Name: Análisis de la afluencia del calcio mitocondrial en las mitocondrias aisladas y células cultivadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprende a medir la afluencia de calcio mitocondrial en mitocondrias aisladas y células cultivadas mediante lectura en placa y microscopía confocal. Estos protocolos adaptables permiten estudiar la señalización del calcio en diversos sistemas modelo.

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Este trabajo fue financiado por donaciones de fondos de la Asociación Americana del corazón (J.Q.K.).

Todos los métodos descritos en este protocolo han sido aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso de la Universidad de Emory.
Nota: La primera parte es el procedimiento experimental para medir mitocondrial Ca2 + entrada en la mitocondria cardiaca aislada usando un lector de placas.
1. los reactivos y soluciones
<ol><li>Tomar 500 mL de buffer EGTA MS para aislamiento mitocondrial: manitol de 225 mM, 75 mM sacarosa, ácido-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido de 5 mM 4 (HEPES), 1 mM el glicol de etileno-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-ácido tetraacético (EGTA), pH ajustado a 7,4 con KOH. Esterilizar con filtro 0,22 μm y almacenar a 4 ° C. Asegúrese de que el buffer EGTA MS es previamente enfriado a 4 ° C antes de usar.</li>
	<li>Preparar 100 mL de solución de KCl: 125 mM KCl, 20 mM HEPES 1 m m KH2PO4, 2 mM de MgCl2, 40 μM EGTA y pH ajustado a 7.2 con KOH. Almacenar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparación de calcio 1 mM verde-5N stock en dimetil sulfóxido (DMSO). El stock de la verde-5N de calcio puede ser alicuotados y almacenado a-20 ° C.</li>
	<li>
Preparación de sustratos para la absorción de Ca2 + .
	<ol>
<li>Preparar el piruvato de sodio de 1 M, pH 7,4. Almacenar en alícuotas a-20 ° C.</li>
		<li>Preparar el malato de 500 mM, pH 7,4. Almacenar en alícuotas a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. aislamiento de mitocondrias cardiacas
<ol><li>Eutanasia el ratón según normas institucionales. Nota: Nuestro método institucionalmente aprobados de eutanasia, ratones fueron anestesiados por inhalación isofluorane y sacrificados por dislocación cervical.</li>
	<li>Recoger el corazón por abrir la cavidad torácica, corte a lo largo de ambos lados de las costillas, que flanquean el corazón, cortando el diafragma y extirpando el tejido del corazón. Nota: En el presente Protocolo, se realiza con aislamiento mitocondrial de todo corazón de un ratón adulto (aproximadamente 120 mg), que debe ser suficiente para 3-4 experimentos. Para el aislamiento mitocondrial de otros tejidos ricos en mitocondrias, como el hígado, hasta 200 mg de tejido puede utilizarse siguiendo el protocolo descrito.</li>
	<li>Enjuague el tejido completamente 25 mL de helado 1 x de tampón fosfato salino (PBS) asegurando que es exprimida toda la sangre de los ventrículos. Nota: El corazón se suficientemente efectúe cuando el líquido exprimido del corazón salga limpia.</li>
	<li>Picar el corazón en trozos pequeños en 5 mL de helado de 1 x PBS utilizando un par de tijeras afiladas.</li>
	<li>Descartar el PBS y transferencia de tejido de corazón picado a un homogeneizador de dounce previamente refrigerado 7 mL vidrio-teflon con una separación de 0.10 a 0.15 mm.</li>
	<li>Añadir 5 mL de buffer EGTA MS helada y homogeneizar la muestra hasta piezas de tejido no son visibles (aproximadamente 11 carreras). Nota: No homogeneizar demasiado el tejido como el objetivo es obtener las mitocondrias intactas y funcionales.</li>
	<li>Transferir el homogeneizado en un tubo de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugar el homogeneizado a 600 x g a 4 ° C durante 5 minutos para que sedimenten los núcleos y células intactas.</li>
	<li>Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo 15 mL y centrifugar a 10.000 x g a 4 ° C durante 10 minutos para que sedimenten las mitocondrias.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y mantener el pellet mitocondrial en el hielo.</li>
	<li>Lavar el pellet mitocondrial utilizando doble buffer EGTA MS helada. Para cada colada, Resuspender el precipitado mitocondrial en 5 mL de buffer EGTA MS centrifugar a 10.000 x g a 4 ° C por 10 min y descarte el sobrenadante.</li>
	<li>Después del último lavado, eliminar el sobrenadante y resuspender las mitocondrias en 100 μL de tampón de EGTA MS frío hielo. Mantenga las mitocondrias en el hielo. Nota: Las mitocondrias deben utilizarse para la experimentación dentro de 1 h.</li>
	<li>Medir la concentración de la proteína mitocondrial mediante un análisis de la proteína de Bradford26.</li>
</ol>3. placa base de lector medición de la absorción de calcio mitocondrial
Nota: Aquí, es descrito el protocolo de análisis mitocondrial Ca2 + absorción con un lector multimodo equipados con inyectores. Cualquier lector de la placa con la capacidad de lectura de la fluorescencia verde-5N calcio (excitación/emisión de 506/532 nm) en un modo cinético con reactivo automatizado pueden utilizarse inyectores para mantener la reacción de la luz.
<ol><li>Programa lee el lector de placas para realizar una cinética de fluorescencia verde-5N de calcio con mediciones cada segundo por un tiempo de análisis total de 1.000 s. Además, programar los inyectores reactivo para dispensar 5 μL de solución de CaCl2 en los 30 s, 150 s, 300 s , 480 s, 690 s tiempo puntos y. Nota: La sincronización de las inyecciones de CaCl2 son definidos por el usuario y puede ajustarse a necesidades experimentales.</li>
	<li>Prime los inyectores del reactivo con la solución de CaCl2 que se utilizará. Nota: La concentración de la solución de CaCl2 es definido por el usuario y se puede ajustar en posteriores pruebas para valorar la cantidad de Ca2 + requerido para activar apertura del MPTP.</li>
	<li>Añadir 200 μg de mitocondrias a un pozo individual de una placa bien 96.</li>
	<li>Añadir el volumen adecuado de amortiguador de KCl al pozo tal que el volumen total de mitocondrias y buffer KCl viene a 197 μL.</li>
	<li>Añadir 1 μL de piruvato de 1 M y 1 μL de malato de 500 mM a la mezcla de las mitocondrias. Pipetee suavemente a la mezcla e incubar las mitocondrias con los substratos por 2 min a temperatura ambiente para permitir a las mitocondrias ser energizado.</li>
	<li>Añadir 1 μL del stock de verde-5N de calcio 1 mM. Mezclar suavemente por pipeteo. Nota: Proteja la reacción de la luz después de añadir el tinte verde-5N de calcio.</li>
	<li>Iniciar la pre programado cinética protocolo y monitor calcio verde-5N fluorescencia.</li>
</ol>4. reactivos y soluciones
Nota: La segunda parte es un procedimiento experimental para la proyección de imagen confocal de mitocondrial Ca2 + en células cultivadas
<ol><li>Hacer solución de Tyrode (130 mM de NaCl, 4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM de glucosa y 10 mM HEPES, pH 7.2 con KOH). Almacenar a 4 ° C. Caliéntelo a temperatura ambiente antes de usar.</li>
	<li>Preparar solución de lavado (acetato de potasio de 100 mM, 15 mM KCl, 5 m m KH2PO4, 5 mM de Mg-ATP, 0,35 mM EGTA, 0.12 mM CaCl2, 0,75 mM MgCl2, fosfocreatina de 10 mM, 10 mM HEPES, pH 7.2 con KOH). Almacenar a 4 ° C. Caliéntelo a temperatura ambiente antes de usar.</li>
	<li>Preparar solución de permeabilización, que contiene 0.005% de saponina en la solución de lavado. Preparar diariamente.</li>
	<li>Preparar 0 Ca2 + solución interna (100 m m acetato de potasio, 15 mM KCl, 0,35 mM EGTA, 0,75 mM de MgCl2, 10 mM HEPES, pH ajustado a 7.2 con KOH). Almacenar a 4 ° C. Caliéntelo a temperatura ambiente antes de usar.</li>
	<li>Preparar la solución interna que contiene Ca2 +. Añadir CaCl2 a la solución interna arriba para alcanzar la concentración deseada de libre Ca2 +. La cantidad de CaCl2 añadir se calcula utilizando el programa MaxChelator (maxchelator.stanford.edu).</li>
	<li>Preparar 1 mM stock Rhod-2/AM en DMSO y almacenar a-20 ° C hasta su uso.</li>
	<li>Preparar 1 mM MitoTracker verde stock en DMSO y almacenar a-20 ° C hasta su uso.</li>
</ol>5. las células de la galjanoplastia para la proyección de imagen
<ol><li>Lavar 22 x 22 cm2 cubreobjetos de vidrio con etanol al 100% y permite el cubreobjetos a aire seco.</li>
	<li>Coloque el cubreobjetos de vidrio en pocillos individuales de un plato de cultivo de tejidos bien 6. Nota: Cubreobjetos pueden ser cubierto con laminina, poly-L-lisina o matriz similar para promover la fijación de la célula.</li>
	<li>Trypsinize y las células sobre cubreobjetos con el objetivo de confluencia de 70% aproximadamente en el día de la proyección de imagen de la placa.</li>
</ol>6. carga las células con el Rhod-2/AM y MitoTracker Green
<ol><li>Preparar Rhod-2/AM-MitoTracker green solución de trabajo. Añadir 20 μL de Rhod-2/AM 1 mM stock, 0,2 μL de MitoTracker stock de verde de 1 mM y 2,5 μL de pluronic 20% F-127 a 1 mL de solución de Tyrode. La concentración final de Rhod-2 en la solución de trabajo es de 20 μm y la concentración final de MitoTracker green es de 200 nM.</li>
	<li>Suavemente Retire el medio de crecimiento el cubreobjetos. Nota: Un paso de lavado no es necesario antes de la adición de solución colorante.</li>
	<li>Añadir Rhod-2/AM-MitoTracker solución verde de forma gota a gota sobre el cubreobjetos hasta que el cubreobjetos esté a cubierto (aproximadamente 3-4 gotas por cubreobjetos).</li>
	<li>Incubar durante 30 min a temperatura ambiente protegido de la luz para permitir que las células de carga con los tintes.</li>
	<li>De esterificar Rhod-2/AM. Quite con cuidado el Rhod-2/AM-MitoTracker solución verde, reemplazarlo con solución de Tyrode fresca temperatura e incubar durante 30 min a temperatura ambiente protegido de la luz.</li>
</ol>7. proyección de imagen confocal de la Rhod-2/AM mitocondrial MitoTracker fluorescencia
<ol><li>Transferir el cubreobjetos al microscopio de cámara y llenar la cámara con solución de lavado.</li>
	<li>En configuración para observar células en contraste de fase 40 X, ajustar el foco hasta que las células sean visibles y en foco.</li>
	<li>
Permeabilizar la membrana plasmática de Rhod-2/AM-MitoTracker green cargado quitar localizada citosol Rhod-2, conservando el tinte localizada en las mitocondrias de las células.
	<ol>
<li>Quite el cubreobjetos a la solución de lavado.</li>
		<li>Reemplazar con solución de permeabilización durante aproximadamente 1 minuto.</li>
		<li>Controlar visualmente la morfología de la membrana plasmática a través del proceso de permeabilización. Las células permeabilized desarrollará una superficie rugosa.</li>
		<li>Cuando termine la permeabilización, inmediatamente retire la solución de permeabilización y sustituirla por 0 Ca2 + solución interna.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Al mismo tiempo la imagen Rhod-2 fluorescencia (excitación usando la 559 nm láser línea y emisión recogido en longitudes de onda entre 575-675 nm) y MitoTracker verde fluorescencia (excitación usando la línea de láser 488nm y emisión en longitudes de onda entre 505-525 nm). Se centran en células permeabilized mostrando un claro colocalización de Rhod-2 y MitoTracker verde.</li>
	<li>Disminuir el laser microscopio y obtener configuración tales que la fluorescencia de Rhod-2 mitocondrial es débil y apenas visible.</li>
	<li>Seleccione configuración de microscopio para adquirir 2 dimensiones analiza en un curso de ritmo y tiempo de marco apropiado para la aplicación específica. Se recomienda una velocidad de al menos 30 fotogramas/s para capturar con precisión la cinética de los cambios en mitocondrial Ca2 +.</li>
	<li>Retire la Ca 02 + solución interna sin molestar a las células o el enfoque del microscopio.</li>
	<li>Iniciar la adquisición de la imagen.</li>
	<li>Añadir Ca2 +-solución interna repleta en el momento de s 10 punto ya sea manualmente o con un sistema de perfusión.</li>
	<li>Seleccione las regiones de interés (ROIs) para abarcar regiones de colocalización entre Rhod-2 mitocondrial y MitoTracker verde señal en el software de adquisición de imagen. Nota: Se obtienen valores de fluorescencia arbitraria (F) para cada momento de la grabación de cada retorno de la inversión. Estos valores son antecedentes restan y normalizado a la fluorescencia inicial (antes de Ca2 + adición; F0) y graficados como F/F0 en el tiempo para la presentación de datos y cuantificación de la amplitud del cambio de mitocondrial Ca2 +.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen ninguna revelación al informe.

Aquí, describimos a dos enfoques diferentes para medir mitocondrial Ca2 + afluencia. Placa lector basado en calcio verde-5N método monitores extramitochondrial Ca2 + niveles y es un Ca2 + absorción ensayo que es ideal para mediciones en mitocondrias aisladas. Aunque hemos mostrado resultados representativos de aislados murino mitocondria cardiaca, este ensayo puede ser fácilmente adaptado para las mitocondrias aisladas de tejidos con alta abundancia mitocondrial incluyendo hígado, músculo...

Las mitocondrias son sitios críticos de almacenamiento de Ca2 + intracelular y la señalización. Décadas de investigación han demostrado que las mitocondrias tienen la capacidad de importar y el secuestro de Ca2 + 1,2. Las mitocondrias, sin embargo, no son meramente pasivos sitios de almacenamiento de Ca2 + . CA2 + en el compartimiento mitocondrial realiza funciones de señalización fundamentales incluyendo la regulación de la producción metabólica y la activación de las vías de muerte celular mitocondrial mediado, que ha sido previamente revisado3. Para la regulación metabólica, Ca2 + aumenta la actividad de Deshidrogenasas matriz localizada tres del ciclo del ácido tricarboxílico, así como complejos de la cadena respiratoria, para aumentar la producción de energía mitocondrial4,5 . Con sobrecarga de Ca2 + mitocondrial y altera mitocondrial Ca2 + manejo, Ca2 + activa transición de permeabilidad mitocondrial poro abierto (MPTP), llevando a permeabilización de la membrana interna mitocondrial, pérdida potencial de la membrana, la disfunción mitocondrial, inflamación, ruptura y en última instancia, la célula muerte6,7,8,9. Por lo tanto, Ca2 + señalización mitocondrial impacta directamente la vida celular y vías de la muerte a través de control metabólico y eje de MPTP a la muerte.
En los últimos años, allí ha sido expandiendo rápidamente interés en el estudio de Ca2 + dinámica mitocondrial debido en gran parte a la identificación de los componentes moleculares de la Ca2 + uniporter mitocondrial complejo, un interior mitocondrial importación de transportador de membrana que es un modo primario de Ca2 + en la matriz mitocondrial 10,11,12. Identificación de estas subunidades estructurales y reguladoras de la uniporter ha traído la posibilidad de apuntar genético mitocondrial Ca2 + afluencia para modulan la función mitocondrial y la disfunción y facilitó el estudio de la contribución de la uniporter complejo mitocondrial Ca2 + afluencia a enfermedad13,14,15. De hecho, Ca2 + señalización mitocondrial se ha implicado en las patologías de una gran variedad de enfermedades que van desde la enfermedad cardiaca y neurodegeneración, cáncer16,17,18, 19,20.
Dada la importancia fundamental de mitocondrial Ca2 + en el metabolismo y muerte celular y combinado con el amplio alcance de los sistemas biológicos Ca2 + señalización mitocondrial impactos, métodos para evaluar la Ca mitocondrial2 + afluencia son de gran interés. No en vano, se han desarrollado una variedad de técnicas y herramientas para medir mitocondrial Ca2 + . Estos incluyen métodos que utilizan herramientas tales como fluorescente Ca2 +-tintes sensibles21,22 y genéticamente codificado Ca2 + sensores orientados a la mitocondria, como el cameleon y aequorin23, 24. El objetivo de este artículo es destacar diferentes métodos y sistemas de modelo en el que se puede medir la absorción de Ca2 + mitocondrial. Presentamos dos métodos experimentales para evaluar mitocondrial Ca2 + afluencia capacidad. Utilizando mitocondrias cardiacas como ejemplo, detallamos una placa lector plataforma para medir mitocondrial Ca2 + absorción utilizando el Ca2 + sensible tinte verde-5N de calcio que es ideal para las mitocondrias aisladas de tejidos14 . Uso de las células 3T3 NIH cultivadas, también Describimos un análisis de basado en la proyección de imagen de microscopía confocal para medición de mitocondrial Ca2 + en células permeabilized con el Ca2 + sensible tinte Rhod-2/AM25.

<table><tbody><tr><td>Microscopio confocal de barrido láser Olympus FV1000</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Synergy Neo2 Lector de microplacas multimodo con inyectores</td> Homogeneizador de tejidos <td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kimble</td><td>886000-0022</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos de 22 x 22 mm</td><td>Corning</td><td>2850-22</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>3628</td><td></td></tr><tr><td>6 placa de pocillos</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Calcio Verde-5N</td><td>Invitrogen</td><td>C3737</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker verde FM</td><td>Invitrogen</td><td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-2, AM</td><td>Invitrogen</td><td>R1244</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>D-Manitol</td><td>Sigma</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>EMD Millipore</td><td>8510</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E8145</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-málico</td><td>Sigma</td><td>M1125</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de potasio</td><td>Fisher</td><td>BP364-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&prime;-trifosfato sal de magnesio</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Sal disódica de fosfocreatina</td><td>Sigma</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Ru360</td><td>Calbiochem</td><td>557440</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de la afluencia del calcio mitocondrial en las mitocondrias aisladas y células cultivadas

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

CA2 + por las mitocondrias es una función crítica, regulación de procesos fisiológicos y patofisiológicos en un amplio espectro de células. La capacidad para medir con precisión el influjo y eflujo de Ca2 + de las mitocondrias es importante para determinar el papel de mitocondrial Ca2 + en estos procesos. En este informe, presentamos dos métodos para la medición de mitocondrial Ca2 + manejo en mitocondrias aisladas y células cultivadas. Primero detallamos una placa lector plataforma para medir mitocondrial Ca2 + absorción utilizando el Ca2 + tinte sensible calcio verde-5N. El formato de placa base de lector evita la necesidad de equipos especializados, y el tinte verde-5N de calcio es ideal para la medición de Ca2 + de las mitocondrias del tejido aislado. Para nuestra aplicación, describimos la medida capta el Ca2 + mitocondrial en mitocondrias aisladas de tejido de corazón de ratón; sin embargo, este procedimiento puede aplicarse para medir mitocondrial absorción de Ca2 + en la mitocondria aislada de otros tejidos como hígado, músculo esquelético y cerebro. En segundo lugar, describimos un análisis basado en la microscopía confocal para medición de mitocondrial Ca2 + en células permeabilized con el Ca2 + sensible tinte Rhod-2/AM y proyección de imagen usando microscopía de escaneo láser 2 dimensiones. Este protocolo de permeabilización elimina la contaminación citosólica de tinte, que permiten grabación específica de cambios mitocondriales Ca2 +. Por otra parte, microscopía de escaneo láser permite velocidades de fotogramas alta capturar cambios rápidos de mitocondrial Ca2 + en respuesta a diferentes drogas o reactivos aplicados en la solución externa. Este protocolo se puede aplicar para medir mitocondrial Ca2 + absorción en muchos tipos de células incluyendo células primarias como las neuronas y miocitos cardiacos y líneas celulares inmortalizadas.

La figura 1 muestra mitocondrial Ca2 + mediciones de absorción en la mitocondria cardiaca aislada utilizando la plataforma de placa base de lector y el Ca2 + calcio verde-5N del tinte. Bajo condiciones de control (figura 1A), mitocondria cardiaca fueron suspendida en tampón de KCl que contiene calcio verde-5N y luego desafiado con pulsos secuenciales de CaCl2 (5 μL de una solución de CaCl2</s...

Aquí, presentamos dos protocolos para la medición de mitocondrial Ca2 + afluencia en mitocondrias aisladas y células cultivadas. Para mitocondrias aisladas, detallamos una placa base de lector Ca2 + importación de ensayo utilizando el Ca2 + sensible tinte verde-5N de calcio. Para las células cultivadas, se describe un método de microscopia confocal con el Ca2 + tinte Rhod-2/AM.

Análisis de la afluencia del calcio mitocondrial en las mitocondrias aisladas y células cultivadas

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

El objetivo general de este procedimiento es medir la afluencia de calcio mitocondrial en mitocondrias aisladas y células cultivadas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización del calcio, como la forma en que las mitocondrias ayudan a dar forma al paisaje del calcio citosólico y el papel de la dinámica del calcio mitocondrial en las enfermedades. La principal ventaja de esta técnica es que nuestros protocolos se pueden adaptar a una variedad de sistemas modelo para evaluar la capacidad de entrada de calcio mitocondrial.Voy a demostrar el procedimiento de absorción de calcio mitocondrial basado en el lector de placas. Y el Dr. Joshua Maxwell, instructor del Departamento de Pediatría, demostrará el procedimiento basado en microscopio confocal para medir el influjo de calcio mitocondrial. Comience este experimento enjuagando a fondo el corazón previamente aislado en 25 mililitros de PBS one-X helado, asegurándose de que la sangre salga completamente de los ventrículos.En cinco mililitros de PBS one-X helado, con unas tijeras afiladas, pica el tejido cardíaco en trozos pequeños. Deseche con cuidado el PBS y transfiera el pañuelo a un homogeneizador de vidrio Teflon Dounce de siete mililitros preenfriado. A continuación, añade cinco mililitros de tampón MSEGTA helado y homogeneiza hasta que no queden trozos de tejido visibles.Transfiera el homogeneizado a un tubo de 15 mililitros y luego centrifugue a 600 veces G a cuatro grados centígrados durante cinco minutos para granular los núcleos no deseados y las células intactas. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo de 15 mililitros y centrifugue a 10.000 veces G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Después de desechar el sobrenadante, mantenga la bolita mitocondrial en hielo.Para lavar el pellet, agregue cinco mililitros de tampón MSEGTA helado, vuelva a suspender y luego centrifugue a 10.000 veces G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Después de desechar el sobrenadante, repita el lavado y mantenga el pellet en hielo. Para iniciar la medición de la absorción de calcio mitocondrial utilizando un lector de placas, programe el lector para que realice una lectura cinética de la florescencia de Calcium Green-5N cada segundo durante un tiempo total de 1,000 segundos.Programe los inyectores de reactivos para dispensar cinco microlitros de solución de cloruro de calcio en varios puntos de tiempo. Luego, cebe los inyectores con la solución de cloruro de calcio que se utilizará. A continuación, agregue 200 microgramos de mitocondrias aisladas a un pocillo de una placa de 96 pocillos y agregue el volumen adecuado de tampón de cloruro de potasio para lograr un volumen total de 197 microlitros.A continuación, añada un microlitro de piruvato molar, un microlitro de malato de 500 milimolares y un microlitro de caldo de Calcio Verde-5N de un milimolar y mezcle suavemente mediante pipeteo. Incubar protegido de la luz a temperatura ambiente durante dos minutos para que las mitocondrias se energizen. Finalmente, inicie el protocolo cinético preprogramado y controle la florescencia de Calcium Green-5N.Para esta parte del protocolo, prepare la solución de trabajo Rhod-2 AM MitoTracker Green mezclando 20 microlitros de Rhod-2 AM, 0,2 microlitros de MitoTracker Green, 2,5 microlitros de F-127 plurónico al 20% y un mililitro de solución Tyrode. En un cubreobjetos previamente preparado, cubierto con células NIH/3T3, agregue la solución Rhod-2 AM MitoTracker Green gota a gota hasta que esté cubierta. Para que las celdas se carguen con los tintes, incube el cubreobjetos protegido de la luz durante 30 minutos a temperatura ambiente.Para desesterificar Rhod-2 AM, retire suavemente la solución Rhod-2 AM MitoTracker Green y reemplácela con aproximadamente 300 microlitros de solución fresca de Tyrode para cubrir las células. Incubar el cubreobjetos protegido de la luz durante 30 minutos a temperatura ambiente. Ahora, transfiera el cubreobjetos a la cámara de imágenes del microscopio y llene la cámara con solución de lavado.Ajuste el enfoque para observar las celdas y el contraste de fase con un aumento de 40X. Para permeabilizar la membrana plasmática de las células cargadas Rhod-2 AM MitoTracker Green, retire la solución de lavado del cubreobjetos y reemplácela con aproximadamente 300 microlitros de solución de permeabilización para cubrir las células. Monitorizar la morfología de la membrana plasmática durante este proceso.Cuando se permeabilizan, las células desarrollarán una superficie rugosa. Retire la solución de permeabilización inmediatamente después de la permeabilización completa y reemplácela con una solución interna sin calcio. A continuación, concéntrese en las células permeabilizadas que muestran una clara colocalización de Rhod-2 y MitoTracker Green para obtener imágenes de la floración de Rhod-2 y Mitotracker Green simultáneamente.A continuación, disminuya el láser del microscopio y gane los ajustes para hacer que la florescencia mitocondrial de Rhod-2 sea tenue y apenas visible. Para capturar la cinética de los cambios en el calcio mitocondrial, seleccione la configuración del microscopio para adquirir exploraciones bidimensionales a una velocidad de fotogramas y un curso de tiempo adecuados. Retire la solución interna sin calcio asegurándose de no alterar las células y el enfoque del microscopio y, a continuación, inicie la adquisición de imágenes.Con una jeringa, agregue manualmente la solución interna repleta de calcio en el punto de tiempo de 10 segundos. Por último, en el software de adquisición de imágenes, seleccione las regiones de interés para abarcar las regiones de colocalización de la señal Rhod-2 y MitoTracker Green. Cuando se agrega cloruro de calcio a las mitocondrias cardíacas aisladas, la florescencia del tinte de calcio aumenta a medida que las mitocondrias absorben el calcio de la florescencia tampón.Sin embargo, en la tercera edición de calcio, la florescencia comienza a aumentar repentinamente después de una caída, lo que indica una sobrecarga de calcio mitocondrial y una apertura de poros de transición de permeabilidad a la permeabilidad mitocondrial que puede conducir a la permeabilización de la membrana interna mitocondrial. Por otro lado, cuando las mitocondrias se tratan previamente con un inhibidor de la absorción de calcio mitocondrial, hay un aumento en la fluorescencia después de cada adición de calcio. En las células NIH/3T3 cultivadas, la red mitocondrial se tiñe con el colorante MitoTracker Green.Las células también se tiñen con colorante Rhod-2 y, después de la permeabilización de la saponina, el Rhod-2 citosólico se elimina, dejando solo la tinción mitocondrial que se colocaliza con el MitoTracker. Dado que Rhod-2 puede acumularse en estructuras no mitocondriales, el análisis debe centrarse solo en las regiones donde MitoTracker y Rhod-2 se colocalizan. La adición de calcio provoca un aumento de la florescencia de Rhod-2 en las células de control, mientras que en las células tratadas con el inhibidor de la absorción de calcio mitocondrial, no hay cambios en la florescencia.Estos protocolos se pueden aplicar para medir la absorción de calcio mitocondrial en muchos tipos de células, incluidas las células primarias como los miocitos cardíacos y las neuronas en líneas celulares inmortalizadas, así como las mitocondrias aisladas de muchos tipos de tejidos, incluidos el corazón, el hígado y el cerebro. El manejo de calcio por parte de las mitocondrias es una función crítica que regula los procesos fisiológicos y fisiopatológicos en diferentes células. La capacidad de medir con precisión la afluencia de calcio de las mitocondrias es una parte importante para determinar el papel del manejo del calcio mitocondrial en estos procesos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir el flujo de calcio mitocondrial en mitocondrias aisladas y células cultivadas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este protocolo describe un método para la medición en tiempo real de los flujos de calcio mitocondrial de imagen fluorescente. El método se aprovecha de una circular permutaciones YFP basada en sensor de calcio de doble excitación radiométrica (radiométrica pericam-mt) expresa selectivamente en las mitocondrias.

Seguimiento de los cambios dinámicos en niveles de calcio mitocondrial de la apoptosis mediante un sensor de calcio genéticamente codificados

Un protocolo espectrofluorométrico para la medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial en el corazón de ratón mitocondrias aisladas se presenta aquí. El ensayo involucra la medición simultánea de las mitocondrias...

Multi-parámetro de medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad en el corazón del ratón mitocondrias aisladas

Este video describe un ensayo basado en un lector de placas para medir la absorción de calcio mitocondrial en mitocondrias aisladas. El ensayo analiza la señal de fluorescencia de un colorante fluorescente sensible al calcio para estudiar la cinética de la absorción de calcio mitocondrial y la sobrecarga de calcio.

Ensayo de absorción de calcio mitocondrial: un método basado en lectura de placas para medir la absorción de calcio en mitocondrias aisladas

Este video describe un ensayo basado en imágenes de microscopía confocal para medir la absorción de calcio mitocondrial en células cultivadas. El ensayo utiliza el colorante fluorescente sensible al calcio Rhod-2/AM para medir el calcio mitocondrial en células cultivadas permeabilizadas.

Ensayo de afluencia de calcio para medir la absorción de calcio mitocondrial en células cultivadas

Este video muestra el procedimiento para evaluar la capacidad de retención de calcio mitocondrial mediante el monitoreo de cambios en tiempo real en la fluorescencia a medida que las mitocondrias absorben calcio. Este ensayo es útil para estudiar la función mitocondrial y los procesos relacionados con el calcio, incluida la apoptosis y las enfermedades neurodegenerativas.

Determinación de la capacidad de retención de calcio de mitocondrias aisladas

En este trabajo se describe la aplicación de la microscopía electrónica cryoanalytical para la medición cuantitativa de contenido de calcio total y su distribución en la resolución subcelular en muestras biológicas fisiológicamente definidos.

Medición de calcio total en neuronas por Sonda de Electrones X-ray microanálisis

La comparación del potencial de membrana mitocondrial entre muestras proporciona información valiosa sobre el estado celular. Se describen los pasos detallados para aislar las mitocondrias y evaluar la respuesta a los inhibidores y desacopladores mediante fluorescencia. El método y la utilidad de este protocolo se ilustran mediante el uso de un cultivo celular y un modelo animal de estrés celular.

Aislamiento y análisis funcional de las mitocondrias de las células cultivadas y ratón de Tejidos

Las mitocondrias pueden utilizar el potencial electroquímico a través de su membrana interna (Δ Ψm) para secuestrar calcio (Ca2 +), lo que les permite dar forma Ca 2+ citosólico de señalización dentro de la célula. Se describe un método para medir simultáneamente las mitocondrias Ca 2+ absorción y ΔΨ m en células vivas utilizando colorantes fluorescentes y microscopía confocal.

Medición simultánea de calcio mitocondrial y mitocondrial potencial de membrana en células vivas por microscopía fluorescente

Este protocolo tiene por objeto describir un método para examinar la capacidad de retención de Ca2 + y Ca2 +- activa hinchazón de mitocondrias aisladas de SH-SY5Y mitocondrial de células paso a paso.

Mitocondrial de Ca2 + retención capacidad análisis y Ca2 +-activa hinchazón mitocondrial ensayo

Este proctocol tiene como objetivo proporcionar un método para imágenes de Ca2+ mitocondrial in vitro e in vivo en astrocitos y neuronas.

Obtención de imágenes de ca2+ mitocondrial en astrocitos y neuronas utilizando indicadores de Ca2+ codificados genéticamente (GECI)

Este método explota la contribución del poro de transición de permeabilidad mitocondrial a la fuga de protones de baja conductancia para determinar el umbral de voltaje para la apertura de poros en ratones con síndrome de X frágil neonatal con mayor contenido de coenzima Q mitocondrial de cardiomiocitos en comparación con el control de tipo salvaje.

Evaluación de la probabilidad abierta del poro de transición de permeabilidad mitocondrial en el contexto del exceso de coenzima Q

Aprende a medir la afluencia de calcio mitocondrial en mitocondrias aisladas y células cultivadas mediante lectura en placa y microscopía confocal. Estos protocolos adaptables permiten estudiar la señalización del calcio en diversos sistemas modelo.

Análisis de la afluencia del calcio mitocondrial en las mitocondrias aisladas y células cultivadas

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