Una prueba objetiva y Reproducible de aprendizaje olfativo y discriminación en ratones
March 22nd, 2018
Aquí capacitamos a ratones en una tarea de aprendizaje asociativo para probar la discriminación de olor. Este protocolo permite también estudios sobre cambios estructurales inducidos por el aprendizaje en el cerebro.
El objetivo general de este protocolo de comportamiento es entrenar a los ratones para que asocien un olor con una recompensa y otro olor con un castigo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como el aprendizaje, la plasticidad sináptica y la discriminación sensorial. La principal ventaja de esta técnica es que, una vez entrenados, los ratones realizan cientos de ensayos en cuestión de horas para obtener un muestreo estadístico sólido.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas, ya que la gravedad de la disfunción olfativa es predictiva del deterioro cognitivo posterior en los seres humanos. Aunque este método puede proporcionar información sobre el olfato, también se puede aplicar a otros sistemas, como la visión o la audición. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos iniciales tanto para configurar la cámara de comportamiento como para usar el software son difíciles de aprender, debido a los diferentes puertos de conexión y pasos de entrenamiento.
Para empezar, monta una cámara de ratón con suelo de cámara. Mantenga la caja de entrenamiento en un área de poco tráfico y poca luz para evitar distracciones. Luego, perfore cada puerto de agua con un pequeño orificio en la parte superior, para permitir que una aguja de calibre 18 dispense agua dentro del puerto.
Llene un frasco de vidrio con odorante disuelto en aceite mineral y apriete firmemente la tapa. A continuación, conecte una aguja de calibre 18 al tubo de silicona. Perfore la tapa del frasco de vidrio y conecte el otro extremo del tubo de silicona a la entrada de los puertos de olor.
Después de eso, coloque cada tubo de silicona en una válvula de olor. Conecte la línea de vacío a los puertos de olor. Conecte dos jeringas de 10 mililitros a una varilla de retención de metal y conecte el tubo a las jeringas.
Posteriormente, conecte el otro lado del tubo a una aguja de calibre 18. Coloque la aguja en el orificio perforado del puerto de pinchazo nasal en la cámara del mouse y conecte el otro extremo del tubo a la válvula de agua. Llene las dos jeringas de 10 mililitros con agua potable para roedores.
Luego conecte un medidor de flujo de aire a la entrada de aire y mantenga el flujo de aire de tres a cinco litros por minuto. Conecte las dos válvulas de agua, las dos válvulas de olor, los dos puertos de agua, el puerto de olor y la alimentación al sistema de interfaz USB. Y, por último, conecte la caja de interfaz USB a la alimentación.
A continuación, ajuste la succión al vacío para evitar la contaminación cruzada de olores entre ensayos, y utilice tubos específicos para el olor para conectar los viales de odorante a la cámara. Para preparar a los ratones para el entrenamiento, comience la restricción de agua a 40 mililitros por kilogramo por día. Pese a los ratones diariamente para asegurarse de que estén por encima del 80% del peso basal y mantenga todos los factores ambientales constantes durante todo el protocolo, incluida la temperatura, el ruido y los olores extraños.
Limpie la jaula antes de que cada ratón sea transferido a ella. Rocíe y limpie la cámara con etanol al 70% para minimizar la distracción del olor del ratón. Para el entrenamiento de la primera etapa, configure el cuadro de comportamiento con un puerto de agua en el centro y con todos los puertos laterales inaccesibles.
Coloque un ratón en la cámara y ciérrela. Luego, comience el programa de la etapa uno. Considere esta etapa como completa cuando el mouse logre 100 intentos en 60 minutos.
Retire el mouse de la cámara después de 60 minutos o se hayan completado 100 pruebas. Para el entrenamiento de la etapa dos, configure esta y todas las etapas posteriores con dos puertos de agua en los lados y el puerto de olor en el medio. Coloque un ratón en la cámara y ciérrela.
Luego, comience el programa de la segunda etapa. Considere esta etapa como completa cuando se realicen un mínimo de 40 pruebas en 60 minutos, con al menos el 25% de las recompensas de agua recibidas dentro de los cinco segundos posteriores al pinchazo de la nariz a babor central. Retire el mouse una vez que se haya completado esta etapa.
Para el entrenamiento de la etapa tres, conecte el olor S-plus al controlador de entrega de olores. Coloque un ratón en la cámara y ciérrela. Después, comienza el programa de la tercera etapa.
Considere esta etapa como completa cuando haya más de 60 recompensas en 60 minutos y retire el mouse una vez que la etapa haya competido. Para el entrenamiento de la etapa cuatro-A, establezca la configuración de la caja igual que la etapa tres anterior. A continuación, conecte el olor S-plus y S-minus al controlador de entrega de olores.
Coloque un ratón en la cámara y ciérrela. Luego, comienza el programa de la etapa cuatro-A. Después de que el ratón complete 40 pruebas, cambie el programa para que emita los olores de forma aleatoria.
Retire el mouse una vez que se haya completado la etapa. Para el entrenamiento de la etapa cuatro-B, haga que esta etapa sea idéntica a la etapa cuatro-A. Sin embargo, el castigo de tiempo fuera por intentar una recompensa de agua después de un olor S-menos es de cuatro segundos.
Conecte el olor S-plus y S-minus al controlador de entrega de olores. Coloque un ratón en la cámara. Cierre la cámara del ratón y comience el programa de la etapa cuatro-B.
Considere que esta etapa se ha completado cuando hay más de 100 ensayos en 60 minutos, con una precisión superior al 85%Para el ensayo de pasa/no pasa, establezca la configuración de la caja igual que la etapa anterior cuatro-B. Conecte el olor S-plus y S-minus al controlador de entrega de olores. Luego, coloque un mouse en la cámara.
Comience el programa de etapa pasa/no pasa y luego exponga al ratón que ha aprendido la tarea de aprendizaje olfativo a nuevos pares de olores químicamente similares. Una vez que los ratones han aprendido la tarea de aprendizaje olfativo, pueden asociar nuevos pares de olores con la recompensa y el castigo. Estos ratones entrenados normalmente comienzan con aproximadamente un 50% de precisión en la tarea de ir / no pasar.
El porcentaje correcto se puede trazar por bloque de prueba como una curva de aprendizaje para nuevos pares de olores. Dentro de 10 ensayos en bloque, los ratones son capaces de discriminar correctamente entre olores, con una precisión superior al 85%. Esto demuestra que nuestro protocolo ha entrenado con éxito a ratones de tipo salvaje para asociar un olor con una recompensa de agua y otro con un castigo de tiempo fuera.
Una vez que los ratones aprenden la tarea, los pares de olores se pueden modificar para aumentar o disminuir la dificultad de la tarea. Por ejemplo, la disminución de la concentración del par de olores aumenta la dificultad de la tarea. Los ratones también son capaces de recordar pares de olores previamente aprendidos.
Después de esperar siete días desde que aprendieron la tarea, una prueba de recuerdo muestra que los ratones de tipo salvaje pueden recordar rápidamente las asociaciones de olor aprendidas previamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe asegurarse de que los odorantes deseados estén conectados correctamente a la caja de comportamiento. Es especialmente importante si varios experimentadores están usando diferentes olores.
Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el mapeo de olores para responder preguntas adicionales como: ¿Cómo influye el aprendizaje en la forma en que el cerebro representa la información sensorial? Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran los cambios neuronales inducidos por el aprendizaje en el sistema olfativo del ratón. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo enseñar a los ratones a asociar un olor con una recompensa y otro olor con un castigo.
No olvide que trabajar con agujas afiladas puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como la eliminación adecuada de objetos punzantes al realizar este procedimiento.
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Visión general
Este estudio investiga la discriminación de olores utilizando una tarea de aprendizaje asociativo en ratones, centrándose en los cambios estructurales inducidos por el aprendizaje en el cerebro. La técnica examina preguntas clave de neurociencia como la discriminación sensorial y la plasticidad sináptica.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Olfato
- Aprendizaje conductual
Antecedentes
- Los protocolos de aprendizaje asociativo son fundamentales para estudiar las funciones cognitivas.
- La discriminación de olores juega un papel crucial en el procesamiento sensorial de los mamíferos.
- Entender el comportamiento olfativo en ratones puede estar relacionado con el deterioro cognitivo humano.
- Este método puede adaptarse para otros sistemas sensoriales como la visión y la audición.
Propósito del estudio
- Entrenar a los ratones para asociar olores con recompensas y castigos.
- Explorar el procesamiento olfativo y sus implicaciones para las enfermedades neurodegenerativas.
- Desarrollar un ensayo conductual robusto para el análisis estadístico del aprendizaje.
Métodos utilizados
- Los ratones son entrenados usando una cámara de comportamiento especialmente configurada.
- El entrenamiento involucra varias etapas, evaluando la precisión en la discriminación de olores.
- No se mencionan flujos de trabajo multiómicos.
- Los pasos críticos incluyen la restricción de agua para manejar la motivación y los criterios de finalización de la etapa.
- Los procedimientos incluyen una configuración meticulosa de los sistemas de entrega de olores y los protocolos de acondicionamiento.
Resultados principales
- Los ratones aprenden exitosamente a asociar diferentes olores con recompensas o castigos.
- El entrenamiento permite una alta muestreo estadístico a través de ensayos repetidos.
- La precisión en la discriminación de olores se acerca al 85% después del entrenamiento.
- Los resultados sugieren que el aprendizaje olfativo puede evaluarse efectivamente a través de este protocolo.
Conclusiones
- El protocolo demuestra un método confiable para estudiar el aprendizaje asociativo en la olfacción.
- Este enfoque puede ofrecer información sobre estrategias terapéuticas para enfermedades neurodegenerativas.
- Los hallazgos mejoran la comprensión de los mecanismos de discriminación sensorial en mamíferos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-throughput, quantitative assessment of olfactory learning and discrimination in mice, providing a robust behavioral readout for target validation in neuroscience drug discovery. By supporting mechanistic de-risking of olfactory circuit function and plasticity, it informs early-stage hypothesis testing for compounds targeting neurodegenerative or sensory processing disorders. The assay’s reproducibility and scalability facilitate cross-functional alignment between discovery biology and translational research teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to olfactory learning, synaptic plasticity, and sensory discrimination mechanisms.
- Operational Value: Supports biological de-risking by quantifying odor association learning and memory retention in a controlled, reproducible system.
- Predictive Value: Generates quantitative behavioral data (e.g., accuracy rates, learning curves) that aid in portfolio triage and go/no-go decisions for CNS-targeted compounds.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces validated biological systems (trained mice) capable of hundreds of automated trials daily, enabling reliable compound evaluation.
- Standardization: Ensures reproducibility through strict environmental controls, water restriction protocols, and stage-based training criteria.
- Scalability: Facilitates high statistical sampling and longitudinal studies, supporting assay adaptation for dose-response or time-course screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with human olfactory dysfunction as a predictive biomarker of cognitive decline, supporting translational continuity from mouse models to clinical risk assessment.
- Mechanistic De-risking: Enables study of activity-dependent neuronal survival and plasticity, linking behavior to downstream biochemical, electrophysiological, or imaging readouts.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decisions on compound effects on learning-induced neural changes, reducing late-stage biological risk in sensory or neurodegenerative programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical validation, particularly for projects focused on olfactory processing, sensory discrimination, or neurodegenerative disease mechanisms.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring how odor learning alters neural structure and function.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs (trial accuracy, learning curves) that enable comparison across experimental conditions or genetic models.
- Analytics: Provides statistical learning curves and discrimination thresholds that help teams assess compound effects on sensory processing and memory.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through alignment with human olfactory biomarkers predictive of cognitive decline.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable behavioral platform for iterative testing across multiple compounds, genotypes, or environmental manipulations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in olfactory learning and plasticity pathways.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability through automated trial performance and strict procedural controls.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of CNS targets and reducing failure risk in later stages.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on learning, memory, and sensory discrimination.
Implementation Considerations
- Requires expertise in behavioral neuroscience, olfactory system anatomy, and operant conditioning techniques.
- Depends on specialized instrumentation including odor delivery systems, water valves, vacuum lines, and USB interface controllers.
- Necessitates cross-team standardization of environmental controls (odor, noise, temperature) and training protocols to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when transferring protocols across mouse strains, ages, or odorant physicochemical properties.
- Includes practical limitations such as setup complexity, needle hazards, and the need for consistent animal handling to avoid distraction or stress confounds.
