Name: Una prueba objetiva y Reproducible de aprendizaje olfativo y discriminación en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Aprende un protocolo de aprendizaje asociativo en ratones para estudiar discriminación olfativa y plasticidad sináptica en neurociencia. Este método permite obtener datos estadísticos robustos sobre comportamiento sensorial.

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Este protocolo es una adaptación de trabajos previos en nuestro laboratorio (Huang et al. 8). todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado Animal y uso Comité (ACUC) de la Baylor College of Medicine. Es apoyado por la McNair Medical Institute, NINDS concesión R01NS078294 a B.R.A., subvención del NIH IDDRC U54HD083092, subvención NIDDK F30DK112571 a JMP y donación de NINDS F31NS092435 para CKM.

Todos los ratones fueron utilizados bajo un protocolo aprobado por el Baylor College de medicina institucional Animal Care y uso según estándares de NIH. Ratones en este protocolo fueron los ratones adultos (> 6 semanas de edad) en C57BL6/j de fondo e incluyó ratones masculinos y femeninos. Después de las tareas de formación/puesta en escena, ratones vuelven a su jaula casera.
1. construcción y reglas generales para el uso de operante aprendizaje cuadro (figura 1B, C)
<ol><li>Montar una cámara de ratón con fondo de la cámara. Mantener el cuadro de la formación en un tráfico bajo, área de tenue para evitar distracciones.</li>
	<li>Perforar cada puerto de agua con un pequeño agujero en la parte superior para permitir que una aguja de calibre 18 dispensar agua dentro del puerto.</li>
	<li>Frasco de vidrio se llenan de olor disuelto en aceite mineral (sustituida a la semana) y apriete firmemente la tapa.</li>
	<li>Conecte la aguja de calibre 18 a tubo de silicona. Perforar la tapa del frasco de vidrio con aguja de calibre 18 y conecte el otro extremo del tubo de silicona a la entrada de los puertos de olor.</li>
	<li>Colocar cada tubo de silicona en una válvula de olor.</li>
	<li>Conecte la línea de vacío a los puertos de olor.</li>
	<li>Conecte dos jeringas de 10 mL a una varilla de metal holding y conecte la tubería a las jeringas. Conecte el otro extremo de la tubería a una aguja de 18 G. Introducir la aguja en el orificio taladrado del puerto de poke de nariz de la cámara del ratón. Conecte el otro extremo de la tubería a la válvula de agua.</li>
	<li>Llena las dos jeringas de 10 mL con roedores el agua potable.</li>
	<li>Conecte un medidor de flujo de aire a la entrada de aire y mantener el flujo de aire en 3 – 5 L/min.</li>
	<li>Conecte las 2 válvulas de agua, 2 válvulas de olor, 2 puertos de agua, Puerto de olor y poder en el sistema de interfaz USB. Conecte las válvulas a los puertos 'Salida', todos los puertos de agua y olor a 'Input' puertos. Conecte todos los equipos para las salidas de la caja de interfaz USB de potencia y por último, conectar la caja de interfaz USB a corriente.</li>
	<li>Ajustar la succión del vacío para evitar la contaminación cruzada de olores entre los ensayos.</li>
	<li>Use tubería de olor específico para conectar frascos de olor a la cámara.</li>
</ol>2. ratón preparación: 1 – 3 días
<ol><li>Ratones se dividen en 3 grupos: control (no es necesario entrenamiento olfativo), pseudo-entrenados (ratones que reciben la recompensa o el castigo al azar) y grupos. Exponer ratones pseudo-capacitados para la prestación de la formación caja y olor, pero no proporcionan formación olfativa debido al resultado de la recompensa y castigo se asocia al azar con el olor entregado. Nota: El grupo pseudo capacitado pasará por el paradigma de la formación en las etapas de "Pseudotraining". Ratones entrenados completará todas las etapas de formación. Pseudotraining es opcional si el propósito del experimento es analizar las diferencias conductuales en discriminación de olor o aprendizaje. El protocolo proporciona que aquí agrega este grupo si el experimentador quiere sondear las diferencias neuronales antes y después del entrenamiento. El grupo pseudotrained entonces control de exposición pasiva olor y formación relacionado no olfativa.</li>
	<li>Comienza restricción de agua en los ratones a 40 mL/kg/día. Evitar la pérdida de peso mayor al 20% del peso inicial de los animales para evitar sufrimiento (figura 2A).</li>
	<li>Pesan los ratones diariamente para asegurar que están por encima del 80% del peso inicial. Si un ratón cae por debajo de este umbral, quitar el mouse del estudio y acceso libre al agua.</li>
	<li>Mantener todos los factores ambientales constantes en el protocolo incluida la temperatura, los ruidos y los olores callejeros (incluyendo personal del cuerpo y aromas de perfume/Colonia/desodorante). Nota: Como con todas las pruebas animal comportamiento, pequeños cambios ambientales pueden influir mucho resultados.</li>
</ol>3. instrucciones para todas las etapas
<ol><li>Código de software de formación para cada etapa siguiente. Ejecutar el software en el software de comportamiento. Nota: Para todas las etapas de codificación están contenidas en archivos de codificación adicionales. Datos de 20 senderos están agrupados como un solo bloque y ratón funcionamiento se muestra en bloques. Además, cada etapa puede repetirse en un ratón para un número de días hasta que se cumplen los criterios de finalización.</li>
	<li>No mantenga ratones en el cuadro de comportamiento de más de 60 min/día.</li>
	<li>Ratón limpia la basura de la jaula antes de cada ratón se transfiere a la jaula. Rocíe y limpie la cámara con etanol al 70% para minimizar la distracción de ratón olor.</li>
</ol>4. entrenamiento etapa 1: Asociar agua recompensa con un centro nariz Poke, 1 – 3 días
<ol><li>En esta etapa, asociado a ratones con una recompensa de agua sobre la exploración del puerto de agua.</li>
	<li>
Instrucciones de programación de capacitación fase 1
	<ol>
<li>Programa de esta etapa sólo utilizar el puerto de suministro de agua. Deja el ratón recibe una recompensa de agua por cada poke de la nariz. Nota: El programa es la salida de la duración del ensayo y el número total de agua premia el ratón que recibió.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Establecer la pseudotraining etapa 1 programación de la misma como formación etapa 1.</li>
	<li>
Caja y configuración de ratón
	<ol>
<li>Configurar el cuadro de comportamiento con un puerto de agua en el centro y con los puertos inaccesibles. Coloque el ratón en la cámara. Cerrar la cámara del ratón y comenzar el programa de la etapa 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Considerar esta etapa como completa cuando el ratón logra 100 ensayos dentro de 60 minutos quitar el ratón de la cámara después de 60 min o 100 ensayos hayan terminado (figura 2B). Nota: Debido a las diferencias individuales, algunos ratones naturalmente se abstendrán de exploración de la caja.</li>
	<li>Si es preciso, manualmente entregan agua en el puerto de agua. Repetir esta fase hasta por 3 días. Nota: Los ratones que ya están entrenados pueden repetirse más a mantener la paridad y a mantenerlos en restricción de líquidos. También es posible promover a todo un grupo en etapa 2 cuando llega a la media del grupo 100 ensayos/60 min. Esto permitirá que para que todos los ratones continuar entrenamiento el mismo día.</li>
</ol>5. entrenamiento etapa 2: Asociar una recompensa de agua puerto lateral con centro puerto nariz Poke, 1 – 5 días
<ol><li>En esta etapa, que los ratones meter su nariz en el centro puerto y recibirá inmediatamente una recompensa de agua en las salidas laterales.</li>
	<li>
Caja y configuración de ratón
	<ol>
<li>Configurar este y cada etapa posterior con 2 puertos de agua en los lados y el puerto de olor en el medio. Coloque el ratón en la cámara. Cerrar la cámara del ratón y comenzar el programa de fase 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Instrucciones de programación de entrenamiento etapa 2
	<ol>
<li>Proporcionar el ratón una recompensa inmediata de agua en ambos lados después de un poke de la nariz en el centro de puerto de la entrega de olor. Definir los parámetros de salida para esta etapa como la duración de la prueba, el número de juicios iniciados y la cantidad de agua premios recibidos dentro de 5 s de un poke de la nariz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Establecer la pseudotraining etapa 2 programación de la misma como formación etapa 2.</li>
	<li>Considerar esta etapa como completa cuando se realizan un mínimo de 40 ensayos en 60 min, con al menos el 25% de agua premios recibidos dentro de 5 s de la poke de nariz de puerto centro. Quite el ratón una vez terminada esta etapa (figura 2C). Nota: El programa calcula el porcentaje de agua premios recibidos en tiempo y forma con el fin de determinar la finalización de esta etapa. Aunque ratones varían en cuán rápido que completan esta etapa, más ratones alcanzará criterios de terminación dentro de 5 días. Sin embargo, si un ratón no ha terminado esta etapa dentro de 5 días, haga avanzar el ratón a la siguiente etapa. Este ratón se quitarán de la cohorte.</li>
</ol>6. entrenamiento etapa 3: Asociar una recompensa de agua con un olor específico y dentro de una ventana de tiempo específica, 1 – 3 días
<ol><li>En esta etapa, que los ratones reciben un olor de s (+) ir a un poke de la nariz en el centro del puerto. Posteriormente, dar una recompensa de agua sobre un poke de nariz en las salidas de agua laterales dentro de 5 s.</li>
	<li>
Instrucciones de programación de entrenamiento etapa 3
	<ol>
<li>Entregar el olor s en el centro de puerto de olor.</li>
		<li>Entregar la recompensa de agua si el ratón pasa las salidas laterales dentro de 5 s de la entrega de un olor. Nota: El programa comienza requiriendo sólo un poke de nariz de 100 ms en el puerto de centro para dar una recompensa del agua. Una vez que el ratón pasa el puerto del centro para la cantidad correcta de tiempo en el 80% de los ensayos, la duración del tiempo de un poke de nariz requiere para una recompensa de agua aumentará en 50 ms a 400 ms.</li>
		<li>Establecer los parámetros de salida idéntica a la etapa 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Establecer las instrucciones de programación etapa 3 pseudotraining mismo como entrenamiento etapa 3. Sin embargo, debe conectarse el olor s + el controlador entrega de olor para que el olor s + no se asocia con una recompensa de agua.</li>
	<li>
Caja y configuración de ratón
	<ol>
<li>Establecer la misma configuración en etapa 2.</li>
		<li>Conectar el olor s con el controlador de entrega de olor. Coloque el ratón en la cámara. Cerrar la cámara del ratón y comenzar el programa de la etapa 3. Quite el ratón una vez terminada esta etapa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Considerar esta etapa como completa cuando hay más de 60 premios en 60 min (figura 2D).</li>
</ol>7. etapa 4A: Asociación de olor prohibido (S-) y el castigo de tiempo de espera, 1 – 2 días
<ol><li>En esta etapa, introduce los ratones a un olor ninguno (S-). Proporcionar un castigo de tiempo los ratones que mal va a los puertos de agua después de oler el olor ninguno.</li>
	<li>
Instrucciones de programación de entrenamiento etapa 4A
	<ol>
<li>Entregar sólo el aroma de s en esta fase al principio, idéntica a la etapa 3. Después de 40 ensayos completa de ratones, comienzan entrega al azar de los olores a s + y S-olores. Programa un castigo fuera de tiempo 2-s si el ratón intenta buscar una recompensa de agua después de ser presentado el olor ninguno. Nota: Para ayudar en la distinción de ir vs prohibido, las luces laterales del IR se pueden manipular, que son en Go olores y apagado durante ninguno de los aceites. Las luces funcionan como una referencia secundaria para ratones en la formación inicial. Una vez que los ratones están capacitados con las luces, deben entrenamiento menores ir sin luces para confirmar que han aprendido la tarea con los olores.</li>
		<li>Establecer los parámetros de salida como tiempo de duración del juicio, número de ensayos iniciados, número de ensayos completados, % correcto y número total de premios recibidos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Establecer las instrucciones de programación de 4A etapa de pseudotraining el mismo como formación etapa 4S excepto s + y S-olores se presentan aleatoriamente desde el principio. Dar agua castigos recompensa o tiempo de espera al azar, independientemente del desempeño de la tarea.</li>
	<li>
Caja y configuración de ratón
	<ol>
<li>Definir la configuración de la caja el mismo como anterior etapa 3.</li>
		<li>Conexión s + y S-olor al controlador de entrega de olor. Coloque el ratón en la cámara. Cerrar la cámara del ratón y comenzar el programa de 4A etapa. Después de los ensayos de 40 completa de ratones, cambiar el programa para entregar al azar los olores. Quite el ratón una vez terminada esta etapa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Considerar esta etapa como completa cuando hay 40 ensayos con > 60% de respuestas correctas.</li>
</ol>8. etapa 4B: asociar olor prohibido (S-) y el castigo de tiempo, 5-11 días
<ol><li>
Instrucciones de programación de entrenamiento etapa 4B
	<ol>
<li>Hacer esta etapa idéntica a 4A etapa, sin embargo el castigo de tiempo por tratar de una recompensa de agua después un olor S 4 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fijar la recompensa de agua pseudotraining etapa 4B programación instrucciones idénticas a 4A etapa, sin embargo y castigo de tiempo se entregan al azar por ensayo.</li>
	<li>
Caja y configuración de ratón
	<ol>
<li>Definir la configuración de la caja el mismo como anterior etapa 4A.</li>
		<li>Conexión s + y S-olor al controlador de entrega de olor. Coloque el ratón en la cámara. Cerrar la cámara del ratón y comenzar el programa de etapa 4B. Considerar esta etapa completa cuando hay > 100 ensayos dentro de 60 minutos con una precisión > 85% (figura 2E)</li>
	</ol>
</li>
	<li>Controlar el porcentaje máximo y mínimo correcto para cada sesión de seguimiento de cada ratón en esta etapa. Aproximadamente el 85-90% de los ratones alcanzar criterios de terminación de esta etapa. Excluir a los ratones que no alcanzan la finalización de esta etapa de la Go/No-Go fase de prueba.</li>
	<li>(Opcional) Al final de esta etapa, aplicar un entrenamiento de la revocación, donde los olores de Go/No-Go se encienden la plataforma vial de olor. Asegúrese de que los ratones no se asocian con otro estímulo, como el sonido de las válvulas asociadas con las salidas laterales.</li>
</ol>9. Go/No-Go ensayo tarea: 1 día, 20 Min por ratón por día
<ol><li>Considerar esto como la fase final para determinar la exactitud de la identificación de asociaciones de olor y aprender a discriminar pares de olor. Nota: Novela olores son utilizados para S + S-para poner a prueba cuánto animales tome aprender nuevas asociaciones. Pares de odorante estructuralmente similares se utilizan para aumentar la dificultad de la tarea. 1-Butanol y 1-Pentanol, acetato de isoamilo vs butirato de isoamilo, ejemplos y + carvona vs - carvona.</li>
	<li>
Instrucciones de programación
	<ol>
<li>Deje que el software de entrenamiento detectar la longitud de poke de la nariz. Programa un poke de nariz de 300 ms en el puerto de olor centro para ejecutar la tarea.</li>
		<li>Establecer los parámetros de salida idéntico a etapa 4B, excepto no utilice cualquier luz guiada por señales.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caja y configuración de ratón
	<ol>
<li>Definir la configuración de la caja el mismo como anterior etapa 4B.</li>
		<li>Conexión s + y S-olor al controlador de entrega de olor. Coloque el ratón en la cámara. Cerrar la cámara del ratón y comenzar el programa de fase Go/No-Go. Exponer a los ratones que han aprendido a la tarea de aprendizaje olfativo de nuevos pares de olores químicamente similares. Nota: Ratones de tipo salvaje con discriminación de olor adecuado alcanzan > 85% de precisión con nuevos olores después de aproximadamente 10-20 cuadras o 200-400 ensayos (figura 3A).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Carleton, A., Petreanu, L. T., Lansford, R., Alvarez-Buylla, A., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Becoming+a+new+neuron+in+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Becoming a new neuron in the adult olfactory bulb.</a> Nat Neurosci. 6 (5), 507-518 (2003).</li>
<li>Petreanu, L., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+and+death+of+adult-born+olfactory+bulb+granule+neurons%3A+role+of+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Maturation and death of adult-born olfactory bulb granule neurons: role of olfaction.</a> J Neurosci. 22 (14), 6106-6113 (2002).</li>
<li>Yamaguchi, M., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+period+for+sensory+experience-dependent+survival+of+newly+generated+granule+cells+in+the+adult+mouse+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Critical period for sensory experience-dependent survival of newly generated granule cells in the adult mouse olfactory bulb.</a> PNAS. 102 (27), 9697-9702 (2005).</li>
<li>Rochefort, C., Gheusi, G., Vincent, J. D., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enriched+odor+exposure+increases+the+number+of+newborn+neurons+in+the+adult+olfactory+bulb+and+improves+odor+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enriched odor exposure increases the number of newborn neurons in the adult olfactory bulb and improves odor memory.</a> J Neurosci. 22 (7), 2679-2689 (2002).</li>
<li>Arenkiel, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+remodeling+of+olfactory+bulb+microcircuits+revealed+by+monosynaptic+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Activity-induced remodeling of olfactory bulb microcircuits revealed by monosynaptic tracing.</a> PloS one. 6 (12), 29423(2011).</li>
<li>Alonso, M., Viollet, C., Gabellec, M. M., Meas-Yedid, V., Olivo-Marin, J. C., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+discrimination+learning+increases+the+survival+of+adult-born+neurons+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory discrimination learning increases the survival of adult-born neurons in the olfactory bulb.</a> J Neurosci. 26 (41), 10508-10513 (2006).</li>
<li>Quast, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+broadening+of+inhibitory+sensory+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Developmental broadening of inhibitory sensory maps.</a> Nat Neurosci. 20 (2), 189(2017).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Task+learning+promotes+plasticity+of+interneuron+connectivity+maps+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Task learning promotes plasticity of interneuron connectivity maps in the olfactory bulb.</a> J Neurosci. 36 (34), 8856-8871 (2016).</li>
<li>Arbuckle, E. P., Smith, G. D., Gomez, M. C., Lugo, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+for+odor+discrimination+and+habituation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Testing for odor discrimination and habituation in mice.</a> J Vis Sci. (99), e52615(2015).</li>
<li>Zou, J., Wang, W., Pan, Y. W., Lu, S., Xia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+measure+olfactory+behavior+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Methods to measure olfactory behavior in mice.</a> Curr Protoc Toxicol. , 11-18 (2015).</li>
<li>Uchida, N., Takahashi, Y. K., Tanifuji, M., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+maps+in+the+mammalian+olfactory+bulb%3A+domain+organization+and+odorant+structural+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odor maps in the mammalian olfactory bulb: domain organization and odorant structural features.</a> Nat Neurosci. 3 (10), 1035(2000).</li>
<li>Cang, J., Isaacson, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+whole-cell+recording+of+odor-evoked+synaptic+transmission+in+the+rat+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo whole-cell recording of odor-evoked synaptic transmission in the rat olfactory bulb.</a> J Neurosci. 23 (10), 4108-4116 (2003).</li>
<li>Parthasarathy, K., Bhalla, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laterality+and+symmetry+in+rat+olfactory+behavior+and+in+physiology+of+olfactory+input%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Laterality and symmetry in rat olfactory behavior and in physiology of olfactory input.</a> J Neurosci. 33 (13), 5750-5760 (2013).</li>
<li>Rajan, R., Clement, J. P., Bhalla, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rats+smell+in+stereo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rats smell in stereo.</a> Science. 311 (5761), 666-670 (2006).</li>
<li>Batista-Brito, R., Close, J., Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinct+temporal+origins+of+olfactory+bulb+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The distinct temporal origins of olfactory bulb interneuron subtypes.</a> J Neurosci. 28 (15), 3966-3975 (2008).</li>
<li>Sakamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+postnatal+neurogenesis+contributes+to+formation+of+the+olfactory+bulb+neural+circuits+and+flexible+olfactory+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Continuous postnatal neurogenesis contributes to formation of the olfactory bulb neural circuits and flexible olfactory associative learning.</a> J Neurosci. 34 (17), 5788-5799 (2014).</li>
<li>Resendez, S. L., Jennings, J. H., Ung, R. L., Namboodiri, V. M. K., Zhou, Z. C., Otis, J. M., Stuber, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cortical%2C+subcortical%2C+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nat Protoc. 11 (3), 566(2016).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+optogenetics+with+multifunctional+flexible+polymer+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">One-step optogenetics with multifunctional flexible polymer fibers.</a> Nat Neurosci. 20 (4), 612(2017).</li>
</ol>

Los autores declaran no hay conflictos de intereses y no intereses en competencia.

El sistema olfativo roedor proporciona un modelo único para estudiar la plasticidad dependiente sensorial. Aquí presentamos un paradigma de aprendizaje olfativo para entrenar a ratones para asociar pares de olor con una recompensa o castigo. A través de esta tarea de aprendizaje, se pueden estudiar cambios aguas abajo en experimentos posteriores (electrofisiología, en vivo imágenes neuronales, etcetera). Al finalizar, ratones aprenderán a realizar una tarea de localización de olor simple para asociar un...

El ratón OB, donde información de olor primero entra en sistema nervioso central (SNC), proporciona un excelente modelo para estudiar cambios estructurales dependen de la experiencia. Contorno OB integra continuamente las neuronas nacidas en adulto de una manera dependiente de la actividad. Precursores de la neurona nacido adulto dividen apagado de progenitores que la zona subventricular adyacente a los ventrículos laterales1. A migrar en el OB, estos precursores neuronales o sobrevivirán, distinguen e integran como células del gránulo inhibitorio o experimentan apoptosis2. Selección de destino de la célula está influenciada por la actividad olfativa, incluyendo aprendizaje olfativo3,4,5,6. Tras la integración, cambios sinápticos inducidos por el aprendizaje ocurren en células del gránulo durante una semana dos periodo crítico7,8. Así, los ensayos para el aprendizaje olfativo son útiles para examinar cómo dependiente de la experiencia plasticidad influencias estructurales y funcionales reorganización de un circuito del cerebro maduro.
Este protocolo ofrece una forma de entrenamiento olfativo mediante el uso de un paradigma de condicionamiento operante. En esta tarea, ratones privados de agua están entrenados para asociar un olor (el olor a "Ir") con un premio de agua y otro olor (el olor a "Ninguno") con un castigo de tiempo de espera juicio. Progreso a través de una serie gradual de las fases de la formación a lo largo de 2-4 semanas en ratones. Cuando la formación es completa, ratones responden al olor vaya o prohibido con comportamientos discretos, correspondientes (buscando una recompensa de agua en los ensayos Go y no buscan la recompensa de agua ninguno ensayos) (figura 1A). Después de entrenamiento, ratones pueden ser impugnados más con pares de olores químicamente similares probar la discriminación o se convierten en la transición a estudios de investigación aprendizaje olfativo cómo altera la estructura o función de la OB. Aunque las tareas de discriminación de olores se han descrito previamente, más confían en las medidas subjetivas como el número de aspiraciones entre dos odorantes9,10. Además, la necesidad de calificación humana de tales tareas es mucho tiempo. La tarea de aprendizaje olfativo de Go/No-Go se describe en este protocolo ofrece una medición imparcial, directa de discriminación de olores y el aprendizaje olfativo.

<table><tbody><tr><td>Frasco de vidrio</td><td>Qorpak</td><td>GLC-01016</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silicona</td><td>Thermo Scientific</td><td>86000030</td><td></td></tr><tr><td>agujas de calibre 18</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>1-Butanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>437603</td><td></td></tr><tr><td>Ácido propiónico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>402907</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de ratón</td><td>Med Associates</td><td>ENV-307W</td><td></td></tr><tr><td>Piso de la cámara</td><td>Med Associates</td><td>ENV-307W-GFW</td><td></td></tr><tr><td>Water Port</td><td>Med Associates</td><td>ENV-313W</td><td>Necesita dos</td></tr><tr><td>estímulos de olor</td><td>Med Associates</td><td>ENV-275</td><td>Contiene 2 válvulas para la puerta de entrega de olores&nbsp;</td></tr><tr><td>Odor Port</td><td>Med Associates</td><td>ENV-375W-NPP</td><td></td></tr><tr><td>Interfaz USB Med</td><td>Associates</td><td>DIG-703A-USB</td><td></td></tr><tr><td>Ordenador de sobremesa con Windows 2000, XP, Vista o 7</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caudalímetro</td><td>VWR</td><td>97004-952</td><td></td></tr><tr><td>Software de comportamiento</td><td>Med Associates</td><td>SOF-735</td><td>Este software, que ejecuta cada etapa de entrenamiento, ahora ha sido reemplazado por Med-PC V</td></tr><tr><td>Software de transferencia de datos</td><td>Med Associates</td><td>SOF-731</td><td>Este software formatea los datos a Excel</td></tr><tr><td>Software de capacitación</td><td>Med Associates</td><td>DIG-703A-USB</td><td>Este software se utiliza para programar cada etapa de entrenamiento</td></tr><tr><td>Válvula de agua</td><td>Neptune Research</td><td>225P012-11</td><td>Esta válvula se utiliza para compuerta el suministro de agua. Necesita dos</td></tr><tr><td>válvulas de olor</td><td>Neptune Research</td><td>360P012-42</td><td>Esta válvula se utiliza para controlar la entrega de olores. Necesito dos</td></tr></tbody></table>

una prueba objetiva y reproducible de aprendizaje olfativo y discriminación en ratones

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

Olfato es la modalidad sensorial predominante en los ratones y muchos comportamientos importantes, incluyendo alimentación, detección de depredador, apareamiento y crianza de los hijos. Lo importante, ratones pueden ser entrenados para asociar los olores nuevos de respuestas conductuales específicas para proporcionar la penetración en función del circuito olfatorio. Este protocolo describe el procedimiento para los ratones de entrenamiento en una tarea de aprendizaje operante Go/No-Go. En este enfoque, ratones están entrenados en cientos de pruebas automatizadas diariamente durante 2-4 semanas y luego pueden ser probados en novela Go/No-Go olor los pares para evaluar discriminación olfativa, o ser utilizado para estudios sobre cómo aprender olor altera la estructura o función de la olfativa circuito. Además, el bulbo olfatorio de ratón (OB) cuenta con integración continua de las neuronas nacidas en adulto. Curiosamente, aprendizaje olfativo aumenta la supervivencia y conexiones sinápticas de estas neuronas nacido adulto. Por lo tanto, este protocolo puede combinarse con otras técnicas de bioquímicas, electrofisiológicas y proyección de imagen para el estudio de aprender y dependiente de actividad factores que median en la supervivencia neuronal y la plasticidad.

Una vez que los ratones han aprendido la tarea de aprendizaje olfativo, ahora puede asociar pares de olor novela de recompensa y de castigo. Estos ratones entrenados comienzan normalmente con un 50% la precisión en la tarea Go/No-Go. El porcentaje correcto se puede trazar por el bloque de ensayo como una curva de aprendizaje para los pares de olores nuevos (figura 3A). Dentro de los 10 ensayos de bloque, que toman la mayoría ratones de menos ...

Aquí capacitamos a ratones en una tarea de aprendizaje asociativo para probar la discriminación de olor. Este protocolo permite también estudios sobre cambios estructurales inducidos por el aprendizaje en el cerebro.

Una prueba objetiva y Reproducible de aprendizaje olfativo y discriminación en ratones

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and ...

El objetivo general de este protocolo de comportamiento es entrenar a los ratones para que asocien un olor con una recompensa y otro olor con un castigo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como el aprendizaje, la plasticidad sináptica y la discriminación sensorial. La principal ventaja de esta técnica es que, una vez entrenados, los ratones realizan cientos de ensayos en cuestión de horas para obtener un muestreo estadístico sólido.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas, ya que la gravedad de la disfunción olfativa es predictiva del deterioro cognitivo posterior en los seres humanos. Aunque este método puede proporcionar información sobre el olfato, también se puede aplicar a otros sistemas, como la visión o la audición. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos iniciales tanto para configurar la cámara de comportamiento como para usar el software son difíciles de aprender, debido a los diferentes puertos de conexión y pasos de entrenamiento.Para empezar, monta una cámara de ratón con suelo de cámara. Mantenga la caja de entrenamiento en un área de poco tráfico y poca luz para evitar distracciones. Luego, perfore cada puerto de agua con un pequeño orificio en la parte superior, para permitir que una aguja de calibre 18 dispense agua dentro del puerto.Llene un frasco de vidrio con odorante disuelto en aceite mineral y apriete firmemente la tapa. A continuación, conecte una aguja de calibre 18 al tubo de silicona. Perfore la tapa del frasco de vidrio y conecte el otro extremo del tubo de silicona a la entrada de los puertos de olor.Después de eso, coloque cada tubo de silicona en una válvula de olor. Conecte la línea de vacío a los puertos de olor. Conecte dos jeringas de 10 mililitros a una varilla de retención de metal y conecte el tubo a las jeringas.Posteriormente, conecte el otro lado del tubo a una aguja de calibre 18. Coloque la aguja en el orificio perforado del puerto de pinchazo nasal en la cámara del mouse y conecte el otro extremo del tubo a la válvula de agua. Llene las dos jeringas de 10 mililitros con agua potable para roedores.Luego conecte un medidor de flujo de aire a la entrada de aire y mantenga el flujo de aire de tres a cinco litros por minuto. Conecte las dos válvulas de agua, las dos válvulas de olor, los dos puertos de agua, el puerto de olor y la alimentación al sistema de interfaz USB. Y, por último, conecte la caja de interfaz USB a la alimentación.A continuación, ajuste la succión al vacío para evitar la contaminación cruzada de olores entre ensayos, y utilice tubos específicos para el olor para conectar los viales de odorante a la cámara. Para preparar a los ratones para el entrenamiento, comience la restricción de agua a 40 mililitros por kilogramo por día. Pese a los ratones diariamente para asegurarse de que estén por encima del 80% del peso basal y mantenga todos los factores ambientales constantes durante todo el protocolo, incluida la temperatura, el ruido y los olores extraños.Limpie la jaula antes de que cada ratón sea transferido a ella. Rocíe y limpie la cámara con etanol al 70% para minimizar la distracción del olor del ratón. Para el entrenamiento de la primera etapa, configure el cuadro de comportamiento con un puerto de agua en el centro y con todos los puertos laterales inaccesibles.Coloque un ratón en la cámara y ciérrela. Luego, comience el programa de la etapa uno. Considere esta etapa como completa cuando el mouse logre 100 intentos en 60 minutos.Retire el mouse de la cámara después de 60 minutos o se hayan completado 100 pruebas. Para el entrenamiento de la etapa dos, configure esta y todas las etapas posteriores con dos puertos de agua en los lados y el puerto de olor en el medio. Coloque un ratón en la cámara y ciérrela.Luego, comience el programa de la segunda etapa. Considere esta etapa como completa cuando se realicen un mínimo de 40 pruebas en 60 minutos, con al menos el 25% de las recompensas de agua recibidas dentro de los cinco segundos posteriores al pinchazo de la nariz a babor central. Retire el mouse una vez que se haya completado esta etapa.Para el entrenamiento de la etapa tres, conecte el olor S-plus al controlador de entrega de olores. Coloque un ratón en la cámara y ciérrela. Después, comienza el programa de la tercera etapa.Considere esta etapa como completa cuando haya más de 60 recompensas en 60 minutos y retire el mouse una vez que la etapa haya competido. Para el entrenamiento de la etapa cuatro-A, establezca la configuración de la caja igual que la etapa tres anterior. A continuación, conecte el olor S-plus y S-minus al controlador de entrega de olores.Coloque un ratón en la cámara y ciérrela. Luego, comienza el programa de la etapa cuatro-A. Después de que el ratón complete 40 pruebas, cambie el programa para que emita los olores de forma aleatoria.Retire el mouse una vez que se haya completado la etapa. Para el entrenamiento de la etapa cuatro-B, haga que esta etapa sea idéntica a la etapa cuatro-A. Sin embargo, el castigo de tiempo fuera por intentar una recompensa de agua después de un olor S-menos es de cuatro segundos.Conecte el olor S-plus y S-minus al controlador de entrega de olores. Coloque un ratón en la cámara. Cierre la cámara del ratón y comience el programa de la etapa cuatro-B.Considere que esta etapa se ha completado cuando hay más de 100 ensayos en 60 minutos, con una precisión superior al 85%Para el ensayo de pasa/no pasa, establezca la configuración de la caja igual que la etapa anterior cuatro-B. Conecte el olor S-plus y S-minus al controlador de entrega de olores. Luego, coloque un mouse en la cámara.Comience el programa de etapa pasa/no pasa y luego exponga al ratón que ha aprendido la tarea de aprendizaje olfativo a nuevos pares de olores químicamente similares. Una vez que los ratones han aprendido la tarea de aprendizaje olfativo, pueden asociar nuevos pares de olores con la recompensa y el castigo. Estos ratones entrenados normalmente comienzan con aproximadamente un 50% de precisión en la tarea de ir / no pasar.El porcentaje correcto se puede trazar por bloque de prueba como una curva de aprendizaje para nuevos pares de olores. Dentro de 10 ensayos en bloque, los ratones son capaces de discriminar correctamente entre olores, con una precisión superior al 85%. Esto demuestra que nuestro protocolo ha entrenado con éxito a ratones de tipo salvaje para asociar un olor con una recompensa de agua y otro con un castigo de tiempo fuera.Una vez que los ratones aprenden la tarea, los pares de olores se pueden modificar para aumentar o disminuir la dificultad de la tarea. Por ejemplo, la disminución de la concentración del par de olores aumenta la dificultad de la tarea. Los ratones también son capaces de recordar pares de olores previamente aprendidos.Después de esperar siete días desde que aprendieron la tarea, una prueba de recuerdo muestra que los ratones de tipo salvaje pueden recordar rápidamente las asociaciones de olor aprendidas previamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe asegurarse de que los odorantes deseados estén conectados correctamente a la caja de comportamiento. Es especialmente importante si varios experimentadores están usando diferentes olores.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el mapeo de olores para responder preguntas adicionales como: ¿Cómo influye el aprendizaje en la forma en que el cerebro representa la información sensorial? Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran los cambios neuronales inducidos por el aprendizaje en el sistema olfativo del ratón. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo enseñar a los ratones a asociar un olor con una recompensa y otro olor con un castigo.No olvide que trabajar con agujas afiladas puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como la eliminación adecuada de objetos punzantes al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

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