Name: Un ensayo de tecolote/túnel para la detección de la hipoxia en larvas de Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprende a detectar hipoxia tisular en larvas de Drosophila melanogaster mediante un ensayo de tecolote/túnel. Este método permite identificar mutantes con deficiencia de oxígeno y diferenciarlos de otros fenotipos similares.

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Karen M. Qiang recibió el 2016 con el Premio de investigación de George J. Schroepfer Universidad de Rice. Fanli Zhou es el beneficiario de una beca de enseñanza de la Universidad de Rice. Los servicios de la Bloomington Drosophila Stock Center, la facilidad de viaje de Harvard, el centro de recursos de Drosophila de Viena se agradece.

1. preparación de las larvas
<ol><li>Dos o más días antes de iniciar el análisis, establecer cruces de la experimental y controlar combinaciones (mínimas 20 hembras y 10 machos cada uno) en platos de huevo-pone como descrito por Wieschaus y Nusslein-Volhard 13 pero usando el polipropileno de 50 mL vasos y 6,0 cm desechables platos de Petri que contienen agar uva y untadas con pasta de levadura antes de usar. Tener moscas en platos de huevo-pone en oscuridad a temperatura ambiente hasta que se necesite.</li>
	<li>Receta de agar uva – combinar 100 mL congelado 100% uva jugo concentrado, 350 mL de agua de deioinized, 5 mL glacial acético y 13 g D. melanogaster agar en un vaso de precipitados de vidrio de 1 L. Microondas en ráfagas de 1-2 min., revolviendo entre ráfagas, hasta que el agar se disuelve. Enfríe la solución por unos minutos luego añadir 10 mL de 10% (p/v) de Nipagen (-p-hidroxibenzoato de metilo) en etanol al 95%. Mezcla, luego la pipeta 7 mL por placa en placas de Petri desechables 6,0 cm, permite gel y secar a temperatura ambiente durante 3-4 h. tienda a 4 0C en bolsas de plástico.</li>
	<li>Levadura pasta receta – 7 g secado de levadura, 10 mL de agua desionizada, mezcle con una espátula hasta obtener consistencia uniforme.</li>
	<li>El tiempo colecciones del huevo para generar experimental y control de las larvas. Nuevo, utilizando placas manchada de levadura, uvas, recoger los huevos a temperatura ambiente durante 4 h en la oscuridad durante horas de la mañana. Quitar estas placas de colección de 4 h y reemplazar con platos frescos. Incubar las placas de la colección de 4 h durante la noche a 25 0C hasta la tarde del día siguiente, cuando la mayoría de las larvas habrán tramado. Recoger estas larvas de primer estadio y utilizarlas para establecer el experimento.</li>
</ol>2. configuración de las placas de ensayo
<ol><li>Preparación de las placas de ensayo. Para una única prueba de ensayo, preparar cinco placas ensayo cada de 10 larvas experimentales y cinco placas de 10 larvas de control. Utilice una broca de corcho de 1,5 cm para extraer un núcleo central de agar de cada placa creando un agujero para la comida. Poner la pasta de levadura (0,8 - 0,9 g) en el agujero y palmaditas suavemente con una espátula para hacer un montículo en el orificio de llenado.</li>
	<li>Preparación de la placa de agar-combinan 700 mL de agua desionizada con agar de D. melanogaster 16 g en un vaso de precipitados de vidrio de 2 L y microondas por 5 minutos retirar del microondas y remover con una varilla de vidrio para poner agar disuelto en la solución. Añadir 17,5 mL de 10% (w/v) Nipagen en etanol al 95%, mezcla, luego continuar calefacción microondas de 30 ráfagas de s siguió revolviendo, hasta que todos agar se disuelva completamente. Fría durante un minuto o dos, luego pipetear alícuotas de 15 mL en Petri de 10 cm de plástico. Permiten agar gel, cubrir las placas con las tapas y dejarlos secar a temperatura ambiente durante unas horas o toda la noche. Almacenar las placas en bolsas de plástico selladas a 18 ° C. Nota 1: Para evitar la formación de cristales de Nipagen en la superficie de las placas debido a la desecación excesiva, utilice las placas dentro de unos días de preparación. Si es necesario, cristales pueden disolver nuevamente dejando caer unos pocos microlitros de alcohol de 95% en ellos. Nota 2: lotes de agar pueden tener diferentes propiedades gelificantes. Las placas de gel seco deben ser firme al tacto y lo suficientemente resistente que se puede quitar un círculo limpio, intacto de agar cuando use la broca de corcho para crear el orificio de alimentación (véase arriba).</li>
	<li>Configuración de las larvas en las placas de ensayo. Use presión mecánica a la curva de la punta de un microspatula de plástico y sumerja la boquilla en la pasta de levadura para proporcionar "adhesivo" para recoger las larvas. Recoger larvas de primer estadio individualmente y colocarlos sobre la placa de agar cerca el montón de comida. Preparar al menos cinco platos repetidos de 10 larvas de ambos experimental y control genotipos. Una vez completado, tapa y etiqueta cada plato y las placas (lado de la tapa hacia arriba) en un espacio oscuro a temperatura ambiente (en nuestro laboratorio es 22 ° C).</li>
</ol>3. monitoreo de las placas de ensayo
<ol><li>Examinar las placas diariamente bajo un microscopio de disección y anote el número de larvas sobre la comida o en la superficie del agar. Tenga en cuenta cualquier visibles larvas muertas o moribundas. Tenga en cuenta cuando, y si el hacer un túnel en el sustrato de agar se considera medida larvas en tercer estadio larvario. Tenga en cuenta las fechas en que pupas comienzan a formar y note cualquier anormalidad pupal. Continúe observaciones diarias todas las larvas han muerto o empupado.</li>
	<li>Retire con cuidado la pupas de la placa con un doblado burlas aguja y transferencia a un plato de uvas. Si lo desea, continuar la vigilancia pupas para determinar cuántos eclose como adultos.</li>
</ol>4. preparar ensayo de placas para la proyección de imagen
<ol><li>Cuidadosamente retire y deseche todos los alimentos de levadura desde el pozo central de cada plato.</li>
	<li>Suavemente inunde cada placa con agua del grifo y usar pincel de un artista suave para frotar cuidadosamente los desechos que ha sido seguido en la superficie del agar. Cambie el agua varias veces y seguir un cepillado suave, hasta que cada plato esté completamente limpia. Dar las placas de un enjuague final con agua desionizada, les tapa y dejar a temperatura ambiente durante la noche para secar. Nota: El hacer un túnel en el agar es más intenso alrededor del montón de la comida (ver figura 2). Como resultado, el borde del agujero de alimentos generalmente se expande más allá de la inicial 1,5 cm. de diámetro. Además, la fragilidad del agar trabajado en esta región puede causar pequeños pedazos de agar tunelizado a perderse de la circunferencia del agujero durante la limpieza. Aumento de la concentración de agar gel podría ayudar con estos problemas, pero las correcciones son posibles durante los pasos de cuantificación de imagen J (véase abajo).</li>
</ol>5. cuantificación de túnel
<ol><li>Las placas de la imagen. Preparar una imagen de cada placa tomada contra un fondo negro con el fin de mostrar los túneles en el agar como líneas blancas brillantes. Nota: Utilizamos un sistema comúnmente utilizado para geles de DNA para este paso de la imagen (véase tabla de materiales y reactivos). Alternativa capaz de generar archivos tiff, como cámaras digitales o cámaras de teléfono celular de sistemas de imágenes podría ajustarse para producir imágenes adecuadas.</li>
	<li>Utilizar el programa de dominio público NIH Image J para cuantificar tuneladoras larvarios. Descargar el programa desde http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Para más información sobre el programa visite http://imagej.nih.gov/ij/docs/intro.html. Nota: Otros sistemas de proyección de imagen pueden utilizarse para cuantificar el hacer un túnel. Las siguientes instrucciones se aplican a J. imagen de NIH</li>
	<li>Después de abrir una tiff archivo de imagen de una placa de efecto túnel, utilice la herramienta Óvalo para definir un área de cuantificación que representa la superficie del agar todo aflora el borde plástico de la placa.</li>
	<li>Aplicar el umbral automático para producir una imagen inversa de la placa, con los túneles que muestran líneas negras. Utilice el selector de Color y las herramientas de pincel blanco negro áreas que representan daños para el agar en lugar de túneles.</li>
	<li>En el menú Analyze , seleccione escala conjunto | Haga clic para quitar la escala y luego en la ventana establecer mediciones (también bajo análisis), área y límite de umbral.</li>
	<li>Presione Cntrl + la tecla M para mostrar la zona negra (túneles) en píxeles.</li>
	<li>Copiar y pegar el valor en píxeles para cada placa está en un programa de hoja de cálculo (como Excel) que permita el análisis cuantitativo.</li>
	<li>El agujero central se amplía generalmente debido a la intensa el hacer un túnel en esta región. Para cuantificar la falta el hacer un túnel, desmarque "Límite umbral" y utilice la herramienta varita mágica para definir el agujero central. Presione Control + tecla de M para obtener el valor del píxel de esta zona. Restar este valor el valor del píxel de un agujero de 1,5 cm y añadir la diferencia al túnel valor obtenido en el paso 5.6.</li>
	<li>Para algunos platos, el agujero central puede faltar un trozo de agar tunelizado que incluye una región de agar untunneled adyacente al agujero. Cuando la cuantificación el agujero central para el uso de estas placas el selector de Color y la pintura del cepillo herramientas para agregar una barra negra en toda la región que falta definir la región tunelizada y excluir el área no tunelizado de cuantificación. Nota 1: Si las larvas experimentales realizan cualquier túnel, esta cuantificación permite cálculo de media túnel valores para sistemas de placas y comparación estadística de control y experimental.</li>
</ol>

<ol><li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+responses+to+oxygen+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Conserved responses to oxygen deprivation.</a> J. Clin. Invest. 107 (6), 671-673 (2001).</li>
<li>Lavista-Llanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://mcb.asm.org/content/22/19/6842.full">Control of the hypoxic response in D. melanogaster by the basic helix-loop-helix pas protein Similar.</a> Mol. Cell. Biol. 22 (19), 6842-6853 (2002).</li>
<li>Reiling, J. H., Hafen, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC534649/">The hypoxia-induced paralogs Scylla and Charybdis inhibit growth by down-regulating S6K activity upstream of Tsc in D. melanogaster.</a> Genes Dev. 18 (23), 2879-2892 (2004).</li>
<li>Gorr, T. A., Gassmann, M., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+and+responding+to+hypoxia+via+Hif+in+model+invertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sensing and responding to hypoxia via Hif in model invertebrates.</a> J. Insect Physiol. 52 (4), 349-364 (2006).</li>
<li>Romero, N. M., Dekanty, A., Wappner, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17998052">Cellular and developmental adaptations to hypoxia: A D. melanogaster perspective.</a> Meth. Enzymol. 435, 123-144 (2007).</li>
<li>Dijkers, P. F., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+a+hypoxia-induced%2C+nitric+oxide-mediated+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.Cell%22%5BJournal%5D)">Dissection of a hypoxia-induced, nitric oxide-mediated signaling cascade.</a> Mol. Biol.Cell. 20 (18), 4083-4090 (2009).</li>
<li>Zhou, F., Qiang, K. M., Beckingham, K. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4975476/">Failure to burrow and tunnel reveals roles for jim lovell in the growth and endoreplication of the D. melanogaster larval tracheae.</a> PLOS ONE. 11, e0160233(2016).</li>
<li>Wingrove, J. A., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2754235/">Nitric oxide contributes to behavioral, cellular, and developmental responses to low oxygen in D. melanogaster.</a> Cell. 98 (1), 105-114 (1999).</li>
<li>Zhang, L., Ward, R. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19818339">Uninflatable encodes a novel ectodermal apical surface protein required for tracheal inflation in D. melanogaster.</a> Dev. Biol. 336 (2), 201-212 (2009).</li>
<li>Langlais, K. K., Stewart, J. A., Morton, D. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15159437">Preliminary characterization of two atypical soluble guanylyl cyclases in the central and peripheral nervous system of D. melanogaster melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 207 (13), 2323-2338 (2004).</li>
<li>Morton, D. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3127060/">Behavioral responses to hypoxia and hyperoxia in D. melanogaster larvae.</a> Fly. 5 (2), 119-125 (2011).</li>
<li>Brand, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Wieschaus, E., Nusslein-Volhard, C. Looking at embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWieschaus%2C+E+%22Drosophila%3A+a+practical+approach%22">Drosophila: a practical approach</a>. Roberts, D. B. , IRL Press. Oxford and Washington DC. 199-227 (1986).</li>
<li>Callier, V., Shingleton, A. W., Brent, C. S., Ghosh, S. M., Kim, J., Harrison, J. F. <a target="_blank" href="http://jeb.biologists.org/content/216/23/4334">The role of reduced oxygen in the developmental physiology of growth and metamorphosis initiation in D. melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 216 (23), 4334-4340 (2013).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23382692">Hif- and non-Hif-regulated hypoxic responses require the estrogen-related receptor in D. melanogaster.</a> PLoS genetics. 9 (1), e1003230(2013).</li>
<li>Grifoni, D., Sallazzo, M., Fontana, E., Froldi, F., Pession, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+strategies+of+oxygen+supply+in+Drosophila+malignancies+identify+tracheogenesis+as+a+novel+cancer+hallmark%5BTitle%5D)+AND+%22Scient.+Rep%22%5BJournal%5D)">Multiple strategies of oxygen supply in Drosophila malignancies identify tracheogenesis as a novel cancer hallmark.</a> Scient. Rep. 5 (9061), (2015).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Hemos presentado aquí un ensayo simple diseñado para detectar la hipoxia tisular en las larvas de D. melanogaster . Diagnóstico se basa en madriguera disminución en montones de alimentos en los primeros años de vida larvaria y la ausencia de sustrato el hacer un túnel a finales de la vida larvaria. Hacinamiento larval puede causar la migración de una fuente de alimento y por lo tanto un aspecto fundamental del análisis es que un pequeño número de larvas se analizan en presencia de un gran exceso de comida. Inclusión del benzoato fungicida de hidróxido metílico-p (Nipagen) en las placas de agar también es esencial para prevenir el crecimiento de moho durante el ensayo.
Encontramos que las placas de agar pueden ser una fuente de variabilidad en el ensayo. Normalmente, las larvas del mismo genotipo, de lotes diferentes de los padres, o de diferentes colecciones de larvas, muestran variación relativamente limitado en su comportamiento en el ensayo. En contraste, las placas de agar en días diferentes o con diferentes lotes de agar pueden producir diferencias en la construcción de túneles. Una estipulación es por lo tanto ese control y larvas experimentales todos analizarse usando placas de agar de la misma preparación de lote. Agar de diferentes fabricantes o incluso los envíos desde la misma fabricación pueden variar en su fuerza gelificante, y así que puede ser necesario ajustar la concentración de agar hacia arriba desde el 2,2% utilizado aquí para lograr un gel óptimo. Hemos encontrado que las larvas de tipo salvaje pueden fácilmente madriguera a través de geles de agarosa 3%.
Para demostrar el valor de este ensayo, hemos utilizado para investigar el potencial hipoxia tisular en las larvas con la función suprimida de uninflatable en las tráqueas. Nuestros resultados proporcionan apoyo para la hipótesis de que la pérdida de traqueal expresión de este gen puede producir hipoxia: btl-Gal4 > UAS -uif ARNi larvas mostraron falta de madriguera en alimento y ausencia total de sustrato túnel durante el tercer instar. En nuestros estudios anteriores de otros genotipos, observamos que la pérdida inducida por hipoxia de madriguera de alimentos no es tan completa como la pérdida de sustrato el hacer un túnel y el btl-Gal4 > UAS -uif ARNi larvas aquí estudiaron se comportó de manera similar. Por lo tanto, el componente fallido túnel de este ensayo proporciona la indicación más fuerte de la hipoxia.
Aunque el btl-Gal4 > IUf ARNi larvas mostraron rasgos de comportamiento diagnóstico de hipoxia, el corte(ue)-Gal4 > UAS -uif ARNi no exhibieron estas anormalidades. El btl y el corte(ue) Gal4 controladores se expresan en las diferentes etapas y en diferentes patrones, dentro de las tráqueas larvas. Btl-Gal4 driver se expresa a través del sistema traqueal a partir de su desarrollo en la embriogénesis y continuando a través de la vida larvaria. En contraste, la expresión de Gal4 de la corte(ue)-Gal4 driver sólo comienza en el final de la vida embrionaria, después de la morfogénesis de las tráqueas y se limita a las secciones extremas posteriores de los troncos dorsales, los vasos longitudinales principales de el sistema traqueal. caída de la UIF con esta línea de Gal4 no puede reducir por lo tanto expresión uif suficiente antelación o ampliamente suficiente para producir cierto nivel de umbral de hipoxia necesaria para desencadenar los comportamientos medidos en este ensayo.
Un estudio previo encontró que larvas de tercer estadio expuestas a bajos niveles de oxígeno (10%) muestran disminución de crecimiento y retrasa la aparición de pupariación 14. Btl-Gal4 > UAS -uif ARNi larvas estudiadas aquí progresaban al tercer instar, pero los efectos sobre sus tasas de crecimiento y pupación fueron más pronunciados: eran considerablemente más pequeños que los controles con muy poco tejido graso bajo la epidermis (figura 3) y sólo una fracción menor (~ 10%) trataron de pupariación. Estas diferencias sugieren el btl-Gal4 > UAS -uif ARNi larvas experimentaron un mayor grado de hipoxia, debido a caída de uif en las tráqueas estuvo presente a lo largo de toda su vida larval, o porque produce más privación de oxígeno severa en el tercer estadio larvario. Cómo pérdida de la función de la uif en las tráqueas podría prevenir el transporte del oxígeno es claro en este punto. Las tráqueas de los btl-Gal4 > UAS -uif ARNi larvas eran fácilmente visibles a través de la cutícula (figura 3), una indicación que contiene aire y no fueron dañados al punto de que la entrada del fluido comprometida función. Por lo tanto es formalmente posible que el daño traqueal creado por pérdida de la función de la uif no provocan hipoxia pero algo algún otro defecto que inhibe el hacer un túnel. Para los genotipos estudiados previamente, se determinó que no túnel se asocia con niveles elevados de LDH mRNA7, el indicador canónico de la glucólisis e hipoxia en finales de tercer instar de las larvas 15. Así, la confirmación final de hipoxia para btl-Gal4 > UAS -uif ARNi larvas (y en las larvas de examinar en el futuro uso de este ensayo) supone la RT-PCR para evaluar los niveles de mRNA LDH o el uso de un indicador comercialmente disponible para medir niveles de oxígeno intracelular (por ejemplo véase 16).

El conjunto sofisticado de herramientas genéticas moleculares disponibles en D. melanogaster hacerla un organismo valioso para el estudio de los procesos biológicos evolutivamente conservados. Claves respuestas moleculares a la disponibilidad de oxígeno han demostrado ser conservado a través de la evolución y estudios previos de D. melanogaster han generado conocimientos en los componentes universales de estos señalización vías 1,2, 3,4,5,6.
Como parte de un estudio orientado en función de la neurona sensorial en larvas de D. melanogaster de disección, se identificaron dos respuestas conductuales que resultó ser activada por la hipoxia tisular en los niveles de oxígeno normales 7. Uno de ellos, falta de madriguera en el alimento, altamente se relaciona con la respuesta a bajos niveles de oxígeno por Wingrove y O'Farrell 8. El segundo comportamiento, falta de túnel en un sustrato suave durante el último instar tercer vagando por fase, había no ha identificado previamente como relacionadas con la hipoxia. Se determinó que también exponer las larvas errantes tipo salvaje a niveles bajos de oxígeno inhibe sustrato túnel 7, estableciendo que tanto estas conductas se originan hipoxia - ya sea inducida por daño de tejido o por niveles de consumo de oxígeno baja. Aquí describimos un análisis que hemos desarrollado para cuantificar estos dos comportamientos inducidos por la hipoxia, que se inicia con observaciones inmediatamente después de la eclosión larval.
Las respuestas hipóxicas en las etapas larvales tempranas no han sido examinadas anteriormente y por lo tanto realizar un análisis a lo largo de la vida larval es un valioso componente de nuestro análisis. La mayoría de las manifestaciones obvias de la hipoxia – desarrollo lento, crecimiento deficiente y lentitud del aparato locomotor – se superponen con fenotipos larvas producidos por muchas mutaciones. Pero hemos encontrado que solamente tercer instar larvas con hipoxia muestran un fracaso al túnel 7. Así, se determinó que las larvas incluso más había comprometida en términos de crecimiento y locomoción de nuestras larvas hipóxicas, todavía realiza algunos túneles, mientras que las larvas hipóxicas no habían tunelizado 7. Otro elemento valioso de este ensayo es así que proporciona una forma de establecer cuando la hipoxia es la fuente de un conjunto particular de fenotipos pleiotrópicos, a diferencia de algunos otros estrés o mal funcionamiento metabólico. Como una demostración de la prueba, aquí Describimos su uso en la caracterización de las respuestas de las larvas con expresión reducida traqueal de uninflatable, un gen que funciona en el de larvas airways 9.
Prevemos que este ensayo sea de valor para los investigadores que participan en la caracterización de fenotipos larvas que incluyen crecimiento pobre y lento comportamiento. Como resultado, nuevos genes que influyen en la distribución, uso o respuesta a, oxígeno por todo el cuerpo podía ser identificado. Además, incorporar a este análisis un mutante detección protocolo proporcionaría una ruta directa a la identificación de mutaciones que producen hipoxia. Este análisis también será valiosa en el análisis de los circuitos que desencadena las conductas innatas inducida por la hipoxia que se describe aquí. Análisis de la red de los nervios de este tipo es un foco de mucha investigación actual y el sistema nervioso simple de la larva de D. melanogaster es un sistema valioso para disección de comportamientos automatizados. Ya se han identificado neuronas sensoriales implicados en la percepción del oxígeno larvas, proporcionando un primer paso para definir el circuito completo de las respuestas inducidas por la hipoxia 10,11. Usando nuestro análisis en combinación con caída neuronal selectivo mediante el sistema de GAL4-UAS12 es una vía clara para delinear más componentes de la red neuronal.

<table><tbody><tr><td><REACTIVOS fuertes></levadura deshidratada fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr>;<tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jugo de uva concentrado congelado</td><td>Welch's</td><td></td><td>&nbsp; Disponible en la mayoría de los grandes supermercados</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>agar Drosophila</td><td>Productos de Bioresearch Apex</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>Metil-para-hidroxibenzoato</td><td>Productos de Bioresearch</td><td>Apex 20-658</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>EQUIPO</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml vasos de precipitados</td><td></td><td></td> de polipropileno<td></td></tr><tr><td>Placas de Petri desechables de 6,0 cm</td><td>Falcon</td><td>08757100B</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de plástico desechables de 10 cm</td><td>E+K Scientific</td><td>EK-24104</td><td></td></tr><tr><td>Microespátulas de plástico</td><td>Corning Incorporated</td><td>3012</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de burla doblada</td><td>Nasco</td><td>S08848MH</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td> de disección <td>Cualquier microscopio con 10-30X magnificación</td></tr></tbody></table>

un ensayo de tecolote/túnel para la detección de la hipoxia en larvas de drosophila melanogaster

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

Privación de oxígeno en los animales puede resultar de la exposición a niveles bajos de oxígeno atmosférico o del daño del tejido interno que interfiere con la distribución de oxígeno. También es posible que el comportamiento aberrante del sensor de oxígeno de las neuronas podría inducir hipoxia-como comportamiento en presencia de niveles normales de oxígeno. En D. melanogaster, desarrollo en niveles bajos de oxígeno resulta en inhibición de crecimiento y comportamiento lento durante las fases larvales. Sin embargo, estas manifestaciones establecidas del déficit de oxígeno se traslapan considerablemente con los fenotipos de muchas mutaciones que regulan crecimiento, respuestas de estrés o locomoción. Como resultado, actualmente no hay ensayo para identificar i) celular hipoxia inducida por una mutación o ii) hipoxia-como comportamiento al inducido por el comportamiento neuronal anormal.
Recientemente hemos identificado dos comportamientos distintivos en larvas de D. melanogaster que ocurren a niveles normales de oxígeno en respuesta a detección interna de hipoxia. En primer lugar, en todas las etapas, dichas larvas evitar excavar en el alimento, a menudo alejarse lejos de una fuente de alimento. En segundo lugar, el hacer un túnel en un sustrato suave, que normalmente ocurre durante la tercera etapa de estadio errante es totalmente suprimido si las larvas son hipóxicas. El ensayo descrito aquí está diseñado para detectar y cuantificar estas conductas y así proporcionar una manera para detectar hipoxia inducida por daño interno en lugar de bajo nivel de oxígeno externa. Las placas de ensayo con un sustrato de agar y un tapón central de pasta de levadura son utilizadas para apoyar los animales a través de la vida larvaria. La posición y el estado de las larvas se realiza un seguimiento diario, proceden de primer a tercer instar. La magnitud del túnel en el sustrato de agar durante la fase nómada es cuantificada después de la pupación con ImageJ NIH. El ensayo será de valor en la determinación de cuando la hipoxia es un componente de un fenotipo mutante y así proporcionar la penetración en posibles sitios de acción del gen en cuestión.

Como una demostración del valor de este ensayo hemos utilizado para investigar la hipoxia potencial en larvas con deterioro de la función del gen uninflatable (uif) en las tráqueas. UIF codifica una gran proteína transmembrana que se expresa fuertemente en la superficie apical de las células traqueales larvales. Previamente se observaron mutantes de uif a exhibir comportamiento aberrante que puede indicar hipoxia tisular debido a mal funcionamiento traqueal 9. Específicamente nos suprime expresión de uif en la tráquea de larvas mediante el sistema de Gal4-UAS. Gal4 dos líneas fueron utilizadas: i) sin aliento (btl)-Gal4, que se expresa fuertemente en las tráqueas desde el comienzo de su desarrollo embrionario y la ii) corte(ue)-Gal4, que comienza la expresión en una pequeña región posterior de las tráqueas principales tronco dorsal al final de la embriogénesis y continúa fuerte expresión en esta región a lo largo de la vida larval 7. Un UAS -uif línea de RNAi fue obtenida del centro de investigación de Drosophila de Viena (VDRC ID #1050).
Como se describe en el protocolo anterior, cinco replicar placas de recién nacido primer instar larvas se establecieron para cada uno de los cuatro cruces como sigue.
Experimento 1 1) control 1 - corte(ue)-Gal4 x Cantón-S (+) 2) Experimental 1 - corte(ue)-Gal4 x UAS-uif ARNi
Experimento 2 3) control 2 - btl-Gal4 x Cantón-S (+) Experimental 4) 2 - btl-Gal4 x UAS-uif ARNi
El comportamiento de la corte(ue)-Gal4 &gt; UAS -uif ARNi larvas del experimento 1 fue comparable a la del control corte(ue)-Gal4 &gt; + animales en madrigueras, túneles y supervivencia a la pupación, (figura 1 y figura 2). En cambio, abajo-regulación de la expresión de uif a lo largo de todo el sistema traqueal desde temprano en el desarrollo (experimento 2) produjo respuestas marcadamente diferentes. Btl-Gal4 &gt; UAS -uif ARNi larvas muestran ambas manifestaciones conductuales de la hipoxia tisular, reducción de alimento madriguera y una ausencia total de sustrato túnel más adelante en vida larval (figura 1 y Figura 2 de ). Las larvas experimentales eran también perceptiblemente más pequeño, más delgado y más lenta que los controles (figura 3) y mostraron una alta tasa de muerte durante el curso del ensayo. Como hemos comentado anteriormente, crecimiento reducido, lentitud y la muerte se conocen los síntomas de la hipoxia larval. Además, la mayoría de las larvas experimentales no trate de pupación y permanecía como tercer instar larvas largo después larvas de control han empupado. Algunas larvas sobrevivieron más de 15 días antes de morir finalmente sin pupating (figura 1A). Algunas de las larvas experimentales a pupar pero en todos los casos se formaron pupas anormales que no generaron a adultos viables.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig1.jpg"> Figura 1. Cuantificación de madriguera y larval desarrollo de alimentos. (A) porcentaje de larvas vivas fuera de los montones de comida para los cuatro genotipos estudiados aquí. Se muestran los promedios para las placas de cinco ensayo utilizadas para cada genotipo. Día 3 después de la eclosión, ~ 70% de los btl-Gal4 &gt; UAS uif ARNi larvas fueron fuera de la comida, mientras que las larvas no fueron detectadas fuera de la comida o en la superficie del agar para los otros tres genotipos. Btl-Gal4 &gt; larvas de ARNi de uif UAS mueren lentamente entre los días 4-20, con el ~ 15% de ellos aún con vida 15 días después de la eclosión. La flecha negra en el eje x aquí y en (B) indica el día que todas las larvas de los tres genotipos han empupado. (B) porcentaje de larvas muertas visibles fuera de la comida para los cuatro genotipos. Se muestran los promedios para las placas de cinco ensayo para cada genotipo. Muerto btl-Gal4 &gt; larvas UAS uif ARNi se acumulan con el tiempo muere la mayoría fuera de la comida. Los genotipos de todos sobreviven a la pupación (C) porcentaje de supervivencia para pupación de los cuatro genotipos estudiados. Se muestran los promedios para las placas de cinco ensayo para cada genotipo. No hay pupas normales de btl-Gal4 &gt; genotipo de ARNi de uif UAS fueron producidos. Barras de error a través de la figura representan el SEMs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig2.jpg"> Figura 2. Cuantificación de tuneladoras larvarios. (A) ejemplos de las placas de ensayo para todos los cuatro genotipos estudiaron después de la preparación para hacer un túnel cuantificación. Nota completa ausencia de túneles para btl-Gal4 &gt; larvas UAS uif ARNi. Las placas de ensayo son las placas de Petri de 10 cm. (B) el hacer un túnel cuantificación deriva de Image J para los cuatro genotipos. Promedio de valores de los píxeles para las placas de cinco ensayo para cada genotipo. Ningún túnel observó para btl-Gal4 &gt; larvas UAS uif ARNi. Barras de error = SEMs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig3.jpg"> Figura 3. Comparación de btl-Gal4 &gt; UAS uif ARNi y btl-Gal4 &gt; + larvas Larvas de edad similar (día 6 después de la eclosión) para btl-Gal4 &gt; UAS uif RNAi (A) y btl-Gal4 &gt; + (B) genotipos. Flechas rojas indican las tráqueas del tronco dorsal. Ambas larvas reflejadas en el aumento de la misma. Barra de escala = 0,5 mm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

El protocolo describe un análisis simple para identificar larvas de Drosophila melanogaster que experimentan hipoxia bajo niveles normales de oxígeno atmosférico. Este protocolo permite larvas hipóxicas debe distinguirse de otros mutantes que muestran fenotipos superpuestos como lentitud o crecimiento lento.

Un ensayo de tecolote/túnel para la detección de la hipoxia en larvas de Drosophila melanogaster

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

El objetivo general de este ensayo es identificar las larvas de Drosophila que sufren de hipoxia tisular a pesar de estar en niveles normales de oxígeno. En Drosophila hay muchas mutaciones que producen un crecimiento lento y pobre de las larvas y cierta lentitud larvaria. Este ensayo identifica dentro de esa clase de larvas, aquellas que sufren de hipoxia tisular.En última instancia, este ensayo ayudará a identificar más mutaciones que producen deficiencia de oxígeno en los tejidos a través de diversos procesos fisiológicos. La idea de este ensayo surgió de la observación de que las larvas con las vías respiratorias o la tráquea dañadas mostraban dos comportamientos extraños. Estos comportamientos anormales son la incapacidad de excavar en la comida durante la vida temprana de las larvas y la incapacidad de hacer un túnel hacia un sustrato más blando durante la fase de deambulación.Establezca los cruces genéticos de control y experimentales en platos de puesta de huevos como se describe en el protocolo de texto. Mantenga las moscas en la oscuridad durante al menos dos días antes de comenzar las recolecciones de huevos cronometradas. Para la recolección de huevos cronometrada, transfiera a los adultos a nuevos platos de agar uva decorados con una mancha fresca de pasta de levadura temprano en el día y permita que los adultos pongan huevos en los platos durante cuatro horas.Después de cuatro horas, transfiera a los adultos a platos de agar uva fresca. A continuación, incube las placas de recolección de cuatro horas durante la noche a 25 grados centígrados. A la tarde siguiente, la mayoría de las larvas habrán eclosionado.Planee tener al menos 50 para cada grupo experimental. Para una sola ejecución del ensayo, prepare al menos cinco placas de ensayo por grupo experimental. Añadir 16 gramos de agar mosca y 700 mililitros de agua desionizada por calentamiento.Prepare un Nipagen de 17,5 mililitros en etanol al 95%. Caliente la solución de agar hasta que se disuelva casi por completo. Luego agregue la solución de Nipagen a la solución de agar y caliente hasta que el agar se disuelva por completo.Enfríe brevemente la solución de agar, luego cargue placas de 10 centímetros con 15 mililitros de la solución de agar. Una vez que el agar se gelifique, coloque tapas en los platos y déjelos secar a temperatura ambiente durante unas horas o toda la noche. El agar curado debe ser firme al tacto y resistir el desmoronamiento cuando se cortan pedazos.Una vez que el agar se haya curado, use una tabla de corcho de 1,5 centímetros para hacer un agujero central en el gel de agar en cada placa. A continuación, rellene los agujeros cuidadosamente con pasta de levadura fresca. Para transferir las larvas a la placa de ensayo, haga una herramienta simple.Dobla una curva en la punta de una microespátula de plástico y sumerge la punta en pasta de levadura para hacerla adhesiva a las larvas. Ahora recoja las primeras larvas del primer estadio individualmente y colóquelas en la placa de agar cerca del montículo de comida. Para cada grupo experimental, prepare al menos cinco platos, cada uno con 10 larvas.Para garantizar la reproducibilidad entre las repeticiones de ensayo, es fundamental que solo se coloquen 10 larvas en cada placa de ensayo. Asegúrese de revisar cuidadosamente la placa de ensayo para determinar que se transfiere una sola larva cada vez que entrega una larva con la punta de la microespátula. Una vez que esté cargado un plato, etiquételo, cúbralo y luego colóquelo en la oscuridad con la tapa hacia arriba a temperatura ambiente.Examine cada placa diariamente hasta que todas las larvas hayan muerto o pupado. A continuación, se muestran ejemplos de placas para una cepa de tipo silvestre durante el segundo hasta el octavo día del ensayo. En el segundo día, las larvas se entierran en la comida y no se produce ningún túnel.La excavación de túneles comienza el tercer día y alcanza un máximo entre los días cinco y ocho, cuando las larvas dejan de deambular y pupan en sus túneles. Transfiera con cuidado las pupas con una aguja de burla doblada a un plato de uva y, si lo desea, cuente cuántas pupas contienen. Tome nota de la formación de pupas y evalúe las pupas en busca de anomalías.Para obtener imágenes de los túneles dentro de la placa de ensayo, primero retire con cuidado y deseche toda la comida de levadura del pocillo central de cada placa. Luego, inunda suavemente cada plato con agua del grifo y usa un pincel suave para frotar cuidadosamente cualquier residuo que se haya arrastrado sobre la superficie del agar. Algunos pedazos de agar pueden desmoronarse donde la tunelización es más intensa.Esto se puede corregir más adelante. Continúe reemplazando el agua varias veces y cepille suavemente los desechos hasta que la placa esté completamente limpia. A continuación, enjuague por última vez la placa con agua desionizada, cúbrala y déjela secar a temperatura ambiente durante la noche.Es importante utilizar un suave chorro de agua y unas pinceladas suaves para limpiar las placas de agar para que no se rompan ni dañen partes del gel de agar. Al día siguiente, prepare una imagen de archivo tiff de la placa con un fondo negro para mostrar los túneles como líneas blancas brillantes. Los sistemas de documentación en gel funcionan bien para este paso.A continuación, cuantifique el efecto túnel en la imagen utilizando la Imagen J con la herramienta Óvalo, defina el gel de agar hasta, pero sin incluir, el borde de plástico de la placa de Petri. A continuación, aplique un umbral automático para producir una imagen inversa de la placa de modo que los túneles aparezcan como líneas negras. Para corregir las áreas oscuras que no contienen túneles, utilice las herramientas Selector de color y Pincel para blanquear esas regiones.A continuación, en el menú desplegable Analizar, seleccione Establecer escala y haga clic para eliminar la escala. A continuación, vaya a la ventana Establecer medidas en Analizar y marque Área y Límite hasta umbral. Ahora presione la tecla Control con la tecla M para obtener una medida del área negra en la imagen en la unidad de píxeles que representa el área tunelizada.Para cuantificar la tunelización perdida por la erosión del agar alrededor del agujero central, desmarque Limitar al umbral. Utilice la herramienta Varita para definir el agujero central y pulse Control más M para medir su valor en píxeles. Reste de este valor el valor de píxel de un agujero de 1,5 centímetros de diámetro.Agregue la diferencia al valor de píxel obtenido anteriormente para obtener el valor total de píxel de tunelización. En el caso de las placas en las que el agar faltante se extiende más allá del anillo central de tunelización, es necesario un paso adicional para evitar que la cuantificación incluya áreas fuera de la región central. Utilice las herramientas Selector de color y Pincel para agregar una barra negra, como se muestra para limitar el área cuantificada.El ensayo descrito se utilizó para investigar la posible hipoxia en larvas con deterioro de la función del gen no inflable en la tráquea. El gen fue suprimido por ARNi a través de Gal4 UAS. Se utilizaron dos líneas Gal4.Breathless Gal4, que se expresa a través de todo el desarrollo en todo el sistema traqueal. O cut(ue)Gal4, que se expresa fuertemente en una pequeña sección traqueal durante la vida de las larvas. Las larvas de control contenían una de las líneas Gal4, pero no ARNi no inflable.Las larvas con cut(ue)Gal4 que impulsaban ARNi no inflable fueron indistinguibles de los controles durante todo el desarrollo, tanto en términos de crecimiento como de comportamiento. Sin embargo, la fuerte supresión de ARNi no inflable a lo largo de las tráqueas con blt-Gal4 resultó en un fracaso en la excavación en la fase de alimentación y produjo una alta tasa de mortalidad. Estas larvas también mostraron una ausencia completa de túneles durante la fase de deambulación.Además, las larvas experimentales de Gal4 eran más pequeñas, más delgadas y más lentas que los controles y permanecieron como larvas mucho después de que todos los demás grupos puparan. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar las larvas de Drosophila para detectar hipoxia tisular mediante el monitoreo de la medida en que se entierran en sus montículos de alimento o hacen un túnel en un sustrato blando. La ausencia total de tunelización es un fuerte indicador de hipoxia tisular.

a-burrowingtunneling-assay-for-detection-hypoxia-drosophila

Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

Drosophila melanogaster es un sistema de genética y de comportamiento modelo manejable que se ha utilizado para entender las bases moleculares y celulares de muchos procesos biológicos importantes para más de un siglo 1. Drosophila ha sido bien aprovechado para hacerse una idea de la base genética del comportamiento de las moscas.

Métodos de ensayo a Drosophila Comportamiento

Este video muestra un método para probar la hipoxia en larvas de Drosophila evaluando sus habilidades de excavación y tunelización. Con esta técnica, los investigadores pueden distinguir las larvas que experimentan privación de oxígeno de las que tienen déficits de desarrollo. El protocolo de ejemplo muestra la configuración de este ensayo.

Drosophila Ensayo de excavación y tunelización: un método para evaluar la hipoxia tisular en larvas de mosca

Este video describe un método simple para cuantificar la locomoción de la mosca y muestra el ensayo de escalada realizado. El ensayo de escalada con mosca es una prueba general de la función motora que se basa en una respuesta geotaxis negativa.

Ensayo de escalada con mosca: un método para probar la locomoción general en Drosophila melanogaster

Source:Siddarth Gunnala1, Nafisa M. Jadavji2,3,41Department of Biomedical Sciences, Midwestern University, Glendale, AZ, USA2Division of Integrative and Molecular Physiology, Department of Biomedical Sciences, Southern University of Illinois, Carbondale, IL, USA3Department of Child Health, College of Medicine Phoenix, University of Arizona, Phoenix, AZ, USA4Department of Neuroscience, Carleton University, Ottawa, ON, CanadaThis video demonstrates hypoxia-induced climbing behavior in Drosophila...

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Análisis conductual de la disfunción locomotora en Drosophila melanogaster como lectura de la neurotoxicidad

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