Formación de covalente ADN aductos carcinógenos activados enzimáticamente y fármacos In Vitro y su determinación por 32P-postlabeling
20 de marzo de 2018
Evaluación de la potencia de los productos químicos ambientales y las drogas, ser enzimáticamente bioactivación intermedios generando covalente DNA aducciones, es un campo importante en el desarrollo de cáncer y su tratamiento. Se describen los métodos para la activación de compuestos para formar que aductos de ADN, así como técnicas para su detección y cuantificación.
El objetivo general de este protocolo es la descripción de métodos que emplean las reacciones catalizadas por el citocromo p450 y enzimas de biotransformación adicionales para investigar la potencia de productos químicos o fármacos para su activación a metabolitos que forman aductos covalentes de ADN. Este método puede ayudar a responder a las preguntas clave en el campo del desarrollo del cáncer y su tratamiento. La principal ventaja de esta técnica es que muestra un tipo de método para evaluar la potencia de los productos químicos ambientales o los medicamentos para formar aductos de ADN covalente que representan el inicio del desarrollo del cáncer.
Las implicaciones de la técnica para determinar la potencia cancerígena de los productos químicos. Potencia ambiental, tóxicos y drogas y también determina métodos relativamente simples para la formación de aductos de ADN covalentes formados por dichos compuestos. Aunque este método puede proporcionar información sobre el inicio del desarrollo del cáncer y su tratamiento, también se puede aplicar a otros campos científicos.
Tales como estudios de mecanismos moleculares, de daño en el ADN, y estudios orales sobre la activación enzimática y la toxificación de productos químicos. La primera vez que escuché la idea de este método fue cuando investigué los procesos involucrados en la fase de iniciación de la carcinogénesis química. Primero prepare la mezcla de incubación agregando todos los compuestos y los sistemas enzimáticos hasta un volumen final de 0,75 mililitros a cuatro grados centígrados.
Esto es para incubar el carcinógeno con el ADN en presencia del citocromo p450. A continuación, añada microsomas o p450 recombinante puro en supersoma a la mezcla. A continuación, agregue 7,5 microlitros de fármaco elipticina de 0,1 milimolar disuelto en DMSO y 42,5 microlitros de agua para ajustar el volumen final a 0,75 mililitros.
A continuación, mezcle los componentes agitando el tubo en vórtice durante cinco segundos. Inmediatamente después, incube el tubo a 37 grados centígrados con la tapa abierta durante 30 a 60 minutos. A continuación, mezcle el fenol o el fenol cloroformo en una proporción de uno a uno con la mezcla de incubación en un tubo Eppendorf.
Esto eliminará la contaminación proteica del ADN en la mezcla de incubación. Luego revuelva la mezcla para formar una emulsión. A continuación, centrifugar la mezcla a 1600 veces g durante tres minutos a temperatura ambiente.
Una vez finalizada la centrifugación, utilice una pipeta para transferir la fase superior del agua a un nuevo tubo de polipropileno. A continuación, deseche la interfaz proteica junto con la fase orgánica. A continuación, mezcle la fase acuosa con un volumen equivalente de fenol y cloroformo en una proporción de uno a uno.
A continuación, repita la centrifugación. A continuación, añada volúmenes iguales de cloroformo a la fase acuosa recogida y vuelva a centrifugar. A continuación, precipitar el ADN de la fase acuosa añadiendo dos volúmenes de etanol frío mantenido a menos 20 grados centígrados.
A continuación, mezcle bien la solución. Para prepararse para el marcaje de los aductos de ADN, mezcle la solución tampón de bicina con una solución de ATP radiomarcada para marcar los aductos de ADN. Agregue la mezcla de etiquetado a la solución NP1 o a la mezcla de enriquecimiento de butanol.
Deje reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, aplique aproximadamente 20 microlitros en toda la muestra en la placa TLC de PEI-celulosa. Después de detectar la muestra en la placa TLC de PEI-celulosa, deje que la placa se desarrolle en la dirección D1 para limpiar los aductos.
Una vez que la placa se haya secado, deje que la placa se desarrolle en las direcciones D3 y D4. Para desarrollar en D3, use tampón de formiato de litio a pH 3.5 con urea. Para el desarrollo de D4, utilice tampón Tris-HCl con cloruro de litio y urea.
Para evitar problemas de desarrollo en la dirección D4, desarrolle también las placas en la dirección D5. En primer lugar, se utiliza la técnica de post-marcaje de P32 para estudiar la eficiencia de la elipticina bioactivada mediada por p450 microsomal en la formación de aductos de ADN. Los resultados muestran la formación de aductos covalentes de ADN en la desoxiguanosina del ADN del timo de la cría en presencia de microsomas hepáticos de rata y/o humanos; sin embargo, no se forman aductos en el grupo de control.
A continuación, se estudia el potencial de la elipticina activada dependiente de la enzima peroxidasa. La imagen muestra la formación de aductos covalentes de ADN en el ADN del timo de ternera en presencia de peroxidasa de rábano picante, lactoperoxidasa bovina y mieloperoxidasa humana. De hecho, los aductos de ADN también se forman a partir del ADN del hígado cuando las ratas son tratadas con 40 miligramos por kilogramo de peso corporal de elipticina in vivo.
Curiosamente, la enzima CYP3A4 del citocromo p450 humano también muestra un gran potencial para oxidar eficientemente la elipticina a metabolitos como la 12-hidroxielipticina y la 13-hidroxielipcina. Estos metabolitos pueden unirse fácilmente al ADN para formar los aductos. A continuación, se utilizan los métodos de enriquecimiento de nucleasa P1 y n-butanol para estudiar la formación de aductos de ADN tras la activación de 3-nitrobenzanthrone con la citosólica reductasa como NQ01 en ratas y humanos.
Los resultados muestran la formación de hasta cinco aductos de ADN a partir del ADN del timo de la pantorrilla obtenido de la rata, el citosol hepático humano y también el hígado de ratón. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar la estabilidad de los sistemas enzimáticos utilizados.
La actividad enzimática puede disminuir si no se almacena en hielo. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la bioquímica, la bioquímica de la carcinogénesis química, exploraran la naturaleza del fenómeno a partir de los procesos de iniciación del desarrollo del cáncer en los organismos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo evaluar la potencia de los productos químicos ambientales o los medicamentos que se activan enzimáticamente para metabolizar los aductos genéticos de ADN covalente.
Este proceso representa una gran importancia para el desarrollo de tratamientos basados en el cáncer. No olvide que está trabajando con productos químicos que pueden ser extremadamente peligrosos. Posibles carcinógenos, productos químicos radiactivos, por ejemplo, fósforo ATP.
Por lo tanto, siempre se deben tomar precauciones como guantes de látex de laboratorio y láminas de plexiglás al realizar este procedimiento.
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Resumen
Este protocolo describe métodos para evaluar la potencia de productos químicos ambientales y fármacos que pueden bioactivarse enzimáticamente para formar aductos de ADN covalentes, que son fundamentales en el desarrollo del cáncer. Las técnicas descritas facilitan la detección y cuantificación de estos aductos de ADN, proporcionando información sobre su potencial carcinogénico.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Investigación del cáncer
- Toxicología
- Bioquímica
Antecedentes
- Los aductos covalentes del ADN se forman cuando los metabolitos reactivos se unen al ADN.
- Comprender la activación de productos químicos es esencial para evaluar su riesgo carcinogénico.
- Las enzimas del citocromo P450 desempeñan un papel importante en la biotransformación de estos compuestos.
- Este método puede aplicarse en diversos campos científicos más allá de la investigación del cáncer.
Objetivo del estudio
- Evaluar la potencia de productos químicos ambientales y fármacos en la formación de aductos de ADN.
- Proporcionar un método para evaluar el inicio del desarrollo del cáncer.
- Explorar las implicaciones de la activación química en el tratamiento del cáncer.
Métodos Utilizados
- Utilización de citocromo P450 y otras enzimas de biotransformación.
- Activación de compuestos para generar intermediarios reactivos.
- Técnicas de detección y cuantificación de aductos de ADN.
- Aplicación de métodos relativamente sencillos para la formación de aductos.
Resultados Principales
- Demuestra la eficacia de los métodos para evaluar la potencia química.
- Proporcionó información sobre los mecanismos de carcinogénesis.
- Destacó la relevancia de estos métodos en la investigación y el tratamiento del cáncer.
- Mostró aplicaciones potenciales en otros dominios científicos.
Conclusiones
- Los métodos descritos son valiosos para evaluar el potencial carcinogénico de productos químicos ambientales.
- Comprender la formación de aductos de ADN es fundamental para las estrategias de prevención del cáncer.
- Este protocolo puede contribuir al desarrollo de fármacos y productos químicos más seguros.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación de la formación de aductos covalentes en el ADN por carcinógenos y fármacos activados enzimáticamente es fundamental para la validación temprana de dianas y la reducción mecanicista de riesgos en las líneas de oncología y toxicología. Este enfoque permite la evaluación predictiva de las responsabilidades genotóxicas, apoyando la clasificación de carteras y las decisiones de avance ajustadas al riesgo. La integración de estos ensayos en los flujos de trabajo de descubrimiento mejora la confianza en la selección de compuestos y orienta las estrategias traslacionales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de los mecanismos de daño en el ADN inducido por productos químicos y fármacos.
- Apoya la validación funcional de las vías de activación metabólica relacionadas con la carcinogénesis.
- Facilita la reducción mecanicista de riesgos al vincular la bioactivación con resultados genotóxicos.
- Proporciona confianza predictiva para la priorización de compuestos en carteras de oncología y seguridad.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Establece sistemas in vitro validados para evaluar la formación de aductos de ADN en bibliotecas de compuestos.
- Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles mediante postetiquetado con 32P para una estandarización robusta del ensayo.
- Permite la realización de cribados a gran escala de perfiles de activación metabólica y reactividad con el ADN.
- Facilita la integración posterior con ensayos de genotoxicidad y seguridad de alto rendimiento.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relaciona datos in vitro de aductos de ADN con el desarrollo de biomarcadores in vivo para lograr una continuidad traslacional.
- Contribuye a la evaluación preclínica de riesgos mediante el trazado de vías de activación metabólica entre especies.
- Apoya la identificación de biomarcadores traslacionales para la detección temprana de efectos genotóxicos.
- Reduce los riesgos en la selección de candidatos al vincular hallazgos mecanicistas con puntos finales preclínicos.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Este método conecta el descubrimiento temprano, la identificación de compuestos activos y la evaluación preclínica de seguridad al proporcionar un vínculo mecanicista entre el metabolismo del compuesto y el daño al ADN.
- Biología del Descubrimiento: Permite la verificación de hipótesis sobre la activación metabólica y la formación de aductos de ADN como pasos iniciales para reducir riesgos.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles para comparar los perfiles de genotoxicidad de compuestos.
- Análisis: Ofrece detección sensible y cuantificación de aductos de ADN para fundamentar decisiones basadas en datos.
- Investigación Traducional: Facilita la alineación de biomarcadores y la continuidad desde modelos in vitro hasta in vivo.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma estandarizada adaptable a diversas clases de compuestos y sistemas biológicos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos y el entendimiento mecanicista de la genotoxicidad.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad, estandarización y escalabilidad del ensayo para equipos multidisciplinarios.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance/no avance y reduce el abandono en fases tardías debido a riesgos genotóxicos inesperados.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de candidatos más seguros y eficaces.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en enzimología, marcado radiactivo y análisis de aductos de ADN.
- Exige acceso a sistemas de citocromo P450, enzimas de biotransformación e infraestructura para el manejo de productos radioquímicos.
- Necesita una estandarización rigurosa entre equipos para la generación de datos reproducibles.
- Adaptable a diversos sistemas modelo, pero sensible a la estabilidad de las enzimas y a las condiciones de almacenamiento.
- Implica el manejo de materiales peligrosos y radiactivos, lo que requiere protocolos estrictos de seguridad.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Title
2:01
Incubation of Carcinogen and Drugs with DNA in the Presence of Enzymatic Systems
3:04
Isolation of the DNA from the Incubate
4:30
32P-postlabeling for Detection of DNA Adduct Formation
5:04
TLC Separation of Adducted Deoxyoligonucleotides
5:43
Results: Study of the Potency of Metabolically Active Ellipticine Drug in Generating Covalent DNA Adducts
7:33
Conclusion
