Name: Protocolos de fabricación (EcoFAB) del ecosistema para la construcción de ecosistemas de laboratorio diseñado para estudiar las interacciones planta-microorganismo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Aprende a construir dispositivos EcoFAB mediante impresión 3D para estudiar interacciones planta-microorganismo en laboratorio. Este protocolo estandarizado permite análisis de morfología radicular y espectrometría de masas con aplicaciones en agricultura sostenible.

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Este trabajo fue financiado por el programa de laboratorio dirigido investigación y desarrollo (LDRD) del laboratorio nacional de Lawrence Berkeley apoyado por la oficina de ciencia del Departamento de energía estadounidense bajo contrato no. DE-AC02-05CH11231 y un premio DE SC0014079 de los Estados Unidos Departamento de energía oficina de ciencia en Berkeley UC. Trabajo en la fundición Molecular fue financiado en los Estados Unidos Departamento de energía contrato no. DE-AC02-05CH11231. También agradecemos a Suzanne M. Kosina, Katherine Louie, Benjamin P. Bowen y Benjamin J. Cole en el laboratorio nacional Lawrence Berkeley por su ayuda.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los protocolos registrados aquí para que uso de fabricación de ecosistema para crear que ecofabs proporciona recursos comunitarios para planta sistemática estudios de biología en condiciones muy controladas de laboratorio. Avances en la impresión 3D proporcionan tecnologías ampliamente accesibles para construir y refinar iterativamente EcoFAB diseños. La cámara de raíz presentada aquí se encuentra bien adaptada para la microscopia de la proyección de imagen y mantenimiento de esterilidad, permitiendo la adición controlada de microbios para investigar interacciones planta-microorganismo. La plataforma de EcoFAB es compatible con varias especies de plantas. Es importante reconocer los efectos fisiológicos de las plantas dentro de la cámara de raíz estrecha de crecimiento tal que experimentos adicionales se requerirá para generalizar los resultados a plantas que crecen en ambientes naturales.
El uso de cámaras estériles y LED crece la luz permite la investigación de los efectos de diversas condiciones de luz, incluyendo longitud de onda, intensidad y duración, el crecimiento de las plantas y los parámetros fisiológicos relacionados en paralelo. Cámaras de raíz de Unión reversible permiten el uso de sustratos sólidos, así como espacial recoger muestras sólidas para el análisis bioquímico y genético. Las aplicaciones de substratos sólidos, tales como suelos, arena y granos de cuarzo, ofrecen las posibilidades de utilizar EcoFABs para crear ecosistemas de laboratorio más ecológicamente pertinentes. Sin embargo, todos los sistemas presentados aquí uso líquido saturado (cultivos hidropónicos) que no son un reflejo preciso de la mayoría de suelos y será importante seguir perfeccionando estos diseños para mantener bolsas de aire en el suelo que mejor representan suelos naturales.
Se describe el uso de simples cámaras y microscopios para el desarrollo de la morfología del sistema radicular imagen a ambos a granel a niveles celulares. Esta aptitud para la proyección de imagen de morfología raíz monitoreo y cuantificación probablemente será útil para la comprensión de los mecanismos de regulación de señales de planta fisiológica y molecular desencadenadas por adaptaciones genotípicas de planta a las condiciones de crecimiento. Sin embargo, una limitación para el estudio de desarrollo de la raíz fisiológica es la colocación horizontal actual del dispositivo EcoFAB. En ambientes naturales, la respuesta de raíces gravitrópico conduce a un desarrollo predominantemente vertical del sistema radical. Así, el sistema horizontal presentado aquí probablemente difiere en algunos de los factores de un ambiente natural, y la fabricación de sistemas de EcoFAB con colocación vertical de la cámara de la raíz es un objetivo deseable para futuras versiones de EcoFAB. Aunque los dispositivos actuales de EcoFAB se colocan horizontalmente, el análisis de parámetros de morfología de raíz en varias condiciones, o en respuesta a microbios, es posible. Proyección de imagen de alta resolución se puede aplicar para captar la dinámica de colonización de raíces de aislamientos individuales o comunidades, proporcionando información acerca de que las plantas son colonizadas piezas en varias condiciones deficientes y suficientes nutrientes. Se prevé que dichos estudios proporcionen importantes nuevas ideas sobre cómo se construyen planta microbiomes, y cómo estas dinámicas cambian con el tiempo, por ejemplo como las raíces se desarrollan.
Dispositivos microfluídicos permiten proyección de imagen de plantas muy jóvenes, y la cantidad de metabolitos recogidos no es generalmente suficiente para el análisis LCMS. Sistemas basados en tierra, como rhizotrons, permiten la proyección de imagen de la morfología de la raíz cuando las plantas de ambos se transforman con construcción quimioluminiscente (Glo-root) o con métodos de NMR33,34. Extracción de metabolitos de estos sistemas es lentos debido a la gran volumen de muestras. EcoFABs son una combinación de ambas: la fabricación es similar a los dispositivos microfluídicos. EcoFABs fueron diseñados para ser simple y barato de reproducir, pero el tamaño de la cámara puede ajustarse para cultivar plantas con sistema radicular pequeño o grande, hasta sus etapas reproductivas. Observaciones simultáneas de los cambios de morfología de raíz y exudación de la raíz son posibles. El sistema es estéril, lo que permite la adición controlada de microbios específicos.
EcoFABs están diseñados para permitir la introducción controlada y toma de muestras de microbios y metabolitos. En concreto, las muestras recogidas de cámaras de crecimiento de la raíz se encuentran suficiente para perfilar metabolitos masa espectroscópica. La integración de la proyección de imagen de espectrometría de masas (e.g., NIMS técnica presentada aquí) proporciona un enfoque no-destructivo de estudiar la distribución espacial de metabolito de sistemas de la raíz. Esta técnica será útil en el futuro estable isótopo seguimiento experimentos y localización microbiana asignación a metabolitos específicos36. Si bien este protocolo se ha centrado en solo aislados, el mismo diseño puede utilizarse sin duda para comunidades más complejas. Los volúmenes de muestra y la biomasa dentro de la EcoFABs son probablemente más que suficiente para la mayor integración con tecnologías de secuenciación de ADN, que será importante para la caracterización y monitoreo de comunidad microbiana estructura y expresión genética.
En conclusión, este protocolo detalla la fabricación de los ecosistemas de laboratorio diseñado para la investigación de las interacciones planta-microorganismo, con énfasis en los métodos simples y accesibles que puede ser fácilmente implementado y extendido por los investigadores de todo el mundo. Los esfuerzos actuales se dirigen a demostrar la reproducibilidad entre laboratorios y la integración de un sistema de control de temperatura tal que cada EcoFAB independientemente habrá controlado por luz y temperatura. Un avance más del sistema será la integración del muestreo automatizado y llenado de las cámaras de EcoFAB raíz y el desarrollo de protocolos reproducibles para el establecimiento de planta correspondientes microbiomes dentro de EcoFABs.

La aplicación de microbios beneficiosos de la planta en la agricultura ofrece gran potencial para incrementar la producción de biocombustibles para proporcionar para una creciente población1,2,3,4y sostenible de alimentos. Una cantidad significativa de trabajo apoya la importancia de la planta microbiomes en absorción de nutrientes de la planta, tolerancia a las tensiones y la resistencia a la enfermedad5,6,7,8. Sin embargo, es difícil investigar los mecanismos de las interacciones planta-microorganismo en los ecosistemas de campo debido a la complejidad e irreproductibilidad asociada y la incapacidad para controlar precisamente la composición del microbioma y genética (por ej., usando mutantes microbianos)4,9,10.
Una estrategia es construir ecosistemas modelo simplificado para permitir controlados, experimentos de laboratorio repetidos investigar interacciones planta-microorganismo para generar ideas que pueden analizarse más en el campo10,11, 12. Este concepto se basa en los enfoques tradicionales de uso de las plantas cultivadas en macetas llenas de tierra o en placas de agar dentro de invernaderos o incubadoras13. Aunque estos probablemente serán siendo el más ampliamente utilizado enfoques, carecen de la capacidad para precisamente controlar y manipular entornos de crecimiento de la planta. Para estos fines, rhizoboxes y rhizotrons representan una gran mejora en la capacidad de estudiar procesos subterránea14,15y primeros protocolos fueron publicados para el análisis de metabolitos de la rizosfera en el suelo16. Más recientemente, para permitir el análisis de alto rendimiento, dispositivos microfluídicos avanzado13,17 como Chip de planta18,19, RootArray20RootChip21, han sido desarrollado como herramientas eficaces para el fenotipado de la planta con resolución espacial de la escala del micrómetro para supervisar las primeras etapas de crecimiento de la planta pequeña modelo Arabidopsis thaliana en medio líquido. Una plataforma de proyección de imagen de dos capas fue descrita recientemente, que permite la proyección de imagen de pelo de la raíz de Arabidopsis thaliana en plántula con una plataforma de microfluidos22.
Aquí, protocolos detallados para la construcción de aparatos de laboratorio controlados (EcoFABs) son siempre, para el estudio de las interacciones microbio de planta y mostrar que pueden ser utilizados para el estudio de diversas plantas como Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon23, la importancia ecológica Avena Silvestre Avena barbata y los cultivos de bioenergía Panicum virgatum (virgatum). EcoFAB es una plataforma de crecimiento de la planta estéril que incluye dos componentes principales: el dispositivo de EcoFAB y envase transparente estéril tamaño de planta. Capas de EcoFAB dispositivo está hecho de un polidimetilsiloxano (PDMS), proceso que implica la fundición PDMS de fabricación de un molde plástico impreso 3D y capas PDMS en portaobjetos usando métodos anteriormente la vinculación registrados24,25 . Los procedimientos detallados de EcoFAB flujo de trabajo, tales como fabricación de dispositivo, esterilización, germinación de la semilla, trasplante de la plántula, microbio inoculación/cocultivation, preparación de muestras y análisis, se describen en el presente Protocolo (figura 1). Otras modificaciones del flujo de trabajo básico se describen, incluyendo la instalación de la computadora controlada llevó las luces grow y la utilización de sustratos sólidos. La utilización de técnicas para investigar la morfología de la raíz de imagen cambia, la colonización microbiana de las raíces, y la proyección de imagen espectroscópica masa de exudados de la raíz se describen. Esperamos que el diseño simple, barato, basado en materiales fácilmente disponibles, así como los protocolos detallados presentados aquí, convertirá la plataforma EcoFAB en un recurso comunitario, estandarizar los estudios de laboratorio planta microbioma.

<table><tbody><tr>Archivos STL <td>de molde personalizado LBNL</td><td></td><td></td> impresos en 3D <td>disponibles aquí www.eco-fab.org; Los moldes EcoFABs descritos aquí fueron impresos por FATHOM: http://studiofathom.com</td></tr><tr><td>Dow sylgard 184 kit transparente de elastómero de silicona</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Pulverizador de aire</td><td>VWR</td><td>75780-350</td><td>cualquier pulverizador de gas comprimido debería funcionar</td></tr><tr><td>aguja roma de calibre 15</td><td>VWR</td><td>89166-240</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 5 ml con punta Luer-Lok VWR BD309646</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3" x2" portaobjetos de vidrio para microscopio</td><td>VWR</td><td>48382-179</td><td></td></tr><tr><td>1.75" x 2.56" x 3.56" Caja EcoFAB</td><td>Amazon</td><td>B005GAQ25Q</td><td></td></tr><tr><td>4" x 3 &frac14; &rdquo; portaobjetos de vidrio para microscopio</td><td>Ted Pella</td><td>260231</td><td></td></tr><tr><td>caja EcoFAB de 4.87" x 4.87" x 5.50" Limpiador de</td> plasma <td>Amazon</td><td>B00P9QVOS2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Pinza personalizada impresa en 3D</td><td>LBNL</td><td></td><td>Archivos STL disponibles en el laboratorio de Trent Northen</td></tr><tr><td>Campana estéril</td><td>Sistemas AirClean Estaciones</td><td>de trabajo de PCR de la serie AC600</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de jeringa de PTFE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z117315-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>89125-172</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige y Skoog (MS) Base de sal de macronutrientes</td><td>Laboratorios de fitotecnologías</td><td>M502</td><td></td></tr><tr><td>Murashige y Skoog (MS) Base de sales de micronutrientes</td><td>Laboratorios de fitotecnologías</td><td>M554</td><td></td></tr><tr><td>Suelo</td><td>Hummert International</td><td>Pro-Mix PGX</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71010-52-1</td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana</td><td>Semillas de Lehle</td><td>WT-24 Col-4 Columbia tipo</td><td></td>salvaje</tr><tr><td>Brachypodium distachyon</td><td>LBNL</td><td>Línea estándar Bd-21</td><td>Disponible en el laboratorio de John Vogel</td></tr><tr><td>Panicum virgatum</td><td>La Fundación Samuel Roberts Noble</td>Cinta de microporos <td>Alamo switchgrass</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>56222-182</td><td></td></tr><tr><td>Metanol de grado LC-MS</td><td>VWR</td><td>JT9830-3</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>LABCONCO</td><td>FreeZone 2.5 Plus</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVAC</td><td>Thermo Scientific</td><td>Savant&trade; SPD111 SpeedVac</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-MC GV Filtro centrífugo-0.22 y micro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de cromatografía líquida</td><td>Agilent Agilent</td><td>1290 LC system</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive espectrómetro de masas</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q Exactive&trade; Chip híbrido Quadrupole-Orbitrap MS</td><td></td></tr><tr><td>NIMS y placa MALDI personalizada</td><td>LBNL</td><td>Para obtener información detallada sobre el protocolo, consulte: doi:10.1038/nprot.2008.110</td>Espectrómetro de masas MALDI AB SCIEX TOF/TOF 5800 MALDI MS Tira de luz de cultivo LED nanorrecubierta LED World Lighting HH-SRB60F010-2835 Fuente de alimentación LED World Lighting MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Controlador TC420</td><td>Amazon</td><td>B0197U7R8Q</td><td></td></tr><tr><td>Clips LED de silicona</td><td>Amazon</td><td>B00N9X1GI0</td><td></td></tr><tr><td>Pistola de pegamento caliente</td><td>Amazon</td><td>B006IY359K</td><td></td></tr><tr><td>Cable conector LED hembra a desnudo</td><td>LED World Lighting</td><td>HH-F05</td><td></td></tr><tr><td>Cable de extensión de conector LED hembra a macho</td><td>LED World Lighting</td><td>HH-MF1</td><td></td></tr><tr><td>Cable de 2 hilos 20AWG</td><td>LED World Lighting</td><td>6102051TFT4</td><td></td></tr><tr><td>WAGO 221-415 Conector de empalme</td><td>LED World Lighting</td><td>221-415</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolos de fabricación (ecofab) del ecosistema para la construcción de ecosistemas de laboratorio diseñado para estudiar las interacciones planta-microorganismo

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Interacciones Beneficiosas Planta-Microogranismo ofrecen una solución biológica sostenible con potencial para impulsar la producción de alimentos y bioenergía de bajos insumos. Una mejor comprensión mecanicista de estas interacciones planta-microorganismo complejo serán crucial para mejorar la producción de planta como ecológica así como desempeño básico estudia investigar interacciones planta-microorganismo suelo. Aquí, se presenta una descripción detallada para la fabricación de ecosistema, usando tecnologías de impresión 3D ampliamente disponibles, crear hábitats controladas de laboratorio (EcoFABs) para el estudio de mecanismos de interacciones planta-microorganismo en específico ambiental condiciones. Dos tamaños de EcoFABs se describen que son adecuados para la investigación de las interacciones microbianas con varias especies de plantas, como Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyony Panicum virgatum. Estos dispositivos a través de flujo permiten control manipulación y muestreo de raíz microbiomes, química de la raíz así como proyección de imagen de la morfología de la raíz y localización microbiana. Este protocolo incluye los detalles para mantener las condiciones de esterilidad dentro de EcoFABs y montaje independiente sistemas de iluminación LED en EcoFABs. Métodos detallados para la adición de diferentes formas de medios de comunicación, incluyendo suelos, arena y medios de cultivo líquidos junto a la caracterización de estos sistemas usando proyección de imagen y metabolómica se describe. Juntos, estos sistemas permiten la investigación dinámica y detallada de la planta y consorcios microbianos planta incluyendo la manipulación de la composición del microbioma (incluyendo mutantes), el monitoreo del crecimiento de la planta, morfología de la raíz, composición del exudado, y localización microbiana bajo condiciones ambientales controladas. Esperamos que estos protocolos detallados servirá como un importante punto de partida para otros investigadores, idealmente, ayudar a crear sistemas experimentales estandarizados para la investigación de interacciones planta-microorganismo.

Cada sistema de EcoFAB incluye un dispositivo de EcoFAB y una planta de tamaño de envase de plástico transparente. Un dispositivo de EcoFAB tiene un embalse de la central, una cámara de crecimiento de la raíz, una entrada de flujo de 1,6 mm y una salida de 1,6 mm para dispositivo de EcoFAB estándar (Figura 2D y figura 3 H) o una salida de 10 mm para dispositivo de EcoFAB toda la salida (figura 2F y figura 3I ). El embalse de la central está diseñado en forma de trapecio que tiene una abertura superior de 6 mm y el inferior abertura de 3 mm, y este diseño reduce la posibilidad de fugas de flujo durante la inyección del líquido y también garantiza suficiente espacio para el crecimiento vegetal. La cámara de crecimiento de la raíz adopta una forma ovalada con profundidad de 2 mm para adaptarse a sistemas de la raíz de muchas de las plantas de la modelo, como se muestra en la figura 2 y E. Canales de entrada y salida de un dispositivo estándar de EcoFAB pueden ser conectados con tubería de PTFE para que soluciones nutritivas pueden fluir en la cámara de crecimiento de la raíz sin necesidad de abrir el envase de EcoFAB. El dispositivo de EcoFAB toda salida grandemente reduce la resistencia del flujo de la salida y se usa preferentemente al cultivo de plantas con sistemas de raíz gruesos o exudados de la raíz que periódicamente recoge después de complejos sistemas de la raíz se derivan de las plantas.
Los moldes de la fundición para la fabricación de capas PDMS de EcoFAB dispositivos se crean en un software de diseño, y luego 3D impreso en fotopolímeros opacos rígidos, como se muestra en la figura 2 y figura 3. Plantas de interior de EcoFABs pueden observarse directamente con un microscopio con una distancia de trabajo larga, asegurando que la esterilidad crece entorno (figura 8A, Archivo adicional 1). EcoFAB dispositivos con plantas también pueden caber en un escenario de microscopio de alta resolución que permite mayor resolución la proyección de imagen de interacciones planta-microorganismo (figura 8B, Archivo adicional 2). Esterilidad no se mantiene en este entorno, y proyección de imagen de alta resolución por lo tanto sólo es apto para mediciones de punto final.
EcoFABs están diseñados para permitir estudios sistemáticos de las plantas, como su morfología, metabolismo y las comunidades microbianas en sus diferentes etapas de crecimiento a través de sus ciclos de vida. Aquí, EcoFABs se analizaron como una plataforma general para estudiar una variedad de especies de plantas. Figura 8 -E muestra 7 - viejo thaliana de Arabidopsis, Brachypodium distachyony Panicum virgatum en EcoFABs. Todas las tres plantas se encontraron que crecen bien en el EcoFAB para más de un mes. Tanto la dicotiledóneas, Arabidopsis thaliana y la monocotiledóneas, Brachypodium distachyon fueron encontrados a la altura de sus etapas de reproducción en el EcoFABs.
Reversible sistema de sellado permite el uso de sustratos sólidos (ej., suelo) dentro de la EcoFABs (criterio 2.2). Este enfoque de sellado permite la carga de sustratos sólidos en cámaras de crecimiento de la raíz y reversible también permite la recogida de muestras de regiones específicas de la rhizospheres de la raíz. Figura 8F -H muestra un grupo de 14 días de edad Brachypodium distachyon creciendo en medio hidropónico, así como arena y tierra con medio hidropónico (arena) y agua (suelo). La capa delgada de sustrato sólido en cámaras de crecimiento de la raíz permite que la luz que penetran a través de la proyección de imagen microscópica del sistema radicular.
Morfología de la raíz se define como la configuración espacial y distribución de un sistema de raíces de la planta y ha sido aprobado como una respuesta de fisiología esenciales para ambientes de crecimiento diversos, tales como agua o nutrientes disponibilidad32,33, 34. EcoFABs proporcionan un método conveniente de estudiar la morfología de la planta con el tiempo o bajo diferentes condiciones de nutrientes. Figura 9A-F muestran un ejemplo de uso de EcoFABs para morfología de la raíz de Brachypodium distachyon de pista en las primeras tres semanas. Una plántula de Brachypodium distachyon fue transferida en el dispositivo de EcoFAB, y su estructura de raíz fue grabado por una cámara dentro de un formador de gel BIO-RAD. Programa de procesamiento de imagen, como imagen J, python y matlab, puede aplicarse además para cuantificar los cambios de la morfología de la raíz con el tiempo o en diferentes medio ambientes. La cuantificación del área total de la raíz a lo largo de tres semanas demostró un aumento gradual en la etapa temprana (&lt; 1 semana) seguido de una tendencia de crecimiento lineal hasta el final de tres semanas, como se muestra en la figura 9.
Una motivación primaria para la construcción de la EcoFAB es investigar interacciones planta-microorganismo. Como se describe en el paso 5.4, los microorganismos se transfieren en cámaras de crecimiento de la raíz de EcoFAB dispositivos a través del canal de entrada. La figura 10 muestra, una EcoFAB contiene Pseudomonas simea (anteriormentefluorescens) WCS417 (WCS417), un crecimiento de la planta promoción de rizobacterias con etiquetas quimioluminiscente, fue agregado en los sistemas de raíz de planta con una concentración de 106 células por planta. La señal WCS417 se detectó con un formador de gel, que indica una distribución espacial distinta de microbios WCS417 en cámaras de crecimiento de la raíz. En tanto medio líquido MS con y sin sustrato sólido arena, WCS417 microbios colonizaron las superficies de todo el sistema de raíz con los microbios que se concentró alrededor de las áreas de punta de raíz, posiblemente debido a la producción de nutrientes activa de ápices (figura 10 &amp; H)35. Por otra parte, los microbios WCS417 en sustrato de suelo acumulan en la región del embalse de planta en lugar de ápices (figura 10). Como los microbios fueron agregados a través del canal de salida, los microbios también fueron capaces de moverse en el sustrato suelo, pero no acumulan en la raíz, como se observa en medio líquido con o sin arena. Esto podría indicar que el suelo es una fuente suficiente de nutrientes, y los microbios emigraron al depósito de planta para las condiciones óptimas de respiración.
Para estudiar el perfil de metabolitos de exudados de raíces de la planta, así como la absorción de metabolitos y liberar de interacciones planta-microorganismo, las soluciones de exudado de las cámaras de crecimiento de la raíz fue recogida a través de varias etapas de crecimiento de plantas en EcoFABs. Como se describe en el paso 6, luego se extrajeron muestras de exudado para el análisis por LC-MS. Usando este método, se detectó una serie de metabolitos exudada por la planta y consumidos por los microbios, y el perfil de metabolitos relacionados de exudados de raíces con y sin colonización por microbios está actualmente bajo investigación.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig1.jpg"> Figura 1: flujo de trabajo de EcoFAB la. Plantas son germinadas en placa y transferidas a esterilizada EcoFAB, microbios pueden agregarse. Muestreo no destructivo: exudados de la raíz pueden ser muestreados y reflejadas, y se puede visualizar la morfología de la raíz. Muestreo destructivo permite análisis de microbio, raíz y brote parámetros en detalle.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig2.jpg"> Figura 2: componentes de 3D impresión moldes para la fabricación del dispositivo de EcoFAB. (A) superiores e inclinados vistas de un bastidor de fundición. (B) inclinado y superiores vistas un inserto. (C) superior e inclinados vistas de una base de molde estándar. (E) superiores e inclinados vistas de una base de salida de todo el molde. (D, F) Montado moldes para la fabricación de dispositivos de EcoFAB estándar y toda la salida, respectivamente. Las dimensiones ovales son 51 mm x 34 mm para el molde pequeño de EcoFAB y 76 x 62 mm para el molde grande de EcoFAB. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig3.jpg"> Figura 3: fabricación de dispositivo de EcoFAB. (A) verter la mezcla del agente de curado y base de elastómero en el molde. (B) calentar el molde con la mezcla a 85 ° C por 4 h. (C) retirar el relleno del molde. (D) separar el PDMS de la estructura del bastidor. (E) empuja el molde base del marco de fundición. (F) utilizando un cuchillo para separar el molde a lo largo de los bordes de los PDMS. (G) peeling de la capa PDMS lentamente de la base del molde. Agujeros de empujar (H) para los canales de entrada y salida de la capa estándar de PDMS. () Meter un agujero para el canal de la entrada de la capa PDMS de ancho de salida. Capa (J) el PDMS (hecho de un elastómero de 15:1 base para mezcla de agente de curado) y un portaobjetos de microscopio son enjuagadas y transferidos en un plasma limpiador para la vinculación. (K) usar abrazaderas para sujetar la capa PDMS (hecha de una base de elastómero de 5:1 para mezcla de agente de curado) sobre un portaobjetos de microscopio. (L) Presionar la capa PDMS (hecha de una base de elastómero de 30: 1 para mezcla de agente de curado) directamente sobre un portaobjetos de microscopio. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig4.jpg"> Figura 4: el diseño de medida abrazaderas. (A) vistas superiores e inclinadas de una tapa abrazadera placa. (B) vistas un fondo inclinadas y superiores Sujete la placa. (C) superior y vistas inclinados de abrazadera montada con cuatro juegos de tornillos de cabeza hexagonal. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig5.jpg"> Figura 5: instalación de LED crecen luces. (A) marcado hacia fuera las localizaciones para 9 clips de LED en una espiral alrededor del contenedor de EcoFAB. (B) clips el LED conexión al contenedor de EcoFAB. (C) enhebrar una tira de LED a través de estos clips. (D) conectar la tira de LED a un regulador conectado a una fuente de alimentación de 24V. (E) el esquema de conexiones de cables al controlador. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig6.jpg"> Figura 6: transferencia de plántulas en EcoFABs. (A) plantas de Brachypodium distachyon cultivadas durante 2 días en una placa de 0,5 MS. (B) llenado de la cámara de raíz con medio de crecimiento de la planta. (C) utilizando una pinza para insertar cuidadosamente la raíz en el embalse de la central. (D) sellado con cinta de microporo, el contenedor de EcoFAB después de agregar 3 mL de agua en el fondo del recipiente. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig7.jpg"> Figura 7: imagen del NIMS de planta raíces en EcoFABs. (A) Brachypodium distachyon creciendo en un EcoFAB estéril. (B) colocación de la capa PDMS con la planta en un chip de NIMS para 20 minutos (C) usando cobre cinta sujetar el chip NIMS en un plato personalizado de MALDI y cargar en un espectrómetro de masas MALDI. (D-G) 7 días - el viejo y uno 20 días de edad Brachypodium distachyon planta utilizada para la proyección de imagen del NIMS (D, E) y las correspondientes imágenes de NIMS (F, G). Los iones predominantes fueron resaltados en rojo, verde y azul. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig8.jpg"> Figura 8: los usos generales de EcoFABs. (A) directamente capturar el crecimiento de las raíces de Brachypodium distachyon en un EcoFAB con una configuración de microscopio de larga distancia. (B) directamente observar interacciones microbio de raíz con la instalación de un microscopio de alta resolución. 7 - viejo (C-E) de Arabidopsis thaliana (C), Brachypodium distachyon (D) y Panicum virgatum (E) en medio hidropónico de 0,5 MS, (F-H) 14 días de edad Brachypodium distachyon cultivados en hidroponía de 0,5 MS (F), en la arena (G) y suelo (H) sustrato suministrado con medio de 0,5 MS y agua, respectivamente. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig9.jpg"> Figura 9: uso de EcoFABs para estudiar la morfología de la raíz. (A-F) Desarrollo de las raíces de Brachypodium distachyon creciendo en EcoFABs llena de medio de 0,5 MS durante las tres primeras semanas: (A) 2 días, (B) 4, (C) 7 días, (D) 11 días, e 14, f 21 días de crecimiento. (G) las superficies de la raíz promedio se estimaron por el software ImageJ. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig9large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig10.jpg"> Figura 10: usando EcoFABs para estudiar las interacciones de la raíz-microbio. (A, B, C) Un grupo de 15 días de edad Brachypodium distachyon colonización con Pseudomonas fluorescens WCS417 en diversas formas de medios MS líquidos sustratos solución, arena y tierra. (D, E, F) Imágenes de campo claro de sus sistemas de raíces. (G, H, I) Las correspondientes imágenes quimioluminiscente de estos sistemas de la raíz después de la cultivación conjunta de 14 días. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig10large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo complementario 1. Uso de EcoFAB para capturar el crecimiento de la raíz. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/video1_capture_growing_roots_(2).mp4">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 2. Uso de EcoFAB capturar interacciones de raíz-microbios. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/video2_capture_root_microbes_interaction.avi">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este artículo describe protocolos detallados para la fabricación de ecosistema de dispositivos (EcoFABs) que permiten a los estudios de las plantas y las interacciones planta-microorganismo en condiciones muy controladas de laboratorio.

Protocolos de fabricación (EcoFAB) del ecosistema para la construcción de ecosistemas de laboratorio diseñado para estudiar las interacciones planta-microorganismo

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

El objetivo general de este protocolo es definir enfoques estandarizados para la construcción de ecosistemas de plantas modelo simplificados, llamados EcoFABs, que permitan experimentos de laboratorio controlados y replicados para investigar las interacciones de los microbios de las plantas que puedan probarse más a fondo en el campo. Este método se puede utilizar para estudiar las interacciones de los microbios de las plantas en entornos controlados, lo que nos permite obtener información mecanicista detallada sobre las funciones de los microbiomas para poder aprovecharlos para la agricultura sostenible. Ayudamos a diseñar este primer Eco-FAB, que emplea una variedad de tecnologías de impresión 3D disponibles y a esterilizar las cámaras de crecimiento de las plantas que permiten tanto imágenes de alta resolución como análisis químicos que no distraen.El dispositivo Eco-FAB desarrollado aquí es muy adecuado para el análisis de las interacciones de los microbios de las plantas, ya que incorpora el análisis de la morfología de las raíces y las imágenes espectroscópicas de masas. Después de la construcción de moldes Eco-FAB, utilizando impresión 3D según el protocolo de texto, en un recipiente desechable de un litro, mezcle 40 mililitros de base de elastómero de siloxano con diferentes volúmenes de agente de curado, según el experimento. Coloque el recipiente en una cámara de vacío durante al menos 30 minutos para eliminar las burbujas de aire de la mezcla de elastómeros.A continuación, retira la mezcla y viértela en el molde de plástico impreso en 3D montado. Para generar una capa uniforme de PDMS, las burbujas de aire deben eliminarse cuidadosamente. Use aire comprimido para soplar cualquier residuo de aire después de transferir la mezcla al molde.Mantenga el molde en un bloque calefactor a 85 grados centígrados durante cuatro horas. Deja que el molde se enfríe durante cinco minutos. Luego, saque suavemente el inserto del molde y use un cuchillo multiusos para separar lentamente el PDMS del marco de fundición.Presione la base del molde con PDMS hacia arriba fuera del marco de fundición. Luego, use un cuchillo u otras herramientas para separar suavemente la capa de PDMS de la base del molde en los bordes y despéguela lentamente de la superficie del molde. Con una aguja roma de calibre 15, cree un canal de entrada en las capas de PDMS haciendo agujeros de 1,6 milímetros en esa parte.A continuación, utilice unas tijeras para recortar los bordes de las capas PDMS. Para unir permanentemente las capas de PDMS a los portaobjetos del microscopio, use metanol para enjuagar el lado de unión de la capa de PDMS en un portaobjetos de microscopio de 7,6 por cinco centímetros, y luego séquelas con aire comprimido o una pistola de nitrógeno ultrapuro. Coloque el portaobjetos del microscopio y la capa de PDMS en un limpiador de plasma con los lados de unión hacia arriba.Cierre la cámara y la válvula de ventilación de gas. Luego, encienda la aspiradora y bombee la cámara durante un minuto. Encienda el generador de plasma y cambie la frecuencia de radio, o el nivel de RF, a alto durante un minuto.A continuación, apague la bomba de vacío y la alimentación de plasma, y ventile la cámara a la atmósfera. Saque el portaobjetos del microscopio y la capa de PDMS de la cámara de plasma y presione rápidamente los cuatro bordes de la capa de PDMS sobre el portaobjetos con una presión uniforme. Asegúrese de que la región ovalada central, que es la cámara de la raíz, no toque el portaobjetos.Con agua ultrapura, enjuague los dispositivos Eco-FAB. Coloque un dispositivo Eco-FAB en un recipiente Eco-FAB y agregue 70% de etanol hasta que el dispositivo se sumerja. Luego, cierre la tapa del recipiente y agítelo suavemente para humedecer todas las superficies del interior con etanol, asegurándose de que la cámara de crecimiento de las raíces del dispositivo Eco-FAB esté llena de etanol, con muy pocas o ninguna burbuja de aire.Después de incubar los dispositivos a temperatura ambiente durante 30 minutos, vierta el etanol al 70% y reemplácelo con etanol al 100%. Luego, incuba los dispositivos durante cinco minutos. Después de la incubación, escurra el etanol y deje el Eco-FAB esterilizado en una campana de flujo laminar durante 16 horas para que se seque por completo.Si está disponible, esterilice el sistema encendiendo la luz ultravioleta en la campana durante una hora. Para llevar a cabo la esterilización y germinación de las semillas, remoje las semillas en etanol al 70% durante dos minutos. Luego, con una pipeta, retire el etanol y use agua estéril para enjuagar las semillas tres veces.A continuación, remoje las semillas en una solución de lejía al 10% durante cinco minutos. Luego, retira la solución de lejía y usa agua estéril para lavar bien las semillas tres veces. Después de los lavados, agregue agua estéril a las semillas e incube el tubo a cuatro grados centígrados durante siete días.Extienda uniformemente las semillas en 0,5 Murashige y Skoog, o MS medium, con 0,6% de vitagel. Y con cinta adhesiva de microporos, selle las placas. Luego, cultive las plantas hasta una longitud de raíz de aproximadamente cinco mililitros.Para transferir las plántulas a los Eco-FAB, utilizando una jeringa estéril o una micropipeta y agua estéril, enjuague la cámara de la raíz de un dispositivo Eco-FAB tres veces y luego llene la cámara de la raíz con el medio de crecimiento de interés, como el medio de 0,5 MS. Ahora, inserte con cuidado una sola plántula en el depósito de plantas del dispositivo Eco-FAB. Es importante que las plántulas se transfieran con cuidado del plato al Eco-FAB para que las raíces no se rompan.Agregue tres mililitros de agua estéril en el recipiente, evitando el dispositivo Eco-FAB. Esto aumentará la humedad y reducirá la evaporación del medio de la cámara radicular. Luego, cierre el recipiente y use cinta adhesiva de microporos para sellar la tapa.Coloque el Eco-FAB en una incubadora de plantas, o utilice el sistema de iluminación Eco-FAB en un entorno de temperatura controlada adecuado para el crecimiento de la planta respectiva. Luego, ajuste la cámara a 24 grados centígrados. Por último, realizar el perfilado de metabolitos y la espectrometría de masas, según el protocolo de texto.Estas figuras muestran Aaabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon y panicum virgatum de siete días de edad creciendo en Eco-FABs. Se encontró que tanto la dicotiledónea como la monocotiledónea viven a la altura de sus etapas de reproducción en el Eco-FAB. Estas plántulas representan un grupo de brachypodium distachyon de 14 días de edad que crecen en medio hidropónico, así como arena y tierra suplementadas con medio hidropónico y agua, respectivamente.La capa de sustrato delgada y sólida y las cámaras de crecimiento de las raíces permiten que la luz penetre a través de ellas para obtener imágenes microscópicas de los sistemas radiculares. Aquí, una plántula de Brachypodium distachyon se transfirió al dispositivo Eco-FAB, y su estructura de la raíz fue registrada por una cámara dentro de un generador de imágenes de gel biorad. La cuantificación del área total de raíces en el transcurso de tres semanas mostró un aumento gradual en la etapa temprana, seguido de una tendencia de crecimiento lineal hasta el final.En esta figura, se agregó a los sistemas radiculares de las plantas un Eco-FAB que contenía la rizobacteria promotora del crecimiento de las plantas, Pseudomonas simiae, WCS417 a 10 a la sexta celda por planta. Los microbios WCS147 colonizaron la superficie de todo el sistema radicular con microbios concentrados alrededor de las áreas de las puntas de las raíces. Al refrescar los medios de cultivo y recolectar los exudados de las raíces de los Eco-FABs, es importante recordar procesar todo el trabajo en una campana estéril para evitar cualquier contaminación.Los dispositivos Eco-FAB también se pueden fabricar utilizando un sello físico reversible mediante el uso de una abrazadera impresa en 3D o alterando la viscosidad del PDMS. Esto permite el uso de medios de crecimiento sólidos y de imágenes espectroscópicas de masas directas. Después del desarrollo de Eco-FAB, este sistema permitirá a los investigadores de todo el mundo utilizar estos ecosistemas modelo de laboratorio para estudiar las interacciones de los microbios de las plantas utilizando la biología de sistemas y las tecnologías de imagen.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar un sistema Eco-FAB, así como sus amplias aplicaciones en estudios de ecosistemas. Esperamos que este diseño de Eco-FAB permita a otros científicos alcanzar sus objetivos científicos específicos. Más importante aún, esperamos que otros científicos se basen en este diseño de Eco-FAB y lo mejoren, y lo compartan con otros científicos, para que, como comunidad, podamos construir estos ecosistemas de laboratorio que nos permitan comprender mejor las interacciones de los microbios de las plantas.No olvide que trabajar con microbios y objetos punzantes puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones al realizar este procedimiento.

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Dispositivos de microfluídica se puede utilizar para visualizar procesos naturales complejos en tiempo real y en las escalas físicas adecuadas. Hemos desarrollado un sencillo dispositivo de microfluidos que imita las características clave de los medios porosos naturales para el estudio del crecimiento y el transporte de bacterias en el subsuelo.

Ventana en un micromundo: Sistemas sencillos de microfluidos para el estudio de transporte de microbios en medios porosos

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Protocolos de fabricación (EcoFAB) del ecosistema para la construcción de ecosistemas de laboratorio diseñado para estudiar las interacciones planta-microorganismo (Video) | JoVE Journal

Protocolos de fabricación (EcoFAB) del ecosistema para la construcción de ecosistemas de laboratorio diseñado para estudiar las interacciones planta-microorganismo

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