Una prueba objetiva y Reproducible de aprendizaje olfativo y discriminación en ratones
22 de marzo de 2018
Aquí capacitamos a ratones en una tarea de aprendizaje asociativo para probar la discriminación de olor. Este protocolo permite también estudios sobre cambios estructurales inducidos por el aprendizaje en el cerebro.
El objetivo general de este protocolo de comportamiento es entrenar a los ratones para que asocien un olor con una recompensa y otro olor con un castigo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como el aprendizaje, la plasticidad sináptica y la discriminación sensorial. La principal ventaja de esta técnica es que, una vez entrenados, los ratones realizan cientos de ensayos en cuestión de horas para obtener un muestreo estadístico sólido.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas, ya que la gravedad de la disfunción olfativa es predictiva del deterioro cognitivo posterior en los seres humanos. Aunque este método puede proporcionar información sobre el olfato, también se puede aplicar a otros sistemas, como la visión o la audición. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos iniciales tanto para configurar la cámara de comportamiento como para usar el software son difíciles de aprender, debido a los diferentes puertos de conexión y pasos de entrenamiento.
Para empezar, monta una cámara de ratón con suelo de cámara. Mantenga la caja de entrenamiento en un área de poco tráfico y poca luz para evitar distracciones. Luego, perfore cada puerto de agua con un pequeño orificio en la parte superior, para permitir que una aguja de calibre 18 dispense agua dentro del puerto.
Llene un frasco de vidrio con odorante disuelto en aceite mineral y apriete firmemente la tapa. A continuación, conecte una aguja de calibre 18 al tubo de silicona. Perfore la tapa del frasco de vidrio y conecte el otro extremo del tubo de silicona a la entrada de los puertos de olor.
Después de eso, coloque cada tubo de silicona en una válvula de olor. Conecte la línea de vacío a los puertos de olor. Conecte dos jeringas de 10 mililitros a una varilla de retención de metal y conecte el tubo a las jeringas.
Posteriormente, conecte el otro lado del tubo a una aguja de calibre 18. Coloque la aguja en el orificio perforado del puerto de pinchazo nasal en la cámara del mouse y conecte el otro extremo del tubo a la válvula de agua. Llene las dos jeringas de 10 mililitros con agua potable para roedores.
Luego conecte un medidor de flujo de aire a la entrada de aire y mantenga el flujo de aire de tres a cinco litros por minuto. Conecte las dos válvulas de agua, las dos válvulas de olor, los dos puertos de agua, el puerto de olor y la alimentación al sistema de interfaz USB. Y, por último, conecte la caja de interfaz USB a la alimentación.
A continuación, ajuste la succión al vacío para evitar la contaminación cruzada de olores entre ensayos, y utilice tubos específicos para el olor para conectar los viales de odorante a la cámara. Para preparar a los ratones para el entrenamiento, comience la restricción de agua a 40 mililitros por kilogramo por día. Pese a los ratones diariamente para asegurarse de que estén por encima del 80% del peso basal y mantenga todos los factores ambientales constantes durante todo el protocolo, incluida la temperatura, el ruido y los olores extraños.
Limpie la jaula antes de que cada ratón sea transferido a ella. Rocíe y limpie la cámara con etanol al 70% para minimizar la distracción del olor del ratón. Para el entrenamiento de la primera etapa, configure el cuadro de comportamiento con un puerto de agua en el centro y con todos los puertos laterales inaccesibles.
Coloque un ratón en la cámara y ciérrela. Luego, comience el programa de la etapa uno. Considere esta etapa como completa cuando el mouse logre 100 intentos en 60 minutos.
Retire el mouse de la cámara después de 60 minutos o se hayan completado 100 pruebas. Para el entrenamiento de la etapa dos, configure esta y todas las etapas posteriores con dos puertos de agua en los lados y el puerto de olor en el medio. Coloque un ratón en la cámara y ciérrela.
Luego, comience el programa de la segunda etapa. Considere esta etapa como completa cuando se realicen un mínimo de 40 pruebas en 60 minutos, con al menos el 25% de las recompensas de agua recibidas dentro de los cinco segundos posteriores al pinchazo de la nariz a babor central. Retire el mouse una vez que se haya completado esta etapa.
Para el entrenamiento de la etapa tres, conecte el olor S-plus al controlador de entrega de olores. Coloque un ratón en la cámara y ciérrela. Después, comienza el programa de la tercera etapa.
Considere esta etapa como completa cuando haya más de 60 recompensas en 60 minutos y retire el mouse una vez que la etapa haya competido. Para el entrenamiento de la etapa cuatro-A, establezca la configuración de la caja igual que la etapa tres anterior. A continuación, conecte el olor S-plus y S-minus al controlador de entrega de olores.
Coloque un ratón en la cámara y ciérrela. Luego, comienza el programa de la etapa cuatro-A. Después de que el ratón complete 40 pruebas, cambie el programa para que emita los olores de forma aleatoria.
Retire el mouse una vez que se haya completado la etapa. Para el entrenamiento de la etapa cuatro-B, haga que esta etapa sea idéntica a la etapa cuatro-A. Sin embargo, el castigo de tiempo fuera por intentar una recompensa de agua después de un olor S-menos es de cuatro segundos.
Conecte el olor S-plus y S-minus al controlador de entrega de olores. Coloque un ratón en la cámara. Cierre la cámara del ratón y comience el programa de la etapa cuatro-B.
Considere que esta etapa se ha completado cuando hay más de 100 ensayos en 60 minutos, con una precisión superior al 85%Para el ensayo de pasa/no pasa, establezca la configuración de la caja igual que la etapa anterior cuatro-B. Conecte el olor S-plus y S-minus al controlador de entrega de olores. Luego, coloque un mouse en la cámara.
Comience el programa de etapa pasa/no pasa y luego exponga al ratón que ha aprendido la tarea de aprendizaje olfativo a nuevos pares de olores químicamente similares. Una vez que los ratones han aprendido la tarea de aprendizaje olfativo, pueden asociar nuevos pares de olores con la recompensa y el castigo. Estos ratones entrenados normalmente comienzan con aproximadamente un 50% de precisión en la tarea de ir / no pasar.
El porcentaje correcto se puede trazar por bloque de prueba como una curva de aprendizaje para nuevos pares de olores. Dentro de 10 ensayos en bloque, los ratones son capaces de discriminar correctamente entre olores, con una precisión superior al 85%. Esto demuestra que nuestro protocolo ha entrenado con éxito a ratones de tipo salvaje para asociar un olor con una recompensa de agua y otro con un castigo de tiempo fuera.
Una vez que los ratones aprenden la tarea, los pares de olores se pueden modificar para aumentar o disminuir la dificultad de la tarea. Por ejemplo, la disminución de la concentración del par de olores aumenta la dificultad de la tarea. Los ratones también son capaces de recordar pares de olores previamente aprendidos.
Después de esperar siete días desde que aprendieron la tarea, una prueba de recuerdo muestra que los ratones de tipo salvaje pueden recordar rápidamente las asociaciones de olor aprendidas previamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe asegurarse de que los odorantes deseados estén conectados correctamente a la caja de comportamiento. Es especialmente importante si varios experimentadores están usando diferentes olores.
Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el mapeo de olores para responder preguntas adicionales como: ¿Cómo influye el aprendizaje en la forma en que el cerebro representa la información sensorial? Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran los cambios neuronales inducidos por el aprendizaje en el sistema olfativo del ratón. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo enseñar a los ratones a asociar un olor con una recompensa y otro olor con un castigo.
No olvide que trabajar con agujas afiladas puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como la eliminación adecuada de objetos punzantes al realizar este procedimiento.
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Resumen
Este estudio investiga la discriminación de olores mediante una tarea de aprendizaje asociativo en ratones, centrándose en los cambios estructurales inducidos por el aprendizaje en el cerebro. La técnica examina preguntas clave en neurociencia, como la discriminación sensorial y la plasticidad sináptica.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Olfacción
- Aprendizaje conductual
Antecedentes
- Los protocolos de aprendizaje asociativo son fundamentales para estudiar las funciones cognitivas.
- La discriminación de olores desempeña un papel crucial en el procesamiento sensorial de los mamíferos.
- Comprender el comportamiento olfativo en ratones podría relacionarse con el deterioro cognitivo humano.
- Este método puede adaptarse para otros sistemas sensoriales, como la visión y la audición.
Objetivo del estudio
- Entrenar a los ratones para asociar olores con recompensas y castigos.
- Explorar el procesamiento olfativo y sus implicaciones en enfermedades neurodegenerativas.
- Desarrollar un ensayo conductual robusto para el análisis estadístico del aprendizaje.
Métodos Utilizados
- Los ratones se entrenan utilizando una cámara de comportamiento configurada especialmente.
- El entrenamiento comprende varias etapas, evaluando la precisión en la discriminación de olores.
- No se mencionan flujos de trabajo de multiómica.
- Los pasos críticos incluyen la restricción de agua para controlar la motivación y los criterios de finalización de cada etapa.
- Los procedimientos incluyen la configuración minuciosa de los sistemas de entrega de olores y los protocolos de condicionamiento.
Resultados principales
- Los ratones aprenden con éxito a asociar diferentes olores con recompensas o castigos.
- El entrenamiento permite un alto muestreo estadístico mediante ensayos repetidos.
- La precisión en la discriminación de olores alcanza aproximadamente el 85 % tras el entrenamiento.
- Los resultados sugieren que el aprendizaje olfativo puede evaluarse eficazmente mediante este protocolo.
Conclusiones
- El protocolo demuestra un método confiable para estudiar el aprendizaje asociativo en la olfacción.
- Este enfoque puede ofrecer información sobre estrategias terapéuticas para enfermedades neurodegenerativas.
- Los hallazgos mejoran la comprensión de los mecanismos de discriminación sensorial en los mamíferos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la evaluación cuantitativa y de alto rendimiento del aprendizaje y la discriminación olfativa en ratones, proporcionando una lectura conductual robusta para la validación de dianas en el descubrimiento de fármacos en neurociencia. Al apoyar la reducción de riesgos mecanicistas de la función y plasticidad de los circuitos olfativos, orienta las pruebas de hipótesis en etapas tempranas para compuestos dirigidos a trastornos neurodegenerativos o del procesamiento sensorial. La reproducibilidad y escalabilidad del ensayo facilitan la alineación entre equipos de biología de descubrimiento e investigación traslacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas relacionadas con el aprendizaje olfativo, la plasticidad sináptica y los mecanismos de discriminación sensorial.
- Valor operativo: Apoya la reducción de riesgos biológicos mediante la cuantificación del aprendizaje por asociación de olores y la retención de la memoria en un sistema controlado y reproducible.
- Valor predictivo: Genera datos conductuales cuantitativos (por ejemplo, tasas de acierto, curvas de aprendizaje) que ayudan en la selección de proyectos y en las decisiones de continuar o descartar compuestos dirigidos al sistema nervioso central.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Listo para el ensayo: Genera sistemas biológicos validados (ratones entrenados) capaces de realizar cientos de pruebas automatizadas diariamente, lo que permite la evaluación confiable de compuestos.
- Normalización: Garantiza la reproducibilidad mediante controles estrictos del entorno, protocolos de restricción de agua y criterios de entrenamiento basados en etapas.
- Escalabilidad: Facilita un muestreo estadístico elevado y estudios longitudinales, apoyando la adaptación del ensayo para pruebas de respuesta a la dosis o a lo largo del tiempo.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Se alinea con la disfunción olfativa humana como biomarcador predictivo del deterioro cognitivo, apoyando la continuidad traslacional desde modelos murinos hasta la evaluación clínica de riesgo.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Permite estudiar la supervivencia neuronal y la plasticidad dependientes de la actividad, vinculando el comportamiento con lecturas bioquímicas, electrofisiológicas o de imágenes posteriores.
- Avance ajustado al riesgo: Apoya las decisiones sobre los efectos del compuesto en los cambios neuronales inducidos por el aprendizaje, reduciendo el riesgo biológico en etapas tardías en programas sensoriales o neurodegenerativos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación inicial del blanco hasta la validación preclínica, especialmente para proyectos centrados en el procesamiento olfativo, la discriminación sensorial o los mecanismos de enfermedades neurodegenerativas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al medir cómo el aprendizaje olfativo altera la estructura y función neuronales.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles (precisión en los ensayos, curvas de aprendizaje) que permiten la comparación entre condiciones experimentales o modelos genéticos.
- Análisis: Ofrece curvas de aprendizaje estadísticas y umbrales de discriminación que ayudan a los equipos a evaluar los efectos de compuestos sobre el procesamiento sensorial y la memoria.
- Investigación Translacional: Se conecta con la validación preclínica mediante la alineación con biomarcadores olfativos humanos predictivos del deterioro cognitivo.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma conductual reutilizable para pruebas iterativas con múltiples compuestos, genotipos o manipulaciones ambientales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas al reducir la ambigüedad mecanicista en las vías de aprendizaje y plasticidad olfativa.
- Valor operativo: Proporciona estandarización, reproductibilidad y escalabilidad mediante la realización automatizada de ensayos y controles procedimentales estrictos.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la reducción temprana de riesgos en dianas del sistema nervioso central y disminuir el riesgo de fracaso en etapas posteriores.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de compuestos basada en sus efectos sobre el aprendizaje, la memoria y la discriminación sensorial.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en neurociencia conductual, anatomía del sistema olfativo y técnicas de condicionamiento operante.
- Depende de instrumentación especializada que incluye sistemas de entrega de olores, válvulas de agua, líneas de vacío y controladores de interfaz USB.
- Necesita la estandarización entre equipos de los controles ambientales (olor, ruido, temperatura) y de los protocolos de entrenamiento para garantizar la reproducibilidad.
- Implica consideraciones de adaptación al transferir protocolos entre cepas de ratones, edades o propiedades fisicoquímicas de los odorantes.
- Incluye limitaciones prácticas como la complejidad del montaje, riesgos de agujas y la necesidad de un manejo constante de los animales para evitar distracciones o factores de confusión por estrés.
