Protocolos de fabricación (EcoFAB) del ecosistema para la construcción de ecosistemas de laboratorio diseñado para estudiar las interacciones planta-microorganismo

El objetivo general de este protocolo es definir enfoques estandarizados para la construcción de ecosistemas de plantas modelo simplificados, llamados EcoFABs, que permitan experimentos de laboratorio controlados y replicados para investigar las interacciones de los microbios de las plantas que puedan probarse más a fondo en el campo. Este método se puede utilizar para estudiar las interacciones de los microbios de las plantas en entornos controlados, lo que nos permite obtener información mecanicista detallada sobre las funciones de los microbiomas para poder aprovecharlos para la agricultura sostenible. Ayudamos a diseñar este primer Eco-FAB, que emplea una variedad de tecnologías de impresión 3D disponibles y a esterilizar las cámaras de crecimiento de las plantas que permiten tanto imágenes de alta resolución como análisis químicos que no distraen.

El dispositivo Eco-FAB desarrollado aquí es muy adecuado para el análisis de las interacciones de los microbios de las plantas, ya que incorpora el análisis de la morfología de las raíces y las imágenes espectroscópicas de masas. Después de la construcción de moldes Eco-FAB, utilizando impresión 3D según el protocolo de texto, en un recipiente desechable de un litro, mezcle 40 mililitros de base de elastómero de siloxano con diferentes volúmenes de agente de curado, según el experimento. Coloque el recipiente en una cámara de vacío durante al menos 30 minutos para eliminar las burbujas de aire de la mezcla de elastómeros.

A continuación, retira la mezcla y viértela en el molde de plástico impreso en 3D montado. Para generar una capa uniforme de PDMS, las burbujas de aire deben eliminarse cuidadosamente. Use aire comprimido para soplar cualquier residuo de aire después de transferir la mezcla al molde.

Mantenga el molde en un bloque calefactor a 85 grados centígrados durante cuatro horas. Deja que el molde se enfríe durante cinco minutos. Luego, saque suavemente el inserto del molde y use un cuchillo multiusos para separar lentamente el PDMS del marco de fundición.

Presione la base del molde con PDMS hacia arriba fuera del marco de fundición. Luego, use un cuchillo u otras herramientas para separar suavemente la capa de PDMS de la base del molde en los bordes y despéguela lentamente de la superficie del molde. Con una aguja roma de calibre 15, cree un canal de entrada en las capas de PDMS haciendo agujeros de 1,6 milímetros en esa parte.

A continuación, utilice unas tijeras para recortar los bordes de las capas PDMS. Para unir permanentemente las capas de PDMS a los portaobjetos del microscopio, use metanol para enjuagar el lado de unión de la capa de PDMS en un portaobjetos de microscopio de 7,6 por cinco centímetros, y luego séquelas con aire comprimido o una pistola de nitrógeno ultrapuro. Coloque el portaobjetos del microscopio y la capa de PDMS en un limpiador de plasma con los lados de unión hacia arriba.

Cierre la cámara y la válvula de ventilación de gas. Luego, encienda la aspiradora y bombee la cámara durante un minuto. Encienda el generador de plasma y cambie la frecuencia de radio, o el nivel de RF, a alto durante un minuto.

A continuación, apague la bomba de vacío y la alimentación de plasma, y ventile la cámara a la atmósfera. Saque el portaobjetos del microscopio y la capa de PDMS de la cámara de plasma y presione rápidamente los cuatro bordes de la capa de PDMS sobre el portaobjetos con una presión uniforme. Asegúrese de que la región ovalada central, que es la cámara de la raíz, no toque el portaobjetos.

Con agua ultrapura, enjuague los dispositivos Eco-FAB. Coloque un dispositivo Eco-FAB en un recipiente Eco-FAB y agregue 70% de etanol hasta que el dispositivo se sumerja. Luego, cierre la tapa del recipiente y agítelo suavemente para humedecer todas las superficies del interior con etanol, asegurándose de que la cámara de crecimiento de las raíces del dispositivo Eco-FAB esté llena de etanol, con muy pocas o ninguna burbuja de aire.

Después de incubar los dispositivos a temperatura ambiente durante 30 minutos, vierta el etanol al 70% y reemplácelo con etanol al 100%. Luego, incuba los dispositivos durante cinco minutos. Después de la incubación, escurra el etanol y deje el Eco-FAB esterilizado en una campana de flujo laminar durante 16 horas para que se seque por completo.

Si está disponible, esterilice el sistema encendiendo la luz ultravioleta en la campana durante una hora. Para llevar a cabo la esterilización y germinación de las semillas, remoje las semillas en etanol al 70% durante dos minutos. Luego, con una pipeta, retire el etanol y use agua estéril para enjuagar las semillas tres veces.

A continuación, remoje las semillas en una solución de lejía al 10% durante cinco minutos. Luego, retira la solución de lejía y usa agua estéril para lavar bien las semillas tres veces. Después de los lavados, agregue agua estéril a las semillas e incube el tubo a cuatro grados centígrados durante siete días.

Extienda uniformemente las semillas en 0,5 Murashige y Skoog, o MS medium, con 0,6% de vitagel. Y con cinta adhesiva de microporos, selle las placas. Luego, cultive las plantas hasta una longitud de raíz de aproximadamente cinco mililitros.

Para transferir las plántulas a los Eco-FAB, utilizando una jeringa estéril o una micropipeta y agua estéril, enjuague la cámara de la raíz de un dispositivo Eco-FAB tres veces y luego llene la cámara de la raíz con el medio de crecimiento de interés, como el medio de 0,5 MS. Ahora, inserte con cuidado una sola plántula en el depósito de plantas del dispositivo Eco-FAB. Es importante que las plántulas se transfieran con cuidado del plato al Eco-FAB para que las raíces no se rompan.

Agregue tres mililitros de agua estéril en el recipiente, evitando el dispositivo Eco-FAB. Esto aumentará la humedad y reducirá la evaporación del medio de la cámara radicular. Luego, cierre el recipiente y use cinta adhesiva de microporos para sellar la tapa.

Coloque el Eco-FAB en una incubadora de plantas, o utilice el sistema de iluminación Eco-FAB en un entorno de temperatura controlada adecuado para el crecimiento de la planta respectiva. Luego, ajuste la cámara a 24 grados centígrados. Por último, realizar el perfilado de metabolitos y la espectrometría de masas, según el protocolo de texto.

Estas figuras muestran Aaabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon y panicum virgatum de siete días de edad creciendo en Eco-FABs. Se encontró que tanto la dicotiledónea como la monocotiledónea viven a la altura de sus etapas de reproducción en el Eco-FAB. Estas plántulas representan un grupo de brachypodium distachyon de 14 días de edad que crecen en medio hidropónico, así como arena y tierra suplementadas con medio hidropónico y agua, respectivamente.

La capa de sustrato delgada y sólida y las cámaras de crecimiento de las raíces permiten que la luz penetre a través de ellas para obtener imágenes microscópicas de los sistemas radiculares. Aquí, una plántula de Brachypodium distachyon se transfirió al dispositivo Eco-FAB, y su estructura de la raíz fue registrada por una cámara dentro de un generador de imágenes de gel biorad. La cuantificación del área total de raíces en el transcurso de tres semanas mostró un aumento gradual en la etapa temprana, seguido de una tendencia de crecimiento lineal hasta el final.

En esta figura, se agregó a los sistemas radiculares de las plantas un Eco-FAB que contenía la rizobacteria promotora del crecimiento de las plantas, Pseudomonas simiae, WCS417 a 10 a la sexta celda por planta. Los microbios WCS147 colonizaron la superficie de todo el sistema radicular con microbios concentrados alrededor de las áreas de las puntas de las raíces. Al refrescar los medios de cultivo y recolectar los exudados de las raíces de los Eco-FABs, es importante recordar procesar todo el trabajo en una campana estéril para evitar cualquier contaminación.

Los dispositivos Eco-FAB también se pueden fabricar utilizando un sello físico reversible mediante el uso de una abrazadera impresa en 3D o alterando la viscosidad del PDMS. Esto permite el uso de medios de crecimiento sólidos y de imágenes espectroscópicas de masas directas. Después del desarrollo de Eco-FAB, este sistema permitirá a los investigadores de todo el mundo utilizar estos ecosistemas modelo de laboratorio para estudiar las interacciones de los microbios de las plantas utilizando la biología de sistemas y las tecnologías de imagen.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar un sistema Eco-FAB, así como sus amplias aplicaciones en estudios de ecosistemas. Esperamos que este diseño de Eco-FAB permita a otros científicos alcanzar sus objetivos científicos específicos. Más importante aún, esperamos que otros científicos se basen en este diseño de Eco-FAB y lo mejoren, y lo compartan con otros científicos, para que, como comunidad, podamos construir estos ecosistemas de laboratorio que nos permitan comprender mejor las interacciones de los microbios de las plantas.

No olvide que trabajar con microbios y objetos punzantes puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones al realizar este procedimiento.