluciones apropiadas. Nota: Este procedimiento funciona bien para DBP detección9. Para otros ensayos de ELISA, puede ser necesario un paso de optimización.</li>
</ol>

<ol><li>Bertagnolio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+drug+resistance+surveillance+using+dried+whole+blood+spots%5BTitle%5D)+AND+%22Antivir+Ther%22%5BJournal%5D)">HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots.</a> Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).</li>
<li>Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+filter+paper+for+the+collection+and+analysis+of+human+whole+blood+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens.</a> J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).</li>
<li>Garrido, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype+variability%2C+virological+response+and+drug+resistance+assessed+on+dried+blood+spots+collected+from+HIV+patients+on+antiretroviral+therapy+in+Angola%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemoth%22%5BJournal%5D)">Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola.</a> J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).</li>
<li>Steegen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+of+detecting+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+in+DNA+extracted+from+whole+blood+or+dried+blood+spots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots.</a> J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).</li>
<li>Costenaro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+load+detection+using+dried+blood+spots+in+a+cohort+of+HIV-1-infected+children+in+Uganda%3A+correlations+with+clinical+and+immunological+criteria+for+treatment+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure.</a> J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).</li>
<li>Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+glutathione+and+glutathione+disulfide+in+the+blood+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase-deficient+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns.</a> BMC Pediatr. 20 (17), 172(2017).</li>
<li>Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practice+in+the+measurement+and+interpretation+of+lysosomal+acid+lipase+in+dried+blood+spots+using+the+inhibitor+Lalistat+2%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2.</a> Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).</li>
<li>Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+25+inflammatory+markers+and+neurotrophins+in+neonatal+dried+blood+spots+by+immunoassay+with+xMAP+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology.</a> Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).</li>
<li>Amadori, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D+receptor+polymorphisms+or+serum+levels+as+key+drivers+of+breast+cancer+development%3F+The+question+of+the+vitamin+D+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway.</a> Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).</li>
<li>Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+hepatitis+B+virus+from+dried+blood+spots+by+polymerase+chain+reaction+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification.</a> J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).</li>
<li>Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+commercial+ELISA+for+the+detection+of+measles-specific+immunoglobulin+G+%28IgG%29+in+dried+blood+spots+collected+from+children+living+in+low-resource+settings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings.</a> J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).</li>
<li>Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA-based+assay+for+IP-10+detection+from+filter+paper+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples.</a> Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).</li>
<li>St Julien, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+quality+genome-wide+genotyping+from+archived+dried+blood+spots+without+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification.</a> PLoS One. 8 (5), e64710(2013).</li>
<li>Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+fentanyl+analogs+in+dried+blood+spots+by+flow-through+desorption+coupled+to+online+solid+phase+extraction+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry.</a> Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

Este protocolo investiga el potencial de almacenamiento de sangre y suero en papel filtro cuando los laboratorios no tienen el personal o las infraestructuras necesarias para el correcto manejo de las muestras de sangre. En particular, sangre entera o suero recogido en tubos estándar o por pinchazo de dedo puede almacenarse usando este método y no es necesario congelar las muestras a-20 ° C o -80 ° C inmediatamente después de la recolección de sangre. DBS/DSS puede permanecer a temperatura ambiente hasta por 14 días sin ...

El principal objetivo de la investigación en biomarcadores del cáncer es la identificación de nuevos parámetros biológicos que pueden utilizarse para el diagnóstico, de predicción de pronóstico paciente y para determinar si un paciente responderá a un tratamiento específico. Esta área de investigación es fundamental para el descubrimiento de tratamientos innovadores contra el cáncer y desempeña un papel clave en el tratamiento a medida.
Los procedimientos llevados a cabo durante cada paso de la identificación de biomarcadores y la validación deben ser fiables y reproducibles. Una piedra angular para el éxito de la investigación traslacional es el correcto almacenamiento de muestras biológicas tales como sangre y suero. Este es el primer paso hacia la obtención de material biológico de alta calidad que puede utilizarse para llevar a cabo experimentos de biología molecular o el análisis de proteínas.
A menudo se necesitan estudios multicéntricos reclutar suficientes pacientes para obtener datos robustos. No todos los institutos son capaces de almacenar las muestras a-80 ° C o enviar muestras a otros centros internacionales en hielo seco. El uso de papel de filtro para recolección de sangre es un método simple para el almacenamiento de sangre y suero y no requiere la congelación inmediata de las muestras1,2. Una gota de sangre o suero puede ser identificada en el papel, deja que seque durante la noche y entonces almacenar por hasta 14 días a temperatura ambiente1,2. Esto le da a los investigadores tiempo para enviar las muestras a otros laboratorios. El uso de sangre seca manchas (DBS) y manchas de suero seco (DSS) así podrían simplificar la colaboración entre los institutos en los países desarrollados y en vías de desarrollo.
Dada su facilidad de uso, muestreo de DBS es ampliamente utilizado en varios tipos de análisis genéticos o serológicos análisis aguas abajo. Por ejemplo, en el pasado, DBS se utiliza con frecuencia para el VIH en los países en desarrollo1,2,3,4,5. Otra ventaja de este método de almacenamiento es que se pueden recoger muestras de sangre del dedo-pinchazos, lo que permite su uso para recién nacidos cribado pruebas 6,7,8. Muestra fácil manipulación y el transporte son otras ventajas de DBS, especialmente para las muestras recogidas en sitios remotos donde no hay ningún equipo de laboratorio. En una publicación anterior, utilizamos DBS y DSS para probar la vitamina D y proteína de unión a vitamina D (DBP) en una serie de pacientes caucásicos y africanos9. Nuestros colegas africanos no fueron capaces de obtener hielo seco. Para comparar los marcadores biológicos para entender las diferencias en el camino de vitamina D entre las dos poblaciones étnicas, hemos mejorado el procedimiento de emparejado muestras almacenadas bajo condiciones estándar y en papel de filtro. Después de optimizar el procedimiento DBS/DSS, hemos podido analizar el DBP y la vitamina D en suero del paciente en ambas cohortes. También se evaluó una serie de polimorfismos de nucleótido único (SNPs) después de la extracción de ADN de sangre para los caucásicos y de DBS para los africanos9. El presente Protocolo permite las muestras de sangre de alta calidad para ser almacenado a temperatura ambiente sin que afecten a diferentes tipos de análisis aguas abajo desde biología molecular hasta los ensayos ELISA. Se recomienda administrar materiales biológicos en estudios multicéntricos o centros que no disponen de instalaciones para las condiciones de almacenamiento estándar. El siguiente protocolo representa la culminación de estos procedimientos optimizados.

<table><tbody><tr><td>Tarjetas ahorradoras de proteínas Whatman 903 Tarjetas ahorradoras de proteínas, 100/pk&lrm;</td><td>Sigma</td><td>Z761575</td><td>Útil para almacenar muestras a temperatura ambiente para análisis posteriores</td></tr><tr><td>Pipetas serológicas Falcon, 5 mL</td><td>Stem cell</td><td>#38003</td><td></td></tr><tr><td>50-200 &micro; Puntas L</td><td>Star-Lab</td><td>S1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA microkit</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>Este es un kit de extracción de ADN diseñado para aislar pequeñas cantidades de ADN&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Tampón ATL (incluido en el microkit de ADN QIAamp)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Esto se informa como Tampón de lisis 1 en el texto</td></tr><tr><td>Tampón AL (incluido en el microkit de ADN QIAamp)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Esto se informa como Tampón de lisis 2 en el texto</td></tr><tr><td>QIAamp mini columna de eluto</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Esto se informa como columna en el texto</td></tr><tr><td>AW1&nbsp; (incluido en el microkit de ADN QIAamp)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Esto se informa como Wash Buffer 1 EN EL TEXTO</td></tr><tr><td>AW2&nbsp; (incluido en el microkit de ADN QIAamp)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Esto se reporta como Wash Buffer 2 en el texto</td></tr><tr><td>Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit</td><td>R& Sistemas D</td><td>DVDBP0</td><td></td></tr></tbody></table>

secado de la sangre y manchas de suero como una herramienta útil para el almacenamiento de la muestra a evaluar biomarcadores de cáncer

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

Calidad de la muestra de sangre es crucial para asegurar el exactos análisis aguas abajo como en tiempo real PCR o ELISA. Almacenamiento correcto de materiales biológicos es el punto de partida para lograr resultados reproducibles y confiables. Todas las muestras deben ser tratadas de la misma forma de colección de sangre para almacenamiento. Dependiendo de los análisis a realizar, muestras de suero y sangre entera deben almacenarse a-20 ° C o -80 ° C hasta su uso. Las muestras de suero de sangre deben ser también alícuotas para evitar múltiples hielo-deshielo. Otra cuestión importante es las condiciones de la muestra durante el transporte de un laboratorio a otro. Si no hay hielo seco o el envío tarda más de unos días, se necesitan enfoques alternativos. Una opción es utilizar papel de filtro para recolección de sangre. Aquí, proponemos un método para la sangre y toma de muestras de suero que se aprovecha de secado manchas de sangre (DBS) y secado manchas de suero (DSS). Desarrollamos el procedimiento para extraer ADN de DBS para la posterior evaluación de algunos polimorfismos de nucleótido único (SNPs) por PCR en tiempo real. También hemos optimizado un ensayo de ELISA a partir de proteínas eluidas de DSS. Este método puede utilizarse con otros ensayos de ELISA o procedimientos de evaluación de las proteínas.

Tomamos ventaja de los procedimientos de DBS y DSS para almacenar sangre y suero a temperatura ambiente sin afectar la calidad del material biológico. La figura 1 muestra un ejemplo del protector de la tarjeta de la proteína sin sangre y después de la recolección de sangre. Para confirmar que el almacenamiento en papel de filtro y el procedimiento a fin de eluir sangre no interfieren con la calidad de la muestra, realizamos una comparación con métodos de alma...

Este protocolo describe un método sencillo y útil para almacenar sangre periférica y suero o plasma para análisis de aguas abajo como evaluación de un solo nucleótido polimorfismo (SNP) y el ensayo ELISA.

Secado de la sangre y manchas de suero como una herramienta útil para el almacenamiento de la muestra a evaluar biomarcadores de cáncer

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación traslacional, como la posibilidad de estudiar biomarcadores en pacientes de países en desarrollo. La principal ventaja de esta técnica es la posibilidad de almacenar muestras de sangre y suero durante al menos dos semanas sin congelarse y proporcionar material de alta calidad para el análisis posterior, como qPCR y ELISA. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de enfermedades como el cáncer y las enfermedades infecciosas.Este método también se puede aplicar hacia los campos de diagnóstico o investigación, como el estudio de enfermedades prenatales o el análisis de patologías infecciosas como el VIH. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando empezamos a comparar biomarcadores entre una serie de casos caucásicos y africanos para los que no se disponía de muestras congeladas. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de la extracción de sangre son difíciles de aprender.En este procedimiento, se recogen tres mililitros de una muestra de sangre en un tubo de tres mililitros con 5,4 miligramos de EDTA. Escriba el número de código del paciente en la esquina inferior derecha de la tarjeta de ahorro. Vuelva a suspender cuidadosamente la sangre con una pipeta de cinco mililitros.A continuación, pipetee y transfiera una mancha de sangre a la tarjeta de ahorro. Usando una nueva punta para cada alícuota de sangre, repita el manchado para obtener un total de tres a cinco manchas de sangre. Deje que las gotas de sangre seca, o DBS, se sequen durante la noche a temperatura ambiente con la tapa de la tarjeta de ahorro abierta en posición horizontal sobre una superficie abierta y no absorbente y evitando la luz solar directa.Al día siguiente, guarde la tarjeta a temperatura ambiente en una bolsa de plástico con desecante hasta su uso. El ADN se extraerá de tres manchas de sangre seca de la tarjeta de ahorro. Comience cortando cada uno de los DBS de la tarjeta y separándolos de la tarjeta.Corta el DBS separado en trozos pequeños de aproximadamente un milímetro de diámetro. Coloque las piezas pequeñas de un DBS en un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. Para digerir las muestras, agregue al tubo 180 microlitros de tampón de lisis de un kit de extracción de ADN disponible comercialmente, luego agregue 20 microlitros de proteinasa K.Mix por vórtice.Coloque el tubo en una termoincubadora e incube agitando a 56 grados centígrados durante 60 minutos. Al final de la incubación, centrifugar brevemente el tubo para eliminar las gotas de la tapa. Comience el lavado agregando 200 microlitros de tampón de lisis dos y agite en vórtice durante 10 segundos.Coloque el tubo en una termobatidora e incube a 70 grados centígrados durante 10 minutos. Coloque la columna de elusión en un nuevo tubo de recolección de dos mililitros y deseche el viejo. Agregue 500 microlitros de tampón de lavado y centrifugue a 6000 veces la gravedad durante un minuto.Coloque la columna en un nuevo tubo de recolección de dos mililitros y deseche el viejo. Agregue 500 microlitros de tampón de lavado dos y centrifugue a 6000 veces la gravedad durante un minuto. Coloque la columna en un nuevo tubo de recolección de dos mililitros y deseche el viejo.Centrifugar a 20.000 veces la gravedad durante tres minutos para secar la membrana. Para eluir el ADN, coloque la columna en un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 mililitros y deseche el tubo de recolección. Coloque 50 microlitros de agua destilada en el centro de la membrana e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos.Centrifugar el tubo a 20.000 veces la gravedad durante un minuto. Recoja el eluido y vuelva a colocarlo en el centro de la membrana. Vuelva a centrifugar el tubo a 20.000 veces la gravedad durante un minuto.Deseche la membrana. Después de medir la concentración de ADN con un espectrofotómetro, almacene el ADN a menos 20 grados centígrados hasta su uso. Para este procedimiento, primero se recolectan siete mililitros de muestra de sangre periférica en un tubo de siete mililitros sin EDTA.Deje que la muestra de sangre se coagule a temperatura ambiente durante 30 minutos. Escriba el número de código del paciente en la esquina inferior derecha de la tarjeta de ahorro. Centrifugar la muestra de sangre a 1100 veces la gravedad a temperatura ambiente durante 15 minutos.Retire el sobrenadante del tubo y transfiéralo a un nuevo tubo de 15 mililitros. Vuelva a suspender cuidadosamente la sangre con una pipeta de cinco mililitros. Pipetea y transfiere una mancha de suero a la tarjeta de ahorro.Repita el manchado para tener un total de tres a cinco manchas de sangre. Deje secar las manchas de sero secas durante la noche a temperatura ambiente con la tapa de la tarjeta de ahorro abierta. Al día siguiente, guarde la tarjeta a temperatura ambiente en una bolsa de plástico con desecante hasta su uso.Si el almacenamiento es más de 14 días, guárdelo a menos 20 grados centígrados. Prepárese para el ensayo ELISA descongelando el DSS para cada muestra si es necesario. Para eluir la proteína del DSS, corte un DSS en pedazos pequeños de aproximadamente un milímetro de diámetro y coloque los pedazos en un tubo de 1,5 mililitros.Luego, agregue cuatro microlitros de PBS. Agite las muestras a baja velocidad a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, utilice una dilución adecuada del eluido proteico como muestra de suero para el análisis de la proteína secretada o del factor de crecimiento utilizando un kit disponible en el mercado.En este protocolo, las muestras de sangre y suero se almacenaron como puntos secos en papel de filtro a temperatura ambiente. Se muestra una tarjeta de ahorro de proteínas representativa antes y después de la toma de muestras de sangre. Con el fin de confirmar que el almacenamiento en papel de filtro y el procedimiento para eluir la sangre no interfieren con la calidad de la muestra, se realizaron ensayos ELISA para la proteína de unión a la vitamina D, o niveles de DBP, en ocho muestras de suero recolectadas en un tubo de dos mililitros y almacenadas inmediatamente a menos 80 grados centígrados o recolectadas como manchas de suero seco.El coeficiente de variación, o CV, entre muestras pareadas osciló entre el 2% y el 24% y la media del CV fue del 9,6%Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 10, 15 minutos si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar métodos posteriores de biología molecular o análisis de proteínas. Tras su desarrollo, esta técnica permite que la investigación en el campo de la investigación traslacional y el análisis de biomarcadores colabore con institutos de todo el mundo que no disponen de equipos de laboratorio para almacenar muestras biológicas en condiciones estándar.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo almacenar correctamente muestras de sangre en sangre seca y manchas de suero. No olvide que trabajar con sangre y reactivos químicos puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y una bata de laboratorio al realizar este procedimiento.

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Los biomarcadores son indicadores biológicos medidos directamente-de la enfermedad o la salud. En la población y de las ciencias sociales, los biomarcadores deben ser fáciles de obtener, transportar y analizar. Secado de gotas de sangre (DBS) colección responde a esta necesidad, se puede recoger en el campo con altas tasas de respuesta y analizada por una variedad de biomarcadores.

Sangre Seca Colección de Biomarcadores de salud para maximizar la participación en estudios de población

Aquí describimos un ensayo de cromatografía líquida de alta resolución-espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS) para cuantificar el inmunosupresor tacrolimus en manchas de sangre seca utilizando un paso simple de precipitación manual de proteínas y extracción en columna en línea.

Cuantificación del inmunosupresor tacrolimus en gotas de sangre seca mediante LC-MS/MS

La preparación y tratamiento de manchas de sangre seca (DBS) para su análisis final son todavía poco estandarizados para diagnóstico mayoría de las aplicaciones. Para superar esta deficiencia, un completo protocolo paso a paso se sugiere y posteriormente evaluado en cuanto a su eficacia para la detección de marcadores de las infecciones virales.

Manchas de sangre seca - preparación y procesamiento para su uso en inmunoensayos y en técnicas moleculares

Los tumores cutáneos se descartan a menudo después de la cirugía micrográfica de Mohs. Se describe aquí un protocolo que permite al personal de soporte clínico procesar y almacenar eficazmente muestras de tumores cutáneos ( por ejemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma basocelular y melanoma) para aplicaciones de laboratorio aguas abajo sin interferir con las operaciones clínicas.

Establecimiento de un Biorepository basado en la Clínica

Aquí, presentamos un protocolo para detectar mutaciones somáticas tumorales en el ADN circulante presente en fluidos biológicos del paciente (biofluidos). Nuestro método basado en la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas (dPCR) permite cuantificar la frecuencia alélica de la mutación tumoral (MAF), facilitando un complemento mínimamente invasivo para el diagnóstico y el monitoreo temporal de la respuesta tumoral.

Detección y seguimiento del ADN circulante asociado a tumores en biofluidos del paciente

Los biobancos son recursos cruciales para la investigación biomédica y el Biobanco de Medicina Traslacional y Digital del Instituto Europeo de Oncología es un modelo en este campo. Aquí, proporcionamos una descripción detallada de los procedimientos operativos estándar de los biobancos para la gestión de diferentes tipos de muestras biológicas humanas.

Biobanco para Medicina Traslacional: Procedimientos Operativos Estándar para el Manejo Óptimo de Muestras

La biopsia líquida ha revolucionado nuestro enfoque de los estudios traslacionales oncológicos, siendo la recolección de muestras, la calidad y el almacenamiento pasos cruciales para su aplicación clínica exitosa. Aquí describimos un protocolo estandarizado y validado para aplicaciones de ADN libre de circulación aguas abajo que se puede aplicar en la mayoría de los laboratorios de investigación traslacional.

Un protocolo preanalítico estandarizado de biopsia líquida para aplicaciones de ADN libre de circulación aguas abajo

Este documento describe la aplicación de equipos automatizados para separar y recolectar sustancias de manera fácil y eficiente, como ADN libre de células y células tumorales circulantes, de sangre total.

Separación y recolección automáticas de sustancias relacionadas con el cáncer a partir de muestras clínicas

Se presenta un protocolo para la determinación de biomarcadores de baja abundancia a partir de muestras de suero seco ejemplificado con el péptido liberador de progastrina biomarcador (ProGRP). Las perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos se utilizan para la limpieza selectiva y el enriquecimiento de un péptido ProGRP proteotípico. El péptido capturado se analiza posteriormente mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem.

Micromuestreo en análisis de proteínas basado en espectrometría de masas dirigida de proteínas de baja abundancia

Este protocolo describe un método para facilitar la recolección de muestras de prostatectomía radical. El objetivo es mapear, caracterizar y micro-macro diseccionar muestras de tejido de los especímenes en base a criterios anatomopatológicos antes de almacenarlas en un Biobanco.

Mejora de la fiabilidad de los biobancos de tumores de próstata con una técnica de muestreo y caracterización histológica mejoradas

Este protocolo estandariza el análisis SDS-PAGE para el perfilado personalizado de corona de proteínas en nanopartículas, permitiendo la detección reproducible, escalable y de bajo coste de firmas específicas de cáncer. Diseñado para el diagnóstico precoz del adenocarcinoma ductal pancreático, ofrece una alternativa práctica y alineada con REASSURED a métodos proteómicos complejos tanto en entornos de investigación como clínicos.

Flujo de trabajo estandarizado SDS-PAGE para el perfilado personalizado de corona de proteínas en la detección temprana del cáncer

Aprende a almacenar sangre y suero en manchas secas para análisis de biomarcadores de cáncer sin congelación. Esta técnica permite conservar muestras de alta calidad durante al menos dos semanas para estudios de qPCR y ELISA.

Secado de la sangre y manchas de suero como una herramienta útil para el almacenamiento de la muestra a evaluar biomarcadores de cáncer (Video) | JoVE Journal

Secado de la sangre y manchas de suero como una herramienta útil para el almacenamiento de la muestra a evaluar biomarcadores de cáncer

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