Trasplante de células madre derivadas de tejido adiposo hoja para reducir fugas después de colectomía parcial en un modelo de rata

Debido a que asumen un efecto positivo en la cicatrización de los tejidos, las láminas de ASC se han probado en muchos modelos de enfermedad, como el infarto de miocardio. Este experimento muestra que las láminas de ASC se pueden usar intraabdominalmente y aplicar en el intestino. La principal ventaja de las láminas ASC es que no se necesitan materiales sintéticos.

Además, el trasplante de láminas de ASC es relativamente fácil de realizar, con solo una pequeña cantidad de práctica. Esta novedosa aplicación del trasplante de lámina de ASC se desarrolló para prevenir las fugas después de la resección intestinal, y ofrece un primer paso para una nueva estrategia terapéutica. Se ha demostrado que las láminas de ASC aplicadas a la anastomosis intestinal son prometedoras para prevenir las fugas.

Las láminas de ASC también se pueden aplicar a otros órganos intraabdominales, como el tracto urinario. Comience por diseccionar el tejido adiposo abdominal subcutáneo humano en trozos de 0,5 cm, con una cuchilla quirúrgica estéril de tamaño 10, pinzas de tejido Adson-Brown y tijeras Metzenbaum. Pesa la cantidad total de tejido diseccionado en un frasco de vidrio estéril.

Añadir 30 ml de medio aislante por frasco. Y digerir el tejido adiposo diseccionado en una incubadora agitadora a 150 rpm y 37 grados centígrados durante una hora. Después de una hora, divida la solución de tejido digerido en tubos de 50 ml y centrifugue los tubos durante 10 minutos a 390 G. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante.

Agregue medio para resuspender los gránulos de células y agregue más medio de cultivo, hasta 45 ml. Centrifugar las celdas combinadas durante cinco minutos a 390 g y eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet celular con 10 ml de medio de cultivo.

Y filtre la suspensión celular a través de un filtro de 100 micras. Añadir 50 l de solución de azul de metileno ácido al 3%, a 50 l de suspensión celular, a los glóbulos rojos de los piojos. Después de mezclar la solución, pipetee 10 l en un hemocitómetro y cuente las células.

Coloque las células a una densidad de 40000 células por cm cuadrado, en un matraz T175 que contenga medio de cultivo. E incubar las células a 37 grados centígrados en una atmósfera húmeda con 5%CO2 durante 24 horas. Al día siguiente, lave las células con solución salina tibia tamponada con fosfato para eliminar los restos celulares.

A continuación, sustituya el medio por un medio de cultivo FBS al 10 %, más ácido ascórbico-2-fosfato recién añadido y factor de crecimiento dos de fibroblastos recombinantes humanos. Incubar hasta que las células alcancen el 90% de confluencia. Subcultivo de las células madre adiposas al 90% de confluencia, utilizando una solución estándar de tripsina-EDTA al 0,25%.

Después de tres a cinco minutos, neutralice la solución de tripsina-EDTA al 0,25% con 10 ml de medio de cultivo. Transfiera a un tubo de centrífuga y centrifuga las células durante ocho minutos a 250 G. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 ml de medio de cultivo. Después de contar las células con un hemocitómetro, coloque las células en matraces de cultivo T175, a una densidad de 8000 células por cm cuadrado.

Congele los ASC restantes en nitrógeno líquido, con 10% de dimetilsulfóxido en medio de cultivo antes de su uso posterior. Precubra placas de cultivo termosensibles de 3,5 cm de diámetro, con 1 ml de suero fetal bovino. Luego coloque los platos en una incubadora a 37 grados centígrados, durante al menos 30 minutos antes de sembrar.

Para ayudar a la adhesión de ASC a la placa termosensible y reducir el riesgo de desprendimiento prematuro de la lámina de ASC en cultivo, la placa termosensible debe recubrirse previamente con suero fetal bovino antes de la siembra celular. Tripsisinar las ASC como antes, si hay grupos de células después de la tripsinización, filtre las células a través de un filtro de 100 micras antes de contar. Retire los platos de la incubadora y transfiéralos a una placa calefactora a 37 grados centígrados.

Retire FBS del plato. Después de resuspender el pellet de células en LG DMEM, con 10% FBS, y contar las células, diluir 3,52 veces 10 a la 6ª ASC en 2 ml de medio de cultivo por placa, para sembrar 400000 células por cm cuadrado en cada placa de 3,5 cm. Distribuya con cuidado las celdas lo más uniformemente posible, balanceando suavemente el plato.

A continuación, se cultivan láminas de ASC durante 48 horas a 37 grados centígrados en un ambiente húmedo con 5% de CO2. El día del trasplante, deje que las placas de cultivo se enfríen a temperatura ambiente 40 minutos antes del trasplante in vivo para facilitar el desprendimiento de la lámina de ASC. Una vez enfriado, retire el medio de cultivo y reemplácelo con 1 ml de LG DMEM sin suero.

Para trasplantar la lámina de células, agarre suavemente el borde de la lámina de ASC con pinzas atraumáticas y coloque el lado de la placa de ASC encima de la línea anastomótica. El manejo cuidadoso de las hojas y la colocación correcta de las hojas son esenciales para garantizar el éxito del trasplante de hojas intactas. Estire con cuidado la hoja ASC hasta aproximadamente 0,25 cm por encima y por debajo de la línea anastomótica.

Envuelva la sábana alrededor del colon, levantando el colon, para envolver la sábana ASC alrededor del lado dorsal. Los animales control, que no recibieron láminas de ASC trasplantadas, presentan fugas fecales cerca de la línea anastomótica, indicada por la flecha blanca en el tercer día postoperatorio. Aquellos animales con láminas de ASC trasplantadas, indicadas por la flecha negra, mostraron una reducción de la fuga fecal y la formación de abscesos en el tercer día postoperatorio.

El mismo resultado se observó siete días después de la cirugía. Esta imagen muestra una sección transversal representativa del sitio de la anastomosis colorrectal en un animal trasplantado teñido con H y E. La estructura de la lámina pudo identificarse en el sitio de la anastomosis, hasta siete días después de la operación. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en pocos minutos si se realiza correctamente.

La lámina de ASC se adherirá espontáneamente a la superficie de células cero del colon, no es necesario usar pegamento o sutura para ajustar la lámina de ASC. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar y trasplantar láminas de ASC en la anastomosis colorrectal en ratas, para evitar fugas después de una colectomía parcial.