Name: Animal doméstico proyección de imagen de neuroinflamación usando 11C DPA-713 en un modelo murino de ictus isquémico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Aprende a cuantificar la neuroinflamación en modelos murinos de ictus isquémico mediante imagen PET con el radiotrazador DPA-713. Este protocolo permite visualizar procesos dinámicos en tiempo real y validar hallazgos con autoradiografía ex vivo.

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Los autores desean agradecer el laboratorio Buckwalter (especialmente el Dr. Todd Peterson) para proporcionar el modelo de ratón y cirugías dMCAO y farsa. Además, nos gustaría agradecer a Thomas Liguori de Invicro por su asistencia técnica con VivoQuant software de análisis de imagen, el Dr. Tim Doyle, Dr. Laura Pisani, Dr. Frezghi Habte del animal pequeño SCi3 centro de Stanford para su asesoramiento de imagen y asistencia en el desarrollo de este protocolo de imagen y la instalación de radioquímica (especialmente el Dr. Jun Park) por su ayuda a la síntesis de [11C] DPA-713.

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Los autores declaran no hay conflictos de intereses.

El protocolo presentado describe un método para la cuantificación de la neuroinflamación en ratones dMCAO y simulado utilizando [11C] DPA-713-PET. TSPO-PET es el biomarcador más ampliamente investigado imágenes para visualizar y medir la neuroinflamación en vivo hasta la fecha. Expresión de TSPO es upregulated en glia en el cerebro durante la inflamación, permitiendo la detección no invasiva y la cuantificación de la neuroinflamación. Por otra parte, es una técnica altamente traducible, lo que es una valiosa herramienta en investigación clínica y preclínica. Este protocolo y resultados representativos destacan la conveniencia de utilizar [11C] DPA 713 PET para detectar y monitorear alteraciones capensis en accidente cerebrovascular y otros trastornos neurológicos en vivo.
En este estudio, dMCAO la cirugía se llevó a cabo con ratones hembra de 3 meses C57BL/6. Este modelo fue elegido como da lugar a un infarto altamente reproducible restringido a la corteza somatosensorial, proporcionando un modelo de isquemia focal permanente con baja variabilidad en comparación con otros modelos de accidente cerebrovascular (p. ej., medio cerebral arterial método de oclusión (MCAO) filamento)14. Animal doméstico proyección de imagen de modelos de movimiento tiene la ventaja de que contiene una región de referencia interna en el cerebro para cada animal con ROIs en el hemisferio contralateral. Ya que habrá alguna inflamación que los resultados de la cirugía sola, es importante incluir los ratones que experimentaron la cirugía simulada en el diseño del estudio, por el que la craneotomía y manipulación de meninges sin oclusión de la arteria fue realizada. Craneotomía solo puede ocasionar la interrupción para el tejido neuronal subyacente y la introducción de patógenos hacia la respuesta inmune independiente de carrera20. Algunos inflamación después de la cirugía ficticia por lo tanto se espera y debe ser evaluada en paralelo a dMCAO para excluir la posibilidad de señal debido a la cirugía sola. Para evitar incluyendo inflamación resultante de la cirugía sin movimiento en el análisis de cohorte de dMCAO, Sr. proyección de imagen se realizarán para confirmar el desarrollo de carrera exitosa cirugía e infarto. MRI también proporciona un marco de referencia estructural, que es indispensable establecer con precisión el infarto y ROIs contralaterales. Además, procesamiento de imagen precisa incluyendo definición de ROI y registro de la imagen son necesarias para la cuantificación confiable.
Limitaciones adicionales se deben tener en cuenta cuando se trabaja con C-11 etiquetado radiotrazadores para PET y autorradiografía. Es imprescindible tener en cuenta la corta vida media (min 20,33) de C-11, con su uso restringido generalmente a la investigación de institutos con acceso ciclotrón in situ. Radiactividad apropiado transporte ruta, administración de dosis y momentos de adquisición deberán determinarse de antemano con un plan detallado preparado del flujo de trabajo del experimento para que el equipo pueda trabajar rápidamente y eficientemente. El diseño y puesta en marcha de este estudio ha sido delineado para dar cabida a la proyección de imagen de 4 ratones simultáneamente para aumentar la salida de datos que se puede obtener cuando se utiliza un trazador C-11. Si es posible, es recomendable tener todos los ratones canulados y en medio de su TC cuando el palpador C-11 llega en el centro de proyección de imagen para asegurar el decaimiento de la radiosonda mínima antes de la inyección. También mejor este protocolo paso a paso se lleva a cabo por un equipo que contiene al menos 3 investigadores para permitir la canalización rápida, medición de dosis, inyección de trazador, PET-TAC y cerebro seccionado antes de significativo decaimiento radiactivo. Requiere dos personas para llevar a cabo la iniciación de la exploración del animal doméstico y la inyección de todos los 4 ratones simultáneamente. La razón para la adquisición de la mascota antes de la inyección del principio es garantizar que la farmacocinética y dinámica de la distribución del trazador en la sangre y las regiones de interés se capturan con precisión y completamente. Muchos pasos pueden requerir entrenamiento vigoroso y práctica para asegurar la buena marcha del experimento. En particular, este protocolo depende de canulación de la vena de éxito cola de ratones C57BL/6, que puede ser difícil debido a la presente en la cola de cabello oscuro y puede llegar a ser más difíciles después de accidente cerebrovascular o si los ratones mismo la proyección de imagen en múltiples puntos del tiempo .
Otra consideración para la proyección de imagen PET incluye grabación cuidadosa de radiosonda dosis y residual actividad medidas, incluyendo la hora exacta de la medida. Esto es esencial para la corrección de la descomposición exacta de la dosis inyectada en el momento de la exploración y se utiliza para obtener una medición precisa de la absorción del trazador (es decir, % ID/g) para cada ROI. Es imprescindible conocer la cantidad exacta de la radiactividad que estaba presente en cada ratón en el momento de la exploración para garantizar el análisis de una imagen precisa. Por lo tanto, es aconsejable sincronizar los relojes en el equipo analizador y calibrador de la dosis para evitar el error al utilizar isótopos de breve duración como C-11.
Precisa cuantificación de imagen PET también puede ser limitada por la precisión del escáner y puesta a punto. Por lo tanto, para garantizar la exacta cuantificación de imágenes PET/CT, es importante llevar a cabo controles de calidad para los componentes de la CT y la PET del escáner. Controles de calidad CT incluyen acondicionado fuente de rayos x, luz/oscuridad y centro off set calibrado. Estas calibraciones miden y correcto para el ruido del sistema y debe ser realizado antes de su adquisición según lo recomendado por el fabricante del escáner. Las calibraciones deben realizarse también para el escáner PET. Típicamente se trata de una exploración "estándar / mascota fantasma", que contiene una concentración conocida de la radiactividad de la exploración. Al preparar el estándar, es mejor usar el mismo radioisótopo utilizado en el estudio, una dosis comparable a la había administrada a un ratón en un volumen similar al cuerpo de un ratón y la adquisición misma parámetros como proyección de imagen de animal. Una jeringa de 20 mL con radiosonda diluido en agua se utiliza para el estándar en este protocolo, con los posteriores resultados de la proyección de imagen PET permite calcular un factor de corrección basado en la dosis real medida por el detector de calibración. La proporción de corrección se puede aplicar a los datos de imágenes adquiridos en el experimento para asegurar la exacta cuantificación de captación del trazador en las regiones de interés en imágenes PET. Esto explica la gama de positrones del radionúclido además teniendo en cuenta cualquier actividad de fondo presente en el día de la exploración. Como el calibrador de la dosis es una parte integral de la generación de este factor de corrección, es imprescindible que este equipo también es calibrado regularmente según las directrices del fabricante.
Al realizar ex vivo autorradiografía es importante escoger un momento óptimo para la eutanasia después de la inyección, para asegurar la alta señal a fondo en regiones de interés. Treinta minutos posterior a la inyección fue elegido por autorradiografía de DPA 713 [11C] usando los datos adquiridos durante la dinámica imagen de PET -es decir, el en vivo TAC dinámico como guía, mientras que también teniendo en cuenta la corta vida media de C-11 y el tiempo involucrados para la sección y exponer el tejido cerebral después de la extracción. Teniendo en cuenta esto, se debe realizar [11C] DPA 713 autorradiografía en una cohorte independiente de ratones para permitir la inyección de una dosis mayor de DPA 713 [11C] y a 30 minutos vez punto de perfusión y a la eutanasia bajo anestesia. Realizar un pequeño en vivo estudio piloto del animal doméstico con unos 3-4 los ratones antes de realizar la autorradiografía ex vivo será útil para determinar el momento óptimo para autorradiografía. Una consideración adicional para ex vivo autorradiografía es recuperar los ratones después de la inyección o mantenerlos anestesiados hasta la eutanasia. Mantenerlos anestesiados imita las condiciones de la exploración y aseguran la cinética de distribución o excreción del radiotrazador no son alterados por la recuperación. Además, esto impide que el estrés adicional en los ratones evitando la recuperación y posterior inducción. Por último, sería una adición útil al Protocolo de ex vivo evaluar el daño regional en las rebanadas de cerebro utilizado por autorradiografía mediante inmunohistoquímica tinción (después de decaimiento radiactivo) para generar una imagen de alta resolución de la localización del infarto y volumen.
Como hay limitaciones con el uso de un trazador de C-11 basado, este protocolo puede modificarse fácilmente para el uso con un F-18 (Half-Life de 109,77 min) TSPO tracer, que puede ser más aplicable a lugares sin un ciclotrón in situ. Además, este protocolo describe el uso de un montaje de imágenes 4-ratón. Aunque este método de alto rendimiento es óptimo cuando se utiliza un trazador C-11, este protocolo puede ser modificado para los usuarios de ratón imágenes camas. Una planificación cuidadosa y el entrenamiento constante en las técnicas descritas en el presente Protocolo dará lugar a la generación de una riqueza de datos mediante [11C] DPA-713, que fácilmente puede ser aplicado a investigar el papel de la neuroinflamación en la manifestación de la enfermedad y progresión en otros modelos de roedores de los trastornos neurológicos. Por otra parte, esta técnica podría utilizarse para evaluar la respuesta en vivo a la terapéutica inmunomoduladora dirigida a microglia/macrófagos.

Movimiento es la quinta causa de muerte y una causa importante de discapacidad en los Estados Unidos1. Ictus isquémico representa una abrumadora mayoría de estos casos (~ 87%), que ocurre cuando hay interrupción localizada en el flujo sanguíneo al cerebro (por ejemplo, por un coágulo de sangre o depósito graso). Posteriormente se reducen los suministros de oxígeno y nutrientes a las zonas afectadas y se inicia una compleja cascada patológica resultante en la muerte neuronal dentro del núcleo de accidente cerebrovascular (infarto) además de las áreas circundantes. Neuroinflamación es un componente crucial en el camino que conduce a este daño, con ambas células inmunes del cerebro residente (microglia) e infiltración de células inmunes periféricas (neutrófilos, linfocitos T, linfocitos B y monocitos/macrófagos) pensado para contribuir a este destructiva de la cascada2,3. Macrófagos y microglia activado son centrales a esta respuesta capensis, con reportes de efectos deletéreos y beneficiosos tras Ictus isquémico2. Por lo tanto, es imperativo evaluar la contribución en vivo de estas células después de la carrera.
El PET es una poderoso 3-dimensional molecular técnica de imagen que permite la visualización de los biológico procesos en vivo mediante el uso de moléculas específicas con positrones (β +) emisión de radionucleidos como 11C, 13N, 15O y 18f el. Este método tiene muchas ventajas sobre los métodos ex vivo (p. ej., inmunohistoquímica) ya que permite la adquisición de información molecular en tiempo real, en vivo temas intactos y permite la investigación longitudinal. Animal doméstico proyección de imagen de TSPO, un marcador de microglia activada y las células de linaje mieloide periféricas, proporciona un medio para cuantificar y seguir las respuestas inmune innata de la célula dentro del cuerpo y puede ser utilizado para evaluar la inflamación después de movimiento y respuesta a la terapéutica intervenciones. TSPO, anteriormente conocido como el receptor periférico de tipo benzodiazepina, es una proteína de 18 kDa que se cree que desempeñan un papel en el transporte de colesterol y la síntesis de neuroesteroides4. Por otra parte, la evidencia sugiere que la TSPO participa en neuroinflamación y la supervivencia neuronal5,6, con informes de aumento de la expresión en muchos trastornos neurológicos que implican inflamación incluyendo carrera7, 8de demencia, la enfermedad de Parkinson9 y esclerosis múltiple10. TSPO se encuentra en las membranas mitocondriales externas y se expresa altamente en la periferia, especialmente en los tejidos asociados esteroides (e.g., glándulas) y con niveles intermedios en el corazón, los riñones y los pulmones10. Sin embargo en el cerebro saludable, TSPO niveles son bajo y restringido principalmente a glia6,11. A lesión neuronal, como el observado en movimiento, los niveles de TSPO en sistema nervioso central (SNC) aumentan considerablemente. Esta regulación al alza observada de TSPO puede explotarse a imagen neuroinflamación en vivo, con niveles de expresión proporcionando un indicador preciso de la severidad de la inflamación. Por lo tanto, el objetivo de este método es cuantificar con precisión el aporteen vivo de neuroinflamación en un modelo murino de ictus isquémico con la TSPO-PET.
Se han desarrollado múltiples trazadores TSPO para la proyección de imagen del animal doméstico de neuroinflamación. Aquí, la proyección de imagen de TSPO-PET se describe usando [11C] DPA 71312, una prometedora segunda generación tracer TSPO, que ha demostrado mayor señal a ruido y menor fijación no específica de los históricamente más usados [11C] PK11195 13 . Por ejemplo, el modelo de ratón de dMCAO de carrera fue elegido para este método14. Este modelo implica craneotomía temporal y la permanente ligadura de la arteria cerebral media distal, resultando en isquemia focal de la corteza somatosensorial. Esto es una ventaja en investigación pre-clínica cerebrovascular debido la alta reproducibilidad de daño isquémico y baja mortalidad asociada a este modelo. Hasta la fecha, estudios imagenológicos TSPO-PET todavía tienen que ser registrados en el modelo de roedores dMCAO. Sin embargo, animal doméstico proyección de imagen estudios previos utilizando el modelo de oclusión (MCAO) de la arteria cerebral media, un modelo de movimiento más intenso y variable, en ratones y ratas, han reportado expresión TSPO para incrementar del día 3 y pico por día 7 posterior al accidente cerebrovascular15, 16,17,18. Por lo tanto, se realizó un PET 6 días post-dMCAO la proyección de imagen para que coincidan con la expresión elevada de TSPO. [11C] DPA-713 la absorción en el cerebro se evaluó en ipsolateral (infartado) y hemisferios contralaterales. TSPO-PET se combinó con resonancia magnética estructural, permitiendo la delimitación precisa de infarto y contralaterales regiones de interés (ROIs). Aquí describimos basada en un atlas y un enfoque ROI basada en MRI para calcular la absorción de DPA 713 [11C]. También se evaluó la captación del radiotrazador en bazo para investigar los niveles periféricos de inflamación entre los grupos. Este método tiene el potencial para proporcionar penetraciones importantes en la dinámica espacio-temporal y el papel de las interacciones específicas neuroimmune en accidente cerebrovascular y otras enfermedades neurológicas.

<table><tbody><tr><td>Escáner PET/CT Inveon</td><td>Siemens Versión</td><td>4.2</td><td></td></tr><tr><td>Escáner de resonancia magnética</td><td>Varian</td><td></td><td>7 Telsa</td></tr><tr><td>Software ParaVision</td><td>Bruker</td><td>versión 6.0.1</td><td>Software operativo de resonancia magnética</td></tr><tr><td>Software VivoQuant</td><td>InVicro</td><td>versión 2.5</td><td>Software de análisis de imágenes</td></tr><tr><td>Software Inveon Research Workspace Siemens</td><td>Versión</td><td>4.2</td><td>Software operativo del escáner. Incluye microQView, el software de gestión de posprocesamiento</td></tr><tr><td>Calibrador de dosis</td><td>Capintech</td><td></td><td>CRC-15 PET</td></tr><tr><td>Typhoon generador de imágenes de fósforo 9410</td><td>GE Healthcare</td><td>8149-30-9410</td><td></td></tr><tr><td>Catéteres de mariposa</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>BFL-24</td><td>Aguja de 27,5</td></tr><tr><td>G Jeringas de 1 mL</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringas de insulina</td><td>BD</td><td>329461</td><td>Jeringas de insulina de 0,5 mL con aguja</td></tr><tr><td>Jeringa de 20 mL&nbsp;</td><td>Jeringa VWR</td><td>BD302831</td><td>BD Punta deslizante graduada</td></tr><tr><td>Pegamento tisular</td><td>Santa Cruz Animal Health</td><td>sc-361931</td><td>3 mL</td></tr><tr><td>Lámpara de calor</td><td>Fluker</td><td>27002</td><td>5.5" lámpara de calor reptile con pinza e interruptor</td></tr><tr><td>0.9% solución salina estéril</td><td>Pfizer</td><td>00409-4888-10</td><td>Cloruro de sodio al 0.9% para inyección, 10 mL</td></tr><tr><td>Lubricante ocular</td><td>Watson Rugby PV926977</td><td></td><td>Lágrimas Artificiales Ungüento Lubricante para los Ojos, 1/8 oz</td></tr><tr><td>Hojas absorbentes Chux ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td></td><td>1420662 Acolchado absorbente desechable</td></tr><tr><td>Tijeras de iris</td><td>World Precision Instruments</td><td>503708-12</td><td>11.5 cm, recta, paquete de 12</td></tr><tr><td>cintas quirúrgicas</td><td>3M Durapore</td><td>1538-0</td><td>Rollo de 1/2" x 10 yardas, seda, hipoalergénico</td></tr><tr><td>Cama de ratón para mascotas</td><td>En casa</td><td></td><td>Encendedor de cama de PET de 4 ratones</td></tr><tr><td></td><td>Bic</td><td>UDP2WMDC</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td>Isothesia, anestésico inhalatorio, 250 mL</td></tr><tr><td>Oxígeno</td><td>Praxiar</td><td>UN1072</td><td>Gas comprimido</td></tr><tr><td>Casete de autorradiografía</td><td>Cole Palmer</td><td>EW-21700-34</td><td>Aluminio, 8" x 10"</td></tr> <tr><td>Película de autorradiografía</td><td>GE Life Sciences</td><td>28-9564-78</td><td>Almacenamiento Pantalla de fósforo BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 &times; 25 cm, solo pantalla</td></tr><tr><td>Cuchillas de micrótomo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>30-508-35</td><td>MB35 Premier Desechable, ángulo de corte de 34 grados</td></tr><tr><td>Microtomo Microm</td><td></td><td></td><td>HM 550</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Superfrost&trade; Plus Portaobjetos de microscopio</td></tr><tr><td>OCT líquido</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Formulación de glicoles y resinas solubles en agua para el corte de criostato a temperaturas de -10 °C; C (14&deg; F) e inferiores</td></tr><tr><td>Moldes de congelación</td><td>Poly sciences</td><td>18646A-1</td><td>Moldes de parafina desechables</td></tr><tr><td>Saran wrap</td><td>Saran</td><td></td> 25700001300 <td></td></tr><tr><td>Desinfectante</td><td>Virkon S</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

animal doméstico proyección de imagen de neuroinflamación usando [11c] dpa-713 en un modelo murino de ictus isquémico

PET Imaging of Neuroinflammation Using [11C]DPA-713 in a Mouse Model of Ischemic Stroke

Neuroinflamación es central en la cascada patológica después de accidente cerebrovascular isquémico. Métodos de proyección de imagen moleculares no invasivos tienen el potencial para proporcionar penetraciones importantes en la dinámica temporal y el papel de ciertas interacciones del neuroimmune en tiempos. Específicamente, la proyección de imagen de tomografía por emisión de positrones (PET) de translocador proteína 18 kDa (TSPO), un marcador de microglia activada y las células de linaje mieloide periféricas, proporciona un medio para detectar y rastrear neuroinflamación en vivo. Aquí, presentamos un método para cuantificar con precisión la neuroinflamación usando [11C]N,N-Diethyl-2-[2-(4-methoxyphenyl)-5,7-dimethylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]acetamide ([11C] DPA-713), una prometedora segunda generación TSPO-PET radiotrazador, oclusión distal de la arteria cerebral media (dMCAO) en comparación con ratones sham-funcionado. MRI fue realizado 2 días post-dMCAO cirugía para confirmar el movimiento y definir la localización del infarto y el volumen. La proyección de imagen PET/computado Tomography (CT) se realizó en 6 días post-dMCAO para captar el máximo aumento TSPO después de accidente cerebrovascular. Cuantificación de las imágenes PET se realizó para evaluar la captación de [11C] DPA-713 en el cerebro y bazo de ratones dMCAO y simulada para evaluar los niveles centrales y periféricos de la inflamación. En vivo [11C] Absorción cerebral DPA 713 fue confirmada usando ex vivo autorradiografía.

Ratones experimentaron MRI para verificar tiempos de éxito y el [11C] DPA 713 PET se realizó escaneando simultáneamente 4 ratones. PET, CT y Sr. imágenes fueron co registrado antes manualmente dibujo cerebro ROIs y realizar el análisis de atlas cerebro de split semi automatizado, para investigar la absorción del trazalíneas en regiones ipsolaterales y contralaterales (figura 2).
Imágenes PET/TC y las curvas tiempo actividad (actividad de radiosonda TAC como una función de tiempo) muestran mayor [11C] DPA 713 absorción en ipsolateral versus hemisferios contralaterales (figura 3A). Datos de cuantificación de imágenes dinámicas de cerebro del animal doméstico, usando suma de 50-60 min, reveló un aumento significativo en la absorción del trazalíneas (% ID/g) en el ipsilateral (infartado) en comparación con el hemisferio contralateral en dMCAO, pero no en ratones sham utilizando el manual elaborado Enfoque ROI (figura 3B). También se observó la absorción creciente en el hemisferio ipsilateral entre ratones dMCAO y farsa. No observaron diferencias significativas entre hemisferios ipsilaterales y contralaterales fueron usando el método atlas, probablemente debido al atlas ROIs ser más grande que el tamaño del infarto (generalmente restringido a la corteza somatosensorial), por lo tanto, diluir la señal. Sin embargo, se observó total absorción creciente en dMCAO en comparación con el tratamiento simulado para todos ROIs, que alinea con informes anteriores con ratones modelo MCAO, demostrando mayor expresión de TSPO en regiones fuera de infarto19. Relaciones ipsilateral contralateral se incrementaron en dMCAO versus ratones sham utilizando ambos métodos; sin embargo, esta diferencia sólo fue significativa en la corteza con el enfoque de atlas del cerebro debido a la mayor varianza en el enfoque de retorno de la inversión. Esto se puede solucionar aumentando el número de ratones de cada grupo. Cuantificación de captación de DPA 713 [11C] en bazo no mostraron diferencias significativas entre grupos (figura 4).
Resultados de la proyección de imagen de la mascota del ratón de dMCAO de la cerebral fueron confirmados por ex vivo de alta resolución digital autorradiografía (figura 5). Mayor [11C] DPA 713 absorción fue observada en el tejido infartado con insignificante señal en tejido cerebral sano circundante. Cuantificación de estas imágenes reveló ipsilateral contralateral proporciones que van desde 1.4 a 2.09 en ratones dMCAO.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57243/57243fig1.jpg"> Figura 1: Escáner de PET y área de trabajo configuración. Los espacios de trabajo cubrieron en protector acolchado absorbente para crear un ambiente estéril. (A) después de calibrado, una cama de ratón 3D impreso, equipada para 4 ratones de imágenes al mismo tiempo fue asegurada en el escáner y conos de nariz de todos los 4 ratones adjunto a la anestesia. (B) equipo necesario para la proyección de imagen PET se prepararon con antelación, incluyendo catéteres de 27,5 G lleno de solución salina, lubricante ocular, hisopos de etanol, lámparas de calor, cinta quirúrgica, pegamento de tejidos, jeringas de dosis de 0.5 mL, tijeras y un mechero. (C) para la inyección de la radiosonda, coloque las jeringas de salino-ras y tijeras en la parte posterior del escáner. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57243/57243fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57243/57243fig2.jpg"> Figura 2: ROI ipsilateral Contralateral y hemisferio derecho/izquierdo-Split Brain Atlas proceso de análisis de imagen PET. Análisis de imagen software se utilizó para determinar la captación de trazador en ipsolaterales y contralaterales de las regiones de interés (ROIs) utilizando manualmente dibujado ROIs y un enfoque semiautomático atlas división 3D. Registro automático de PET-TAC 3D fue realizado siguió por registro manual del cerebro MRI dentro del cráneo de ratón correspondiente definido en la imagen de CT. La herramienta 3D de ROI se utiliza para dibujar manualmente ipsolateral (rojo) y contralaterales ROIs (verde) con el infarto en la resonancia magnética como referencia. El método split-brain, el atlas del cerebro de ratón izquierda/derecha-split 3D fue cargado y montado dentro del cráneo según la definición de la imagen de CT. ROIs del cerebro usados para la cuantificación en este atlas del cerebro de ratón 3D incluyeron corteza izquierda (gris oscuro), hipocampo izquierdo (Aciano Azul), estriado de izquierda (rosa profundo), Right Cortex (tomate rojo), hipocampo derecho (verde) y derecho Striatium (cian). La captación de [11C] DPA-713 en cada región se obtuvo en nCi/cc y posteriormente fue convertido a %ID/g por normalizar a la dosis de corrección de decaimiento en el tiempo de exploración para cada ratón. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57243/57243fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57243/57243fig3.jpg"> Figura 3 : Representante en Vivo [11C] cerebro de DPA 713 absorción en DMCAO y ratones Sham. (A) imágenes PET-TAC dinámica y TAC demuestra mayor [11C] DPA 713 absorción en la corteza ipsolateral de los ratones que experimentaron la DMCAO (n = 3) y un ligero aumento de sham (n = 3) funcionado ratones, ratones DMCAO demostrar significativamente mayor contraste inyectado dosis de porcentaje entre el infarto y el lado contralateral del cerebro (%ID/g). (B) cuantificación de PET (50-60 min Resumen) reveló la absorción significativamente mayor en el ROI ipsilateral utilizando el enfoque de retorno de la inversión y en la corteza (Ctx) utilizando el método split-brain atlas. No hubo diferencias significativas se encontraron en el hipocampo (HC) o estriado (Str). Mayor proporción ipsolateral y contralateral fueron vistos usando análisis de ambos enfoques pero sólo fue estadísticamente significativo en el Ctx utilizando el método de atlas del cerebro. * (p &lt; 0,05), *** (p &lt; 0,001) <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57243/57243fig3large.jpg" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57243/57243fig4v2.jpg"> Figura 4: Representante En Vivo [11C] DPA 713 bazo absorción en dMCAO y ratones Sham. (A) DPA-713 dinámico [11C] imágenes de PET/CT muestra bazo ROIs en dMCAO (n = 3) y simulada (n = 3) ratones. (B) resultados cuantitativos no demuestran resultados significativos en la absorción de bazo entre ratones dMCAO y farsa. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57243/57243fig4v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57243/57243fig5v2.jpg"> Figura 5 : Representante autorradiografía resultados. Imágenes de autorradiografía digital demuestran mayor [11C] DPA 713 la absorción en el ipsilateral en comparación con el hemisferio contralateral. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57243/57243fig5v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Proyección de imagen de tomografía por emisión de positrones (PET) de translocador proteína 18 kDa (TSPO) proporciona un medio no invasivo para visualizar el dinámico papel de la neuroinflamación en el desarrollo y progresión de enfermedades del cerebro. Este protocolo describe autorradiografía TSPO-PET y ex vivo para la detección de neuroinflamación en un modelo murino de accidente cerebrovascular isquémico.

Animal doméstico proyección de imagen de neuroinflamación usando [11C] DPA-713 en un modelo murino de ictus isquémico

Neuroinflammation is central to the pathological cascade following ischemic stroke. Non-invasive molecular imaging methods have the potential to provide ...

El objetivo general de este experimento es cuantificar con precisión la distribución espacial y el alcance de la neuroinflamación en un modelo murino de accidente cerebrovascular isquémico utilizando imágenes TSPO-PET y RM y validar estos hallazgos in vivo utilizando autorradiografía ex vivo. Estoy muy emocionado de compartir con ustedes esta guía paso a paso sobre cómo usar las imágenes PET para visualizar la neuroinflamación en un sujeto vivo. Aquí estamos usando un modelo de ratón de trazo como ejemplo.Ahora bien, ¿por qué querrías utilizar esta técnica? Hay un par de razones. La primera es que se cree que la neuroinflamación, que es simplemente la inflamación que ocurre en el sistema nervioso central, está íntimamente asociada y realmente es algo que subyace a muchas, muchas enfermedades cerebrales, incluido el accidente cerebrovascular, pero también la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis múltiple, el Parkinson, y la lista continúa.Así que es increíblemente importante que tengamos estas técnicas que realmente nos permitan estudiar estos fenómenos biológicos. En segundo lugar, la PET ofrece una serie de ventajas sobre algunas de las técnicas más tradicionales. Por ejemplo, la mayoría de estas técnicas tradicionales se basan en gran medida en el uso de tejido cerebral post-mortem humano y de ratón, y aunque han proporcionado una serie de ideas importantes, estas técnicas son estáticas por naturaleza, lo que significa que solo pueden decirnos información sobre un momento en el tiempo.Dado que sabemos que tanto el cerebro como el sistema inmunológico son altamente dinámicos, tiene sentido que queramos tener una técnica que nos permita capturar realmente estos procesos moleculares en sistemas vivos e intactos, es decir, en su entorno nativo en tiempo real, y eso es exactamente lo que hacen las imágenes PET. Aquí le mostraremos cómo usamos un radiotrazador PET específico, DPA-713, que se sabe que se une a la proteína TSPO o translocadora. Le mostraremos específicamente cómo inyectamos una imagen no solo en un ratón, sino también en cuatro ratones al mismo tiempo de forma dinámica, y la razón por la que eso es tan importante es que realmente ayuda a aumentar el número de ratones que puede obtener imágenes en un día determinado con el mismo lote de trazador, lo que realmente agiliza sus experimentos.Si bien esto es técnicamente desafiante, realmente espero que este video pueda ayudarlo a guiarlo para que pueda realizar esto en su propio laboratorio. Comience colocando a los ratones anestesiados boca abajo en la cama del escáner PET/CT, asegurándose de que estén enderezados y seguros en los conos de la nariz. Pega la cabeza y el cuerpo de cada ratón a la cama con cinta quirúrgica suave, asegurándote de que la respiración no se vea restringida por la colocación de la cinta.Una vez que los animales estén seguros en la cama y la respiración sea estable, encienda la mira láser y mueva la cama de escaneo para que se alineen con el cerebro de los cuatro ratones. Mueva la cama del escáner a la posición de adquisición con los cerebros de los ratones lo más cerca posible del centro del campo de visión. Adquiera una imagen de vista de exploración de los ratones para verificar su posición y ajuste la posición arrastrando el cuadro de campo de visión en la interfaz si es necesario.Por último, haga clic en Iniciar flujo de trabajo en el software del escáner para comenzar la tomografía computarizada, asegurándose de seleccionar mostrar indicaciones interactivas al usuario, de modo que la exploración PET se pueda iniciar manualmente antes de la inyección del trazador. Una vez que los ratones avanzan automáticamente de la TC a la PET, configure la parte posterior del escáner para la inyección de la radiosonda. Coloque un acolchado protector y absorbente en una repisa y asegúrese de tener a mano unas tijeras y un encendedor.Corte el tubo sellado del catéter con unas tijeras. Verifique que las líneas de los catéteres estén libres de burbujas y confirme que la cánula aún esté dentro de la vena realizando un lavado con solución salina de 10 a 20 microlitros, luego cargue las jeringas de dosis medidas previamente en cada uno de los cuatro catéteres, realizando un seguimiento de la dosis que se administró a cada ratón. Haga clic en Aceptar cuando la exploración PET esté lista para comenzar mientras se inicia simultáneamente un temporizador de 10 segundos.Coloque a dos investigadores en la parte posterior del escáner con las jeringas de dosis en la mano para inyectar a los cuatro ratones simultáneamente cuando el temporizador llegue a cero. Enjuague cada catéter con 50 a 100 microlitros de solución salina para asegurarse de que la dosis completa ingrese a la vena de la cola y vuelva a sellar el tubo una vez más con un encendedor. A continuación, mida las jeringas de dosis utilizando un calibrador de dosis para obtener un valor de radiactividad residual.Tome nota de los valores y la hora en que se registran. Una vez que se complete el escaneo, regrese la cama de PET a la posición original usando el botón de inicio horizontal dentro del panel de control de movimiento. Retire los ratones del escáner y retire con cuidado el catéter.Aplique presión suavemente en el sitio de la canulación para evitar un sangrado excesivo. A continuación, mida la actividad residual en el catéter con un calibrador de dosis. Por último, reconstruya los datos abriendo el software de gestión de posprocesamiento, que reconstruirá automáticamente cada escaneo utilizando los datos del histograma que se generaron a partir del primer archivo.Para el análisis PET, comience abriendo el software de análisis de imágenes, haciendo clic en el icono Abrir datos para cargar la imagen CT y seleccionando el icono Anexar datos para cargar el PET dinámico. Realice un control de calidad visual de los datos a través del operador de series temporales en el menú desplegable. Seleccione referencia y global, y aplique un mínimo y un máximo adecuados para la escala de colores.Visualice los datos dinámicos de PET fotograma a fotograma, verificando la absorción de radiactividad y comprobando si hay factores de confusión en el movimiento dentro de la exploración. A continuación, cree una imagen PET promedio utilizando la función Aritmética. Elija Promedio seleccionado, anule la selección de Referencia y asegúrese de que Entrada 1, Entrada 2 y Entrada estén seleccionadas para crear un promedio de todos los fotogramas PET.Vaya a la pestaña Administrador de datos y arrastre la imagen promedio hasta la posición de entrada 1 para permitir la visualización de la señal PET utilizando la imagen PET promedio. A continuación, redistribuya la escala de colores haciendo clic en el cálculo automático en la herramienta Mín./Máx. A continuación, registre el CT en el archivo PET promedio utilizando la función 3D automática en el menú desplegable Registro de reorientación.Seleccione Ref y Entrada 1, y elija Rígido, Rápido, Entrada 1 para el registro de Ref. Compruebe visualmente el registro en las tres dimensiones y ajústelo manualmente si es necesario en la pestaña Manual 3D utilizando las funciones Traslación y Rotación. Cuando esté satisfecho con el registro, seleccione Entrada 2 y Entrada y aplicar a todos los marcos PET haciendo clic en la marca de verificación.Haga clic con el botón derecho en los archivos CT y PET en el DM y guárdelos como sin procesar. A continuación, seleccione Recortar en el menú desplegable y arrastre los límites de la imagen para recortar la cabeza de un mouse a la vez debajo del tronco encefálico. Reoriente manualmente las imágenes PET y CT para que el cráneo esté recto en todas las dimensiones.Cargue la imagen de resonancia magnética para ese mouse usando el botón Anexar datos en la parte superior izquierda de la interfaz. Mueva la resonancia magnética utilizando la reorientación 3D manual y ajústela al cráneo dentro de la imagen de tomografía computarizada. A continuación, desactive la visualización de PET anulando su selección dentro de la pestaña Controlador visual y use solo la RM y el CT para dibujar la región de interés o ROI.En la herramienta ROI 3D, haga clic en el botón Agregar ROI para crear un nuevo ROI y asígnele el nombre Infarct. Seleccione la herramienta Spline, haga clic con el botón izquierdo para dibujar el borde del ROI y haga clic con el botón derecho para cerrarlo. A continuación, crea un nuevo ROI y etiquétalo como contralateral.Haga clic con el botón derecho en el ROI de Infartt y seleccione Exportar. A continuación, mueva el ROI a la posición 2, Entrada 1, para permitir la visualización y la reorientación manual del nuevo ROI. Con solo la Entrada 1 seleccionada, marque la casilla ROI y elija Ver solo para permitir la visualización del ROI del infarto sin reorientarlo.Dentro del menú Registro de reorientación, aplique un giro de izquierda a derecha usando la función Operador y mueva manualmente el nuevo ROI a la región idéntica en el lado contralateral. A continuación, seleccione el operador Aritmética y aplique una multiplicación escalar de dos al nuevo ROI, lo que permite la cuantificación independiente de los ROI. Volver a la herramienta ROI 3D.Ve a la pestaña Experto y Experimental, y haz clic en el botón Importar ROI. Seleccione Entrada 1 en el cuadro de diálogo para cargar el nuevo volumen como ROI contralateral. Finalmente, haga clic con el botón derecho en la imagen PET promedio, descárguela y vuelva a encender el PET.Genere los resultados cuantitativos de absorción utilizando el icono Exportar resultados dentro de la herramienta ROI 3D. Las imágenes de PET/TC resultantes y las curvas de actividad temporal muestran una mayor captación de radiotrazador en los hemisferios ipsilaterales frente a los contralaterales. La cuantificación de imágenes cerebrales PET dinámicas utilizando datos sumados de 50 a 60 minutos reveló un aumento significativo en la absorción del trazador en el hemisferio ipsilateral en comparación con el hemisferio contralateral en dMCAO, pero no en ratones simulados utilizando el enfoque ROI dibujado manualmente.Después de ver esta técnica, debe tener una buena comprensión de cómo cuantificar de manera precisa y eficiente la neuroinflamación en un modelo de ratón de accidente cerebrovascular isquémico mediante TSPO-PET, utilizando métodos de análisis de imágenes automáticos y manuales. Es importante destacar que también debería poder confirmar estos hallazgos in vivo mediante autorradiografía digital ex vivo. Dado que la vida media del carbono 11 es tan corta, es fundamental trazar un plan experimental claro y un cronograma antes de intentar este procedimiento para maximizar la cantidad y la calidad de sus datos.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la inmunohistoquímica, para responder a preguntas adicionales, como la correlación entre la activación glial y la expresión de TSPO. Tenga en cuenta que el uso de la radiactividad puede ser extremadamente peligroso. Para minimizar su exposición, utilice ropa protectora, protectores de plomo y aumente su distancia al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Fuente: Chaney, A. M., et.al.  Imagen PET de la neuroinflamación usando [11C]DPA-713 en un modelo de ratón de accidente cerebrovascular isquémico. J. Vis. Exp. (2018).  Este video muestra una técnica para obtener imágenes in vivo de la neuroinflamación en un modelo de ratón de accidente cerebrovascular isquémico utilizando un radiotrazador específico de TSPO. Después de la inyección, el radiotrazador se une a TSPO, una proteína ubicada en la membrana mitocondrial externa y sobreexpresada en las...

Imágenes TSPO-PET/CT para detectar la formación de infarto en un modelo murino de accidente cerebrovascular isquémico

Fuente: Ouyang, Y., et al. Imágenes simultáneas de PET/MRI durante la hipoxia-isquemia cerebral en ratones. J. Vis. Exp. (2015)Este video muestra una técnica para evaluar la lesión por hipoxia cerebral a través de la tomografía por emisión de positrones (PET) y la resonancia magnética (RM) simultáneas. Un ratón anestesiado se somete a una ligadura de la arteria carótida común (CCA), lo que reduce el flujo sanguíneo a un hemisferio cerebral y lo predispone a lesiones inducidas por hipoxia. La...

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El daño cerebral resultante de la isquemia cerebral puede ser visualizado y estudiado de forma no invasiva en ratas utilizando tomografía preclínica por emisión de positrones junto con la sonda radiactiva inyectable, 18F-fluorodesoxiglucosa. Además, el uso de herramientas de software modernas que incluyen plantillas cerebrales de volumen de interés (VOI) aumenta drásticamente la información cuantitativa obtenida de estos estudios.

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El método presentado aquí utiliza simultánea tomografía por emisión de positrones y la resonancia magnética. En el modelo de hipoxia-isquemia cerebral, cambios dinámicos en el metabolismo de la glucosa y de difusión se producen durante y después de la lesión. El daño en evolución e irreproducible en este modelo requiere la adquisición simultánea si los datos de imágenes multimodales significativas son a adquirir.

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