Name: Novela de fotoacústica de microscopía y tomografía de coherencia óptica Dual-modalidad coriorretinal la proyección de imagen en ojos de conejo vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprende a realizar imagen coriorretiniana no invasiva combinando microscopía fotoacústica y tomografía de coherencia óptica en conejos vivos. Este método permite visualizar vasos sanguíneos y analizar saturación de oxígeno.

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Este trabajo fue apoyado por el generoso apoyo de la 4K12EY022299 National Eye Institute (YMP), lucha para vista internacional retina investigación Fundación FFS GIA16002 (YMP), irrestricto apoyo departamental de investigación para prevenir la ceguera y la Universidad de Michigan Departamento de Oftalmología y Ciencias visuales. Este trabajo utilizó el centro Core visión investigación financiada por P30 EY007003 del Instituto Nacional del ojo.

Los conejos son que un departamento de agricultura de Estados Unidos (USDA) cubiertos de especies. Su uso en la investigación biomédica debe seguir normas estrictas. Todos los experimentos de conejo se realizaron conforme a la declaración de ARVO (Asociación para la investigación en visión y oftalmología) para el uso de animales en oftálmica y la investigación de la visión, después de la aprobación del Protocolo de animales de laboratorio por la Universidad Comisión de uso y cuidado de animales (UCUCA) de la Universidad de Michigan (protocolo PRO00006486, PI Yannis Paulus).
1. configuración del sistema
<ol><li>Microscopia de fotoacústica (PAM)<ol>
<li>Uso un oscilador paramétrico óptico (OPO) láser bombeado por un láser de estado sólido diodo-bombeado como fuente de luz de las especificaciones técnicas adecuadas de identificación selección, tales como tasa de repetición de pulso 1 kHz, ns pulso duración 3-6 y longitud de onda sintonizable 405-2600 nm.</li>
		<li>Reflejar el emanación haz del láser a 570 nm por dos espejos (M1 y M2), luego pase a través de un atenuador de placa media onda montado en un filtro de fase de rotación y por último foco, motorizado y colimar por un colimador de haz (figura 1). Optimizar el diseño del colimador de haz. Un ejemplo de configuración del colimador de haz incluye una lente de concentración L1 (longitud focal 250 mm), un pequeño agujero (diámetro de 50 μm) y una lente de colimación L2 (longitud focal 30 mm).</li>
		<li>Dividir el haz colimado por un divisor de viga (BS1) con un cociente de fractura de 90/10 (reflexión y transmisión). Registro la porción transmitida por un fotodiodo para el control de energía de láser de pulso a pulso. Sucesivamente desviar la porción reflejada por un espejo (M3) y un espejo dicroico (DM) y exploración de raster usando un galvanómetro bidimensional. El galvanómetro es un componente compartido con el dominio espectral (SD)-sistema de OCT (se describe a continuación).</li>
		<li>Entregar el rayo escaneado a través de un telescopio compuesto de una lente de la exploración (longitud focal 36 mm) y un lente oftálmico (OL, distancia focal 10 mm) y finalmente concentrarse en el fondo por la óptica del ojo de conejo.</li>
		<li>Seleccionar un transductor de ultrasonidos en forma de aguja con adecuadas especificaciones técnicas, por ejemplo, la frecuencia central 27 MHz, dos vías −6 dB ancho de banda 60%. Ponga en contacto con la conjuntiva fuera del eje visual central para capturar la señal fotoacústica emocionado.</li>
		<li>Amplificar la señal mediante un amplificador ultrasónico (por ejemplo, 57 dB de ganancia), filtrarla por un filtro de paso bajo (por ejemplo, frecuencia de corte 32 MHz) y digitalizar por un digitalizador de alta velocidad a una velocidad de muestreo de 200 MS/s.</li>
		<li>Lugar un medidor de potencia sobre el conejo de ojos y medir la energía de pulso de láser en la córnea del conejo para mantener abajo la seguridad ANSI límite 160 nJ a 570 nm38. Bloque de la viga para evitar sobreexposiciones de láser utilizando un obturador láser controlado desde Matlab a través de una electrónica de sincronización.</li>
		<li>Sincronizar el láser, el galvanómetro y el digitalizador a través de una tarjeta de adquisición (DAQ) de datos. Programa el software para sistema control y adquisición de datos en Matlab.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT)<ol>
<li>Adaptar el sistema de SD-OCT basado en un sistema disponible en el mercado mediante la adición de una lente oftálmica (OL) después de la lente de la exploración (SL) y una pieza de cristal de compensación de dispersión (DCG) en el brazo de referencia (figura 1). La modificación permite que el sistema OCT puede imagen el segmento posterior del ojo del conejo.</li>
		<li>Utilizar un zoom carcasa tubo para ajustar la longitud del brazo de referencia para su partido con la longitud del camino óptico del brazo de muestra. Usar un diafragma para controlar la intensidad de luz de referencia refleja de retro para su partido con la intensidad de la luz detrás-dispersada del fundus de conejo para lograr contraste de imagen máxima.</li>
		<li>Emplear una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) encapsulada en la cabeza de exploración para la visualización en tiempo real del fondo de conejo con una luz de iluminación diodo (LED) como fuente de iluminación externa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. alineación del sistema
<ol><li>Inicializar la posición del galvanómetro y alinear el sistema OCT ajustando los tornillos de la montura de fibra colimador y el cubo del beamsplitter. Nota: Los procedimientos paso a paso están disponibles en el manual del sistema OCT adquirido comercialmente y no se tratarán aquí. Este paso es principalmente asegurar la correcta alineación del colimador de la fibra, el brazo de referencia y la lente de la exploración para maximizar el rendimiento del sistema OCT.</li>
	<li>Ajustar la posición x, yy z del agujero de alfiler en el foco de la lente de concentración espacial filtrar el rayo láser y máximo transmitir energía de laser. Compruebe la altura del rayo láser antes y después el agujero usando una herramienta de medición de altura para asegurar que son lo mismo.</li>
	<li>Ajuste de la inclinación, descentrar y la posición z de la lente de colimación L2 para colimar el rayo filtrado. Asegúrese de que la viga tiene aproximadamente el mismo tamaño y la altura cuando la observa en el campo cercano y campo lejano.</li>
	<li>Co-axialmente combinar el láser de PAM y el haz de luz OCT ajuste la inclinación del espejo y la DM. Después de este paso, el PAM láser y la luz OCT deben ser totalmente coincidentes y regiones análisis sobre el fondo de ojo de conejo son los mismos.</li>
	<li>Ajustar la inclinación y descentrar de la lente OL a alinear correctamente en el trayecto óptico. Una vez hecho esto, el sistema de doble modalidad está listo para la proyección de imagen. Nota: Uno puede utilizar el método de auto colimación para lograrlo, es decir, comprobación de la luz reflejada atrás de la superficie de la lente OL para asegurarse de que se remonta a lo largo de la misma manera que la luz del incidente.</li>
</ol>3. preparación de conejo
<ol><li>Tomar un conejo blanco de Nueva Zelanda del Animalario y registro información individual, como el número de animales y peso corporal.</li>
	<li>Montaje de plataformas de conejo, como soporte del cuerpo y el soporte de la cabeza sobre la mesa óptica bajo el sistema de proyección de imagen. Poner una manta de agua circulando en el soporte del cuerpo y la temperatura del agua circulante a 38 ° C para ayudar a mantener la temperatura del cuerpo del conejo caliente para la duración del experimento y la recuperación.</li>
	<li>Registrar el pre-procedimiento signos vitales, incluyendo el estado general de animales, color de mucosas, frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria y temperatura corporal rectal. Anestesiar al conejo con una mezcla de ketamina (40 mg/kg) y xilacina (5 mg/kg) mediante inyección intramuscular (IM) y registrar el uso de la ketamina (sustancia controlada de lista III). Confirmar el nivel de anestesia comprobando su frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria y estado general.</li>
	<li>Dilatar a las pupilas de conejo utilizando una gota de tropicamida oftálmica 1% y fenilefrina clorhidrato 2.5% oftálmico.</li>
	<li>Use un espéculo para mantener los párpados fuera del camino y aplique una gota de lubricante para humedecer la córnea de ojo. Póngase una gota de tópica tetracaína 0,5% en el ojo antes del procedimiento de la proyección de imagen. Nota: Para más procedimientos o procedimientos con posibles molestias a los animales, dar el conejo una inyección subcutánea de meloxicam antes del experimento para garantizar el confort animal.</li>
</ol>4. proyección de imagen de SD-OCT
<ol><li>Transferir el conejo a la plataforma de proyección de imagen de una cámara fotográfica de fundus clínica y tomar 50 grados imágenes de fondo, rojo libre y autofluorescencia antes OCT sesión de imágenes. Esto ayuda a comprobar la transparencia óptica del ojo y reconocer la morfología de recipiente del fondo y monumentos, como el nervio óptico y la vasculatura retiniana rayo medular.</li>
	<li>Transferir el conejo a la plataforma del sistema OCT y ajustar su postura a la posición más o menos uno de los ojos bajo el OL. Iluminar los ojos con la luz del LED. Nota: Para facilitar la traducción clínica de la técnica, los ojos de conejo no se estabilizan utilizando otros métodos y la cabeza del conejo se acaba de poner en el soporte de la cabeza sin ninguna fijación.</li>
	<li>Abra el software de OCT y compruebe en primer lugar la imagen de la cámara CCD del fondo. Finalmente ajuste la altura y el ángulo de la cabeza ayuda si es necesario para asegurar la región de interés (ROIs), como los vasos de la coroides y los vasos retinianos, dentro del campo de visión (FOV) de la cámara. Nota: Si el conejo es bajo el nivel de una buena anestesia, una sesión de imágenes secuencial puede durar hasta 10 minutos sin la necesidad de volver a ajustar la cabeza del conejo.</li>
	<li>Trazar una línea recta para representar el OCT B-scan de interés y comenzar a explorar. Ajustar la longitud del brazo de referencia para visualizar la imagen de OCT y optimizar el factor de compensación de dispersión en el software de OCT para obtener imágenes más nítidas. Nota: Cuando ajuste la longitud del brazo de referencia, dos imágenes espejadas de OCT aparecerán uno tras otro. Se distinguen la imagen correcta en base a conocimiento previo de la anatomía del fondo.</li>
	<li>Establecer parámetros de adquisición de datos, como número de píxeles y los promedios y guardar imágenes.</li>
	<li>Observar la frecuencia respiratoria y frecuencia cardíaca del conejo para estimar el nivel de anestesia y animal confort. Para las sesiones largas, podría considerarse una dosis de un tercio de ketamina suplementaria o isoflurano inhalado con intubación endotraqueal, un V-gel o mascarilla para mantener el plano de anestesia cuando sea necesario.</li>
	<li>Enjuague la córnea del conejo con Lavaojos cada 2 min durante el experimento para evitar la deshidratación superficial corneal y córneo keratopathy epitelial punteada superficial. Monitor y registro de animales signos vitales cada 15 minutos.</li>
</ol>5. la proyección de imagen de PAM
<ol><li>Use gafas de seguridad de láser adecuado y encienda el láser de la OPO.</li>
	<li>Inicie el software de control de PAM, ajustar la longitud de onda del láser a uno de los picos de absorción de los cromóforos específicos (por ejemplo, 570 nm para la hemoglobina), inicializar la posición del galvanómetro y energía de laser del monitor antes de la córnea del conejo para que es por debajo del límite de seguridad ANSI.</li>
	<li>Monte el transductor ultrasónico en un escenario tridimensional (3D) traducción y coloque la punta del transductor en contacto con la conjuntiva de conejo hacia el fondo. Utilice una gota de lubricante del ojo para mejor pareja de la conjuntiva de punta y el conejo del transductor.</li>
	<li>Encender la luz de la iluminación LED y visualizar el fondo de conejo a través del software de Matlab.</li>
	<li>Conjunto el análisis ROI (vasos retinianos o vasos coroides), incluyendo el centro y el tamaño físico. Abra el obturador láser y ejecucion B-análisis de la viga. Por áspero alinear el transductor, uno debe ser capaz de ver fotoacústica detectado señal en el osciloscopio. Si no es así, ajuste ligeramente la posición del ojo para analizar una región diferente de la córnea o cambiar a otro ojo y repetir el proceso anterior.</li>
	<li>Observar la fotoacústica detectado señal en el osciloscopio y ajustar la posición del transductor para maximizar la intensidad de la señal a lo largo del entero B-scan. Nota: Debido a la anchura de la viga limitada, transductor ultrasónico generalmente tiene un pequeño campo visual41. Este paso determina la modulación de fondo de las imágenes de PAM finales. Desalineamiento conducirá a las imágenes de PAM con fondo heterogéneo y degradar mucho la calidad de imagen.</li>
	<li>Definir los parámetros de adquisición de datos. Esto incluye el número de píxeles (e.g., 256 × 256 píxeles), muestreo (e.g., 200 MS/s) y el tiempo de retardo. Iniciar la adquisición de datos. El software Matlab abrirá automáticamente el obturador para pasar el rayo láser cuando inicie y cierre el obturador para bloquear el rayo al terminar para evitar sobreexposiciones de láser. Nota: Limitado por la tasa de repetición de pulso (1 kHz) del láser, tarda aproximadamente 1 minuto para finalizar la adquisición de datos de una imagen con 256 × 256 píxeles.</li>
	<li>Procesar los datos sin procesar y visualizar la imagen de PAM en dos dimensiones (2D) a través de la máxima intensidad de proyección (MIP)13 o en 3D a través de la representación volumétrica38.</li>
	<li>Desmontar el transductor ultrasónico, enjuague la punta con agua desionizada y poner a la caja de almacenamiento.</li>
	<li>Transferir el conejo a la cámara fotográfica de fundus y volver a examinar el fondo. Este paso ayuda a comprobar si existen cambios morfológicos del fondo después de la sesión de imágenes.</li>
	<li>Enjuague la córnea del conejo con Lavaojos cada dos minutos durante el experimento para evitar keratopathy y deshidratación superficial corneal. Monitor y registro de animales signos vitales cada 15 minutos. Nota: La PAM, OCT y fundus imaging sesiones toman aproximadamente 1 h.</li>
</ol>6. post imagen
<ol><li>Después de nuevo examen de fondo de ojo mediante la cámara fotográfica de fundus, desconecte el gel V si está conectado. Enjuague el ojo con Lavaojos, aplicar el Flurbiprofeno oftálmico y ungüento oftálmico dexametasona, neomicina y polimixina B sulfatos y cerrar el ojo.</li>
	<li>Transferir el conejo con la manta de agua de circulación a una sala de recuperación. Escudo de la caja de la luz y espere hasta que el conejo se despierta naturalmente. Durante este período, monitorear signos vitales animales cada 15 minutos y mantener el registro y devolverá una copia al centro de animales para el mantenimiento de registros.</li>
	<li>Una vez que el conejo se despierta y suele ser activo, alerta y a pie, transporte a las instalaciones de animales. Si se planea un experimento agudo, eutanasia al animal utilizando solución de eutanasia (e.g., Beuthanasia, 0,22 mL/kg, inyección intravenosa en la vena marginal de la oreja) y deshacerse del cadáver.</li>
	<li>Desactivar el software y el láser. Limpiar el banco óptico.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Una película lagrimal intacta y regular es esencial para las imágenes de fondo de alta calidad. Un desgarro irregular y deteriorado las películas pueden degradar significativamente la imagen calidad42. Para preservar la integridad de la película del rasgón y evitar córneo keratopathy punteada superficial, es crítico para lubricar la córnea con Lavaojos muy con frecuencia, aproximadamente cada dos minutos. Si hay alguna preocupación con respecto a la opacidad del ojo, use una lámpara de hendidura y...

Las últimas décadas han presenciado el desarrollo explosivo del campo de la biomédica fotoacústica de1,2,3,4,5,6,7 ,8. Basado en la conversión de la energía de la luz en sonido, la proyección de imagen fotoacústica emergentes puede visualizar muestras biológicas a escalas de organelos, células, tejidos, órganos para pequeños animales de cuerpo entero y puede revelar su anatómico, funcional, moleculares, genéticos, y la información metabólica1,2,9,10,11,12. La proyección de imagen fotoacústica ha encontrado aplicaciones en una variedad de campos biomédicos, tales como célula biología13,14, biología vascular15,16, Neurología17,18 , Oncología19,20,21,22, dermatología23, farmacología24y hematología25,26. Su aplicación en Oftalmología, es decir, fotoacústica ocular la proyección de imagen, ha atraído a importantes intereses de los científicos y los clínicos y actualmente está bajo investigación activa.
En contraste con utilizan habitualmente ocular imagen tecnologías27, como la angiografía de la fluoresceína (FA) y la angiografía verde del indocyanine (ICGA) (basado en el contraste de fluorescencia), tomografía de coherencia óptica (OCT) (basado en el contraste de la dispersión óptica) y su derivada angiografía OCT (basado en el contraste de movimiento de las células de sangre rojas), ocular de fotoacústica absorción óptica utiliza como mecanismo de contraste de imagen. Esto es diferente de las tecnologías convencionales de imagen oculares y proporciona una herramienta única para el estudio de propiedades de absorción óptica del ojo, que generalmente están asociados con la condición fisiopatológica del tejido ocular28. Hasta la fecha, importantes excelente trabajo ha sido realizado en fotoacústica ocular29,30,31,32,33,34,35, la proyección de imagen 36,37, pero estos estudios se centran en el segmento posterior de los ojos de pequeños animales, como ratas y ratones. Los estudios pioneros bien demostraron la viabilidad de la proyección de imagen fotoacústica en oftalmología pero todavía hay un largo camino por recorrer hacia la traducción clínica de la tecnología desde tamaños de globo ocular de ratas y ratones son mucho más pequeño (menos de un tercio) que de los seres humanos. Debido a la propagación de ondas ultrasónicas sobre una distancia significativamente mayor, señal intensidad y calidad de imagen puede sufrir enormemente cuando la técnica se utiliza para la proyección de imagen el segmento posterior de ojos más grandes.
Hacia esta meta, recientemente informó la no invasiva, proyección de imagen de etiqueta-libre coriorretinal en conejos vivos usando integrado fotoacústica microscopia (PAM) y el dominio espectral (SD-OCT) de OCT38. El sistema tiene un rendimiento excelente y podía visualizar la retina y la coroides de los ojos de animales más grandes basados en absorción endógena y el contraste de la dispersión del tejido ocular. Los resultados preliminares en conejos indican que el PAM no invasor podía distinguir cada retinales y coroides vasos utilizando una dosis de exposición láser (~ 80 nJ) significativamente por debajo del límite de seguridad de American National Standards Institute (ANSI) (160 nJ) a 570 nm39; y el OCT podría resolver claramente diferentes capas retinianas, la coroides y la esclera. Es la primera demostración de proyección de imagen de segmento posterior de los animales más grandes con PAM y sería un gran paso hacia la traducción clínica de la tecnología teniendo en cuenta que el tamaño del globo ocular de conejos (18,1 mm)40 es casi el 80% de la longitud axial del seres humanos (23,9 mm).
En este trabajo, proporcionar una descripción detallada de la modalidad de doble sistema de imágenes y protocolos experimentales utilizados para la proyección de imagen no invasivo, libre de etiqueta coriorretinal en conejos vivos y demostrar el funcionamiento del sistema a través de representante retiniana y resultados de coroides.

<table><tbody><tr><td><sistema > imágenes de doble modalidad</láser >OPO</td><td></td><td></td><td></td> fuerte</tr> <tr><td></td><td>Ekspla (Vilnius, Lituania)</td><td>NT-242</td><td></td></tr><tr><td>Atenuador de haz</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, EE. UU.)</td> <td>AHWP10M-600</td><td></td></tr><tr><td>Etapa de rotación motorizada</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, EE. UU.)</td> <td>PRM1/MZ8</td><td></td></tr><tr><td>Controlador</td> <td>de etapa de rotación motorizadoThorlabs, Inc. (Newton, NJ, EE. UU.)</td><td>TDC001</td><td></td></tr><tr><td>Lente de enfoque</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, EE. UU.)</td><td>AC254-250-B</td><td></td></tr><tr><td>Pinhole</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, EE. UU.)</td><td>P50S</td><td></td></tr><tr><td>Lente colimadora</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, EE. UU.)</td><td>AC127-030-B</td><td></td></tr><tr><td>Fotodiodo</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, EE. UU.)</td><td>PDA36A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Obturador láser</td><td>Vincent Associates Inc. (Toronto, Canadá)</td><td>LS6S2T0</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de obturador láser</td><td>Vincent Associates Inc. (Toronto, Canadá)</td><td>VCM-D1</td><td></td></tr><tr><td>Espejo dicroico</td><td>Semrock, Inc. (Rochester, NY, EE. UU.)</td><td>Di03-R785-t3-25&times; 36</td><td></td></tr><tr><td>Lente de escaneo</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, EE. UU.)</td><td>OCT-LK3-BB</td><td></td></tr><tr><td>Lente oftálmica</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, EE. UU.)</td><td>AC080-010-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>Transductor ultrasónico</td><td>Optosonic Inc. (Arcadia, CA, EE. UU.)</td>Amplificador <td>personalizado</td><td></td></tr><tr><td></td><td>L3 Narda-MITEQ (Hauppauge, NY, EE. UU.)</td><td>Au-1647</td><td></td></tr><tr>Mini-circuitos de<td>filtro de paso de banda</td><td> (Brooklyn, Nueva York, Estados Unidos)</td><td>BLP-30+</td><td></td></tr><tr><td>Digitalizador</td><td>DynamicSignals LLC (Lockport, IL, EE. UU.)</td><td>PX1500-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Electrónica de sincronización</td><td>National Instruments Corporation (Austin, TX, EE. UU.)</td><td>Módulo OCT USB-6353</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, EE. UU.)</td><td>Ganymede-II-HR</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio de compensación de dispersión</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, EE. UU.)</td> <td>LSM03DC</td><td></td></tr><tr><td>Luz LED de iluminación</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, EE. UU.)</td><td>MCWHF2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de potencia</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, EE. UU.)</td><td>S121C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Interfaz del medidor de potencia</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, EE. UU.)</td> <td>PM100USB&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Herramienta de medición de altura&nbsp;</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, EE. UU.)</td><td>Cámara de fondo de ojo BHM1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Topcon Corporation (Tokio, Japón)&nbsp;</td><td>TRC 50EX</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks (Natick, MA, EE. UU.)</td><td>2017a</td><td></td></tr><tr><td>Osciloscopio</td><td>Teledyne LeCroy (Chestnut Ridge, NY, EE. UU.)</td><td>WaveJet 354T</td><td></td></tr><tr><td>Animal experimento</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manta circulante de agua</td><td>Stryker Corporation (Kalamazoo, MI, EE. UU)</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de ketamina inyección</td><td>Par pharmaceutical, Inc. (Woodcliff Lake, NJ, EE. UU.)</td> <td>Código NDC 42023-115-10</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de xilacina</td><td>VetOne (Boise, ID, EE. UU.)</td> <td>Código NDC 13985-704-10</td><td></td></tr><tr><td>Tropicamida oftálmica</td><td>Akorn Pharmaceuticals Inc. (Lake Forest, IL, EE. UU.)</td> <td>Código NDC 17478-102-12</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de fenilefrina oftálmico</td><td>Paragon BioTeck, Inc. (Portland, OR, EE. UU.)</td> <td>Código NDC 42702-102-15</td><td></td></tr><tr><td>Lubricante ocular</td><td>Hub Pharmaceuticals LLC (Rancho Cucamonga, CA, EE. UU.)</td> <td>Código NDC 17238-610-15</td><td></td></tr><tr><td>Lavado de ojos</td><td>Altaire Pharmaceuticals, Inc. (Aquebogue, NY, EE. UU.)</td><td>Código NDC 59390-175-18</td><td></td></tr><tr><td>Solución oftálmica de clorhidrato de tetracaína</td><td>Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, EE. UU.)</td><td>Código NDC 24208-920-64</td><td></td></tr><tr><td>Solución oftálmica de flurbiprofeno sódico</td><td>Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, EE. UU.)</td><td>Código NDC 24208-314-25</td><td></td></tr><tr><td>Neomicina y polimixina B Sulfatos y dexametasona Pomada oftálmica</td><td>Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, EE. UU.)</td><td>Código NDC 24208-795-35</td><td></td></tr><tr><td>Inyección de meloxicam</td><td>Henry Schein Inc. (Queens, NY, EE. UU.)</td><td>Código NDC 11695-6925-1</td><td></td></tr></tbody></table>

novela de fotoacústica de microscopía y tomografía de coherencia óptica dual-modalidad coriorretinal la proyección de imagen en ojos de conejo vivo

Novel Photoacoustic Microscopy and Optical Coherence Tomography Dual-modality Chorioretinal Imaging in Living Rabbit Eyes

La proyección de imagen fotoacústica ocular es un emergente oftálmico tecnología no invasor puede visualizar tejido ocular mediante la conversión de energía de la luz en ondas de sonido y actualmente está bajo investigación intensiva de la proyección de imagen. Sin embargo, la mayoría divulgados hasta la fecha se centra en la proyección de imagen del segmento posterior de los ojos de pequeños animales, como ratas y ratones, que plantea desafíos para la traducción clínica humana debido al tamaño pequeño del globo ocular. Este manuscrito describe una novela fotoacústica microscopia (PAM) y el sistema de doble modalidad tomografía coherencia óptica para proyección de imagen de segmento posterior de los ojos de animales más grandes, como conejos. La configuración del sistema, sistema alineación, preparación de animales y protocolos experimentales de doble modalidad para en vivo, no invasivo, libre de etiqueta coriorretinal en conejos se detallan. La eficacia del método se demuestra a través de resultados experimentales representativos, incluyendo la vasculatura retiniana y coroidea, obtenida por el PAM y OCT. Este manuscrito ofrece a una guía práctica para reproducir los resultados de la proyección de imagen en conejos y avanzar imágenes oculares fotoacústica en animales más grandes.

La modalidad de doble sistema de imagen y protocolo experimental han sido probados con éxito en laboratorio de los autores utilizando cuatro conejos blancos de Nueva Zelanda. La siguiente muestra algunos resultados representativos.
La figura 1 muestra el esquema de la PAM y la SD-OCT modalidad dual sistema de imagen. Se compone de los siguientes módulos: fotoacústica luz fuente, atenuador variable l...

Este manuscrito describe la configuración del nueva y procedimiento de microscopía fotoacústica y sistema de doble modalidad de tomografía de coherencia óptica para la proyección de imagen no invasiva, libre de etiqueta coriorretinal de animales más grandes, como conejos.

Novela de fotoacústica de microscopía y tomografía de coherencia óptica Dual-modalidad coriorretinal la proyección de imagen en ojos de conejo vivo

Photoacoustic ocular imaging is an emerging ophthalmic imaging technology that can noninvasively visualize ocular tissue by converting light energy into ...

El objetivo general de esta novedosa configuración de imágenes y procedimiento operativo es realizar microscopía fotoacústica y tomografía de coherencia óptica de doble modalidad para obtener imágenes coriorretinianas no invasivas y sin etiquetas de los ojos de mamíferos más grandes, como los conejos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en imágenes oftálmicas sobre la profundidad de la imagen, la resolución y la traducción clínica necesarias para discernir la saturación de oxígeno, la distribución de la sangre y la melanina en animales más grandes. La principal ventaja de esta técnica es que permite la visualización no invasiva del tejido ocular para la adquisición de imágenes de doble modalidad de microscopía fotoacústica y tomografía de coherencia óptica.Para comenzar, seleccione un láser oscilador paramétrico óptico bombeado por un láser de estado sólido con bomba de diodo como fuente de luz para el microscopio fotoacústico y use un divisor de haz para dividir el haz asistido por columna con una relación de división de 19 de reflexión a 10 de transmisión. Desvía sucesivamente la parte reflejada por el espejo M3 y el espejo dicroico y utiliza un galvanómetro bidimensional para escanear el reflejo en trama. Entregue el haz escaneado a través de un telescopio compuesto por una lente escaneada con una distancia focal de 36 milímetros y una lente oftálmica con una distancia focal de 10 milímetros y enfoque el haz en el fondo de ojo mediante la óptica de ojo de conejo.Antes de comenzar el procedimiento de imagen, coloque una manta térmica que circula agua en el soporte del cuerpo y ajuste la temperatura del agua circulante a 38 grados centígrados. Registre los signos vitales previos al procedimiento y confirme el nivel adecuado de sedación según la frecuencia cardíaca y respiratoria del conejo. Dilatar las pupilas de conejo con una gota de tropicamida al 1% oftálmico y clorhidrato de fenilefrina al 2,5% oftálmico.Utilice un amplificador ultrasónico para amplificar la señal y filtrarla mediante un filtro de paso bajo. Coloque un medidor de potencia sobre el ojo del conejo y mida la energía del pulso láser en la córnea del conejo para mantenerla por debajo del límite de seguridad del Instituto Nacional Estadounidense de Estándares. Para permitir que la tomografía de coherencia óptica o el sistema OCT obtengan imágenes del segmento posterior del ojo de conejo, agregue una lente oftálmica después de la lente de exploración.Utilice un tubo de carcasa de zoom para ajustar la longitud del brazo de referencia y confirmar su coincidencia con la longitud de la trayectoria óptica del brazo de muestra. Para la obtención de imágenes OCT de dominio espectral, coloque el conejo en la plataforma de imágenes de una cámara de fondo de ojo clínico y obtenga imágenes de 50 grados sin rojo y autofluoroscencia. A continuación, transfiera al animal a la plataforma del sistema OCT con un ojo debajo de la lente oftálmica.Ilumine el ojo con la luz LED y abra el software OCT. Compruebe la imagen de la cámara CCD del fondo de ojo y dibuje una línea recta en el software para representar el escaneo OCT B de interés. Comience a escanear ajustando la longitud del brazo de referencia para visualizar la imagen OCT y optimizar el factor de compensación de dispersión en el software OCT para obtener las imágenes más nítidas.A continuación, configure los datos, los parámetros de adquisición de datos adecuados y guarde las imágenes. Para la obtención de imágenes de microscopio fotoacústico, encienda el láser oscilador paramétrico óptico. Inicie el software de control del microscopio fotoacústico y ajuste la longitud de onda de lase a uno de los picos de absorción de la croma objetivo.Inicialice la posición del galvanómetro y controle la energía del láser antes de la córnea del conejo para confirmar que está por debajo del límite de seguridad del American National Standard Institute. Asigne el transductor ultrasónico en una etapa de traducción tridimensional y coloque la punta del transductor en contacto con la conjuntiva del conejo de modo que la punta apunte al fondo de ojo. Use una gota de lubricante ocular para acoplar mejor la punta del transductor en la conjuntiva del conejo y encienda la luz de iluminación LED.Visualice el fondo de ojo del conejo a través del software MatLab y establezca la región de escaneo de interés, incluido el centro y el tamaño físico de la región. Abra el obturador láser e inicie el escaneo B del haz, observando la señal fotoacústica detectada en el osciloscopio y, finalmente, ajustando la posición del transductor para maximizar la intensidad de la señal a lo largo de todo el escaneo B, según sea necesario. A continuación, configure los parámetros de adquisición de datos, procese los datos brutos y visualice la imagen del microscopio fotoacústico en dos dimensiones.Al final de la sesión de imágenes, transfiera el conejo de regreso a la cámara de fondo de ojo para examinar el fondo de ojo en busca de cambios morfológicos posteriores a la imagen y enjuague la córnea del conejo con lavado de ojos. Aplique sulfatos oftálmicos de flurbiprofeno, neomicina y polimixina b y ungüento oftálmico de dexametasona en la córnea y cierre el ojo. A continuación, transfiera el conejo y la manta circulante de agua a una cámara de recuperación con seguimiento hasta la recuperación completa.En esta fotografía representativa del fondo de ojo, los vasos coroideos se extienden por la mayor parte de los fondos del conejo, mientras que los vasos de la retina están confinados dentro del radio medular. Aquí se muestra una imagen típica de microscopía fotoacústica de la vasculatura coroidea dentro del fondo de ojo con los vasos coroideos delineados a alta resolución lateral. En esta imagen de exploración OCT B, la retina, la coroides y la esclerótica se visualizan con una alta resolución axial y los vasos coroideos se observan debajo de la capa de epitelio pigmentario de la retina.Utilizando el sistema de imágenes de doble modalidad, la proyección de intensidad máxima en 2D y la representación volumétrica en 3D de los vasos de la retina se pueden obtener mediante imágenes fotoacústicas. Los cortes ortogonales de la imagen 3D demuestran cómo la microscopía fotoacústica también se puede utilizar para visualizar los vasos retinianos individuales que se encuentran por encima de la capa de epitelio pigmentario de la retina y para confirmar las diferentes profundidades a las que se encuentran los vasos retinianos y coroideos. En este caso, una imagen de exploración OCT B muestra los vasos individuales de la retina.Y la capa de fibras nerviosas que confirma los resultados de las imágenes de microscopía fotoacústica. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en aproximadamente una hora si se realiza correctamente a través de recordar configurar la irradiancia del láser en ANLI bajos, establecer límites para revivir los lubricantes una vez, enjuagar los ojos para evitar la deshidratación y monitorear la condición del conejo cada 15 minutos. Después del procedimiento, se puede realizar inmunohistoquímica automatizada para responder a preguntas adicionales sobre la confirmación del desarrollo de neovascularización coroidea y para amplificar el volumen de la neovascularización en conejo.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la oftalmología exploraran las enfermedades coroideas en modelos de enfermedad de porte de conejo, incluidos los modelos de neovascularización coroidea. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo detectar vasos sanguíneos coriorretinianos individuales en ojos de conejo utilizando un novedoso sistema de imágenes moleculares multimodal para el diagnóstico temprano de la degeneración macular relacionada con la edad húmeda. No lo olvides.Trabajar con láseres de caída de vidrio y animales puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de gafas y batas de laboratorio mientras se realiza este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Engineering

Ingeniería

Fotoacústica oftalmología (PAOM), una modalidad de formación de imágenes ópticas de absorción basado, proporciona la evaluación complementaria de la retina a las tecnologías de formación de imágenes disponibles en la actualidad oftálmicas. Se describe el uso de PAOM integrado con dominio espectral tomografía de coherencia óptica (SD-OCT) para el uso simultáneo de imágenes multimodal de la retina en ratas.

La oftalmoscopia integrado fotoacústica y Spectral-tomografía de coherencia óptica de dominio

Source: Jagodzinska, J., et. al., Tomografía de Coherencia Óptica: Imágenes de las Células Gangliales de la Retina del Ratón In Vivo. J. Vis. Exp. (2017)  En este video, demostramos el uso de la tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) para obtener imágenes de las capas de la retina y evaluar los cambios estructurales en un modelo de ratón modificado genéticamente con neuropatía óptica.

Obtención de imágenes in vivo de la retina del ratón mediante tomografía de coherencia óptica

Este protocolo describe cómo alta resolución técnicas imagenológicas como una tomografía de coherencia óptica de dominio espectral y exploración oftalmoscopia de láser puede ser utilizada en pequeños roedores, utilizando un sistema de plataforma imagen oftálmica, para obtener información sobre espesor retiniano y microglía células distribución, respectivamente.

En Vivo Proyección de imagen de ratones de reportero Cx3cr1gfp/gfp con tomografía de coherencia óptica de dominio espectral y exploración oftalmoscopia de láser

Las células epiteliales del pigmento retiniano podrían servir como una terapia de reemplazo celular para la forma avanzada de la degeneración macular seca relacionada con la edad. Este protocolo describe la generación de un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica y el transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivados de células madre embrionarias humanas en este modelo de la enfermedad.

Transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica

Aquí, presentamos un protocolo para obtener una imagen retiniana OCT y fluorescencia (3D) tridimensional de gran campo de visión (FOV) mediante una novedosa plataforma multimodal proyección de imagen. Vamos a introducir la configuración del sistema, el método de alineación y protocolos operacionales. Se demostrará en vivo la proyección de imagen, y se proporcionará resultados representativos.

Multimodal volumétrica retina imágenes por exploración oblicua oftalmoscopia de láser (oSLO) y tomografía de coherencia óptica (OCT)

Se presenta un protocolo detallado para la evaluación de lecturas visuales y estructurales en roedores por coherencia óptica tomografía y optoquinéticas respuesta. Los resultados proporcionan información valiosa para la investigación oftalmológica y neurológica.

Utilizando tomografía de coherencia óptica y respuesta Optokinetic como lecturas de sistema Visual estructural y funcional en ratones y ratas

Aquí, describimos el uso de la tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) para visualizar estructuras retinianas y oculares in vivo en modelos de degeneración retiniana, glaucoma, retinopatía diabética y miopía.

Evaluaciones estructurales in vivo de enfermedades oculares en modelos de roedores mediante tomografía de coherencia óptica

La imagen in vivo es una herramienta poderosa para el estudio de la biología en la salud y la enfermedad. Este protocolo describe imágenes transpupilares de la retina del ratón con un microscopio estándar de dos fotones. También demuestra diferentes métodos de imagen in vivo para etiquetar fluorescentemente múltiples cohortes celulares de la retina.

Imágenes transpupilares de dos fotones in vivo de la retina del ratón

Aquí, describimos una técnica de imagen in vivo utilizando tomografía de coherencia óptica para facilitar el diagnóstico y la medición cuantitativa de la retinopatía en ratones.

Aplicación de la tomografía de coherencia óptica a un modelo de retinopatía en ratones

Este protocolo describe un método fiable para obtener criosecciones de alta calidad de ojos de conejo enteros. En él se detallan los procedimientos de disección, fijación, inclusión y seccionamiento de ojos de conejo, que pueden adaptarse fácilmente para su uso en cualquier estudio que utilice inmunohistoquímica en ojos más grandes.

Obtención de criosecciones de alta calidad de ojo de conejo entero 

Aprende a realizar imagen coriorretiniana no invasiva combinando microscopía fotoacústica y tomografía de coherencia óptica en conejos vivos. Este método permite visualizar vasos sanguíneos y analizar saturación de oxígeno.

Novela de fotoacústica de microscopía y tomografía de coherencia óptica Dual-modalidad coriorretinal la proyección de imagen en ojos de conejo vivo (Video) | JoVE Journal

Novela de fotoacústica de microscopía y tomografía de coherencia óptica Dual-modalidad coriorretinal la proyección de imagen en ojos de conejo vivo

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