Un ensayo de tecolote/túnel para la detección de la hipoxia en larvas de Drosophila melanogaster

El objetivo general de este ensayo es identificar las larvas de Drosophila que sufren de hipoxia tisular a pesar de estar en niveles normales de oxígeno. En Drosophila hay muchas mutaciones que producen un crecimiento lento y pobre de las larvas y cierta lentitud larvaria. Este ensayo identifica dentro de esa clase de larvas, aquellas que sufren de hipoxia tisular.

En última instancia, este ensayo ayudará a identificar más mutaciones que producen deficiencia de oxígeno en los tejidos a través de diversos procesos fisiológicos. La idea de este ensayo surgió de la observación de que las larvas con las vías respiratorias o la tráquea dañadas mostraban dos comportamientos extraños. Estos comportamientos anormales son la incapacidad de excavar en la comida durante la vida temprana de las larvas y la incapacidad de hacer un túnel hacia un sustrato más blando durante la fase de deambulación.

Establezca los cruces genéticos de control y experimentales en platos de puesta de huevos como se describe en el protocolo de texto. Mantenga las moscas en la oscuridad durante al menos dos días antes de comenzar las recolecciones de huevos cronometradas. Para la recolección de huevos cronometrada, transfiera a los adultos a nuevos platos de agar uva decorados con una mancha fresca de pasta de levadura temprano en el día y permita que los adultos pongan huevos en los platos durante cuatro horas.

Después de cuatro horas, transfiera a los adultos a platos de agar uva fresca. A continuación, incube las placas de recolección de cuatro horas durante la noche a 25 grados centígrados. A la tarde siguiente, la mayoría de las larvas habrán eclosionado.

Planee tener al menos 50 para cada grupo experimental. Para una sola ejecución del ensayo, prepare al menos cinco placas de ensayo por grupo experimental. Añadir 16 gramos de agar mosca y 700 mililitros de agua desionizada por calentamiento.

Prepare un Nipagen de 17,5 mililitros en etanol al 95%. Caliente la solución de agar hasta que se disuelva casi por completo. Luego agregue la solución de Nipagen a la solución de agar y caliente hasta que el agar se disuelva por completo.

Enfríe brevemente la solución de agar, luego cargue placas de 10 centímetros con 15 mililitros de la solución de agar. Una vez que el agar se gelifique, coloque tapas en los platos y déjelos secar a temperatura ambiente durante unas horas o toda la noche. El agar curado debe ser firme al tacto y resistir el desmoronamiento cuando se cortan pedazos.

Una vez que el agar se haya curado, use una tabla de corcho de 1,5 centímetros para hacer un agujero central en el gel de agar en cada placa. A continuación, rellene los agujeros cuidadosamente con pasta de levadura fresca. Para transferir las larvas a la placa de ensayo, haga una herramienta simple.

Dobla una curva en la punta de una microespátula de plástico y sumerge la punta en pasta de levadura para hacerla adhesiva a las larvas. Ahora recoja las primeras larvas del primer estadio individualmente y colóquelas en la placa de agar cerca del montículo de comida. Para cada grupo experimental, prepare al menos cinco platos, cada uno con 10 larvas.

Para garantizar la reproducibilidad entre las repeticiones de ensayo, es fundamental que solo se coloquen 10 larvas en cada placa de ensayo. Asegúrese de revisar cuidadosamente la placa de ensayo para determinar que se transfiere una sola larva cada vez que entrega una larva con la punta de la microespátula. Una vez que esté cargado un plato, etiquételo, cúbralo y luego colóquelo en la oscuridad con la tapa hacia arriba a temperatura ambiente.

Examine cada placa diariamente hasta que todas las larvas hayan muerto o pupado. A continuación, se muestran ejemplos de placas para una cepa de tipo silvestre durante el segundo hasta el octavo día del ensayo. En el segundo día, las larvas se entierran en la comida y no se produce ningún túnel.

La excavación de túneles comienza el tercer día y alcanza un máximo entre los días cinco y ocho, cuando las larvas dejan de deambular y pupan en sus túneles. Transfiera con cuidado las pupas con una aguja de burla doblada a un plato de uva y, si lo desea, cuente cuántas pupas contienen. Tome nota de la formación de pupas y evalúe las pupas en busca de anomalías.

Para obtener imágenes de los túneles dentro de la placa de ensayo, primero retire con cuidado y deseche toda la comida de levadura del pocillo central de cada placa. Luego, inunda suavemente cada plato con agua del grifo y usa un pincel suave para frotar cuidadosamente cualquier residuo que se haya arrastrado sobre la superficie del agar. Algunos pedazos de agar pueden desmoronarse donde la tunelización es más intensa.

Esto se puede corregir más adelante. Continúe reemplazando el agua varias veces y cepille suavemente los desechos hasta que la placa esté completamente limpia. A continuación, enjuague por última vez la placa con agua desionizada, cúbrala y déjela secar a temperatura ambiente durante la noche.

Es importante utilizar un suave chorro de agua y unas pinceladas suaves para limpiar las placas de agar para que no se rompan ni dañen partes del gel de agar. Al día siguiente, prepare una imagen de archivo tiff de la placa con un fondo negro para mostrar los túneles como líneas blancas brillantes. Los sistemas de documentación en gel funcionan bien para este paso.

A continuación, cuantifique el efecto túnel en la imagen utilizando la Imagen J con la herramienta Óvalo, defina el gel de agar hasta, pero sin incluir, el borde de plástico de la placa de Petri. A continuación, aplique un umbral automático para producir una imagen inversa de la placa de modo que los túneles aparezcan como líneas negras. Para corregir las áreas oscuras que no contienen túneles, utilice las herramientas Selector de color y Pincel para blanquear esas regiones.

A continuación, en el menú desplegable Analizar, seleccione Establecer escala y haga clic para eliminar la escala. A continuación, vaya a la ventana Establecer medidas en Analizar y marque Área y Límite hasta umbral. Ahora presione la tecla Control con la tecla M para obtener una medida del área negra en la imagen en la unidad de píxeles que representa el área tunelizada.

Para cuantificar la tunelización perdida por la erosión del agar alrededor del agujero central, desmarque Limitar al umbral. Utilice la herramienta Varita para definir el agujero central y pulse Control más M para medir su valor en píxeles. Reste de este valor el valor de píxel de un agujero de 1,5 centímetros de diámetro.

Agregue la diferencia al valor de píxel obtenido anteriormente para obtener el valor total de píxel de tunelización. En el caso de las placas en las que el agar faltante se extiende más allá del anillo central de tunelización, es necesario un paso adicional para evitar que la cuantificación incluya áreas fuera de la región central. Utilice las herramientas Selector de color y Pincel para agregar una barra negra, como se muestra para limitar el área cuantificada.

El ensayo descrito se utilizó para investigar la posible hipoxia en larvas con deterioro de la función del gen no inflable en la tráquea. El gen fue suprimido por ARNi a través de Gal4 UAS. Se utilizaron dos líneas Gal4.

Breathless Gal4, que se expresa a través de todo el desarrollo en todo el sistema traqueal. O cut(ue)Gal4, que se expresa fuertemente en una pequeña sección traqueal durante la vida de las larvas. Las larvas de control contenían una de las líneas Gal4, pero no ARNi no inflable.

Las larvas con cut(ue)Gal4 que impulsaban ARNi no inflable fueron indistinguibles de los controles durante todo el desarrollo, tanto en términos de crecimiento como de comportamiento. Sin embargo, la fuerte supresión de ARNi no inflable a lo largo de las tráqueas con blt-Gal4 resultó en un fracaso en la excavación en la fase de alimentación y produjo una alta tasa de mortalidad. Estas larvas también mostraron una ausencia completa de túneles durante la fase de deambulación.

Además, las larvas experimentales de Gal4 eran más pequeñas, más delgadas y más lentas que los controles y permanecieron como larvas mucho después de que todos los demás grupos puparan. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar las larvas de Drosophila para detectar hipoxia tisular mediante el monitoreo de la medida en que se entierran en sus montículos de alimento o hacen un túnel en un sustrato blando. La ausencia total de tunelización es un fuerte indicador de hipoxia tisular.