Animal doméstico proyección de imagen de neuroinflamación usando [11C] DPA-713 en un modelo murino de ictus isquémico

El objetivo general de este experimento es cuantificar con precisión la distribución espacial y el alcance de la neuroinflamación en un modelo murino de accidente cerebrovascular isquémico utilizando imágenes TSPO-PET y RM y validar estos hallazgos in vivo utilizando autorradiografía ex vivo. Estoy muy emocionado de compartir con ustedes esta guía paso a paso sobre cómo usar las imágenes PET para visualizar la neuroinflamación en un sujeto vivo. Aquí estamos usando un modelo de ratón de trazo como ejemplo.

Ahora bien, ¿por qué querrías utilizar esta técnica? Hay un par de razones. La primera es que se cree que la neuroinflamación, que es simplemente la inflamación que ocurre en el sistema nervioso central, está íntimamente asociada y realmente es algo que subyace a muchas, muchas enfermedades cerebrales, incluido el accidente cerebrovascular, pero también la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis múltiple, el Parkinson, y la lista continúa.

Así que es increíblemente importante que tengamos estas técnicas que realmente nos permitan estudiar estos fenómenos biológicos. En segundo lugar, la PET ofrece una serie de ventajas sobre algunas de las técnicas más tradicionales. Por ejemplo, la mayoría de estas técnicas tradicionales se basan en gran medida en el uso de tejido cerebral post-mortem humano y de ratón, y aunque han proporcionado una serie de ideas importantes, estas técnicas son estáticas por naturaleza, lo que significa que solo pueden decirnos información sobre un momento en el tiempo.

Dado que sabemos que tanto el cerebro como el sistema inmunológico son altamente dinámicos, tiene sentido que queramos tener una técnica que nos permita capturar realmente estos procesos moleculares en sistemas vivos e intactos, es decir, en su entorno nativo en tiempo real, y eso es exactamente lo que hacen las imágenes PET. Aquí le mostraremos cómo usamos un radiotrazador PET específico, DPA-713, que se sabe que se une a la proteína TSPO o translocadora. Le mostraremos específicamente cómo inyectamos una imagen no solo en un ratón, sino también en cuatro ratones al mismo tiempo de forma dinámica, y la razón por la que eso es tan importante es que realmente ayuda a aumentar el número de ratones que puede obtener imágenes en un día determinado con el mismo lote de trazador, lo que realmente agiliza sus experimentos.

Si bien esto es técnicamente desafiante, realmente espero que este video pueda ayudarlo a guiarlo para que pueda realizar esto en su propio laboratorio. Comience colocando a los ratones anestesiados boca abajo en la cama del escáner PET/CT, asegurándose de que estén enderezados y seguros en los conos de la nariz. Pega la cabeza y el cuerpo de cada ratón a la cama con cinta quirúrgica suave, asegurándote de que la respiración no se vea restringida por la colocación de la cinta.

Una vez que los animales estén seguros en la cama y la respiración sea estable, encienda la mira láser y mueva la cama de escaneo para que se alineen con el cerebro de los cuatro ratones. Mueva la cama del escáner a la posición de adquisición con los cerebros de los ratones lo más cerca posible del centro del campo de visión. Adquiera una imagen de vista de exploración de los ratones para verificar su posición y ajuste la posición arrastrando el cuadro de campo de visión en la interfaz si es necesario.

Por último, haga clic en Iniciar flujo de trabajo en el software del escáner para comenzar la tomografía computarizada, asegurándose de seleccionar mostrar indicaciones interactivas al usuario, de modo que la exploración PET se pueda iniciar manualmente antes de la inyección del trazador. Una vez que los ratones avanzan automáticamente de la TC a la PET, configure la parte posterior del escáner para la inyección de la radiosonda. Coloque un acolchado protector y absorbente en una repisa y asegúrese de tener a mano unas tijeras y un encendedor.

Corte el tubo sellado del catéter con unas tijeras. Verifique que las líneas de los catéteres estén libres de burbujas y confirme que la cánula aún esté dentro de la vena realizando un lavado con solución salina de 10 a 20 microlitros, luego cargue las jeringas de dosis medidas previamente en cada uno de los cuatro catéteres, realizando un seguimiento de la dosis que se administró a cada ratón. Haga clic en Aceptar cuando la exploración PET esté lista para comenzar mientras se inicia simultáneamente un temporizador de 10 segundos.

Coloque a dos investigadores en la parte posterior del escáner con las jeringas de dosis en la mano para inyectar a los cuatro ratones simultáneamente cuando el temporizador llegue a cero. Enjuague cada catéter con 50 a 100 microlitros de solución salina para asegurarse de que la dosis completa ingrese a la vena de la cola y vuelva a sellar el tubo una vez más con un encendedor. A continuación, mida las jeringas de dosis utilizando un calibrador de dosis para obtener un valor de radiactividad residual.

Tome nota de los valores y la hora en que se registran. Una vez que se complete el escaneo, regrese la cama de PET a la posición original usando el botón de inicio horizontal dentro del panel de control de movimiento. Retire los ratones del escáner y retire con cuidado el catéter.

Aplique presión suavemente en el sitio de la canulación para evitar un sangrado excesivo. A continuación, mida la actividad residual en el catéter con un calibrador de dosis. Por último, reconstruya los datos abriendo el software de gestión de posprocesamiento, que reconstruirá automáticamente cada escaneo utilizando los datos del histograma que se generaron a partir del primer archivo.

Para el análisis PET, comience abriendo el software de análisis de imágenes, haciendo clic en el icono Abrir datos para cargar la imagen CT y seleccionando el icono Anexar datos para cargar el PET dinámico. Realice un control de calidad visual de los datos a través del operador de series temporales en el menú desplegable. Seleccione referencia y global, y aplique un mínimo y un máximo adecuados para la escala de colores.

Visualice los datos dinámicos de PET fotograma a fotograma, verificando la absorción de radiactividad y comprobando si hay factores de confusión en el movimiento dentro de la exploración. A continuación, cree una imagen PET promedio utilizando la función Aritmética. Elija Promedio seleccionado, anule la selección de Referencia y asegúrese de que Entrada 1, Entrada 2 y Entrada estén seleccionadas para crear un promedio de todos los fotogramas PET.

Vaya a la pestaña Administrador de datos y arrastre la imagen promedio hasta la posición de entrada 1 para permitir la visualización de la señal PET utilizando la imagen PET promedio. A continuación, redistribuya la escala de colores haciendo clic en el cálculo automático en la herramienta Mín./Máx. A continuación, registre el CT en el archivo PET promedio utilizando la función 3D automática en el menú desplegable Registro de reorientación.

Seleccione Ref y Entrada 1, y elija Rígido, Rápido, Entrada 1 para el registro de Ref. Compruebe visualmente el registro en las tres dimensiones y ajústelo manualmente si es necesario en la pestaña Manual 3D utilizando las funciones Traslación y Rotación. Cuando esté satisfecho con el registro, seleccione Entrada 2 y Entrada y aplicar a todos los marcos PET haciendo clic en la marca de verificación.

Haga clic con el botón derecho en los archivos CT y PET en el DM y guárdelos como sin procesar. A continuación, seleccione Recortar en el menú desplegable y arrastre los límites de la imagen para recortar la cabeza de un mouse a la vez debajo del tronco encefálico. Reoriente manualmente las imágenes PET y CT para que el cráneo esté recto en todas las dimensiones.

Cargue la imagen de resonancia magnética para ese mouse usando el botón Anexar datos en la parte superior izquierda de la interfaz. Mueva la resonancia magnética utilizando la reorientación 3D manual y ajústela al cráneo dentro de la imagen de tomografía computarizada. A continuación, desactive la visualización de PET anulando su selección dentro de la pestaña Controlador visual y use solo la RM y el CT para dibujar la región de interés o ROI.

En la herramienta ROI 3D, haga clic en el botón Agregar ROI para crear un nuevo ROI y asígnele el nombre Infarct. Seleccione la herramienta Spline, haga clic con el botón izquierdo para dibujar el borde del ROI y haga clic con el botón derecho para cerrarlo. A continuación, crea un nuevo ROI y etiquétalo como contralateral.

Haga clic con el botón derecho en el ROI de Infartt y seleccione Exportar. A continuación, mueva el ROI a la posición 2, Entrada 1, para permitir la visualización y la reorientación manual del nuevo ROI. Con solo la Entrada 1 seleccionada, marque la casilla ROI y elija Ver solo para permitir la visualización del ROI del infarto sin reorientarlo.

Dentro del menú Registro de reorientación, aplique un giro de izquierda a derecha usando la función Operador y mueva manualmente el nuevo ROI a la región idéntica en el lado contralateral. A continuación, seleccione el operador Aritmética y aplique una multiplicación escalar de dos al nuevo ROI, lo que permite la cuantificación independiente de los ROI. Volver a la herramienta ROI 3D.

Ve a la pestaña Experto y Experimental, y haz clic en el botón Importar ROI. Seleccione Entrada 1 en el cuadro de diálogo para cargar el nuevo volumen como ROI contralateral. Finalmente, haga clic con el botón derecho en la imagen PET promedio, descárguela y vuelva a encender el PET.

Genere los resultados cuantitativos de absorción utilizando el icono Exportar resultados dentro de la herramienta ROI 3D. Las imágenes de PET/TC resultantes y las curvas de actividad temporal muestran una mayor captación de radiotrazador en los hemisferios ipsilaterales frente a los contralaterales. La cuantificación de imágenes cerebrales PET dinámicas utilizando datos sumados de 50 a 60 minutos reveló un aumento significativo en la absorción del trazador en el hemisferio ipsilateral en comparación con el hemisferio contralateral en dMCAO, pero no en ratones simulados utilizando el enfoque ROI dibujado manualmente.

Después de ver esta técnica, debe tener una buena comprensión de cómo cuantificar de manera precisa y eficiente la neuroinflamación en un modelo de ratón de accidente cerebrovascular isquémico mediante TSPO-PET, utilizando métodos de análisis de imágenes automáticos y manuales. Es importante destacar que también debería poder confirmar estos hallazgos in vivo mediante autorradiografía digital ex vivo. Dado que la vida media del carbono 11 es tan corta, es fundamental trazar un plan experimental claro y un cronograma antes de intentar este procedimiento para maximizar la cantidad y la calidad de sus datos.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la inmunohistoquímica, para responder a preguntas adicionales, como la correlación entre la activación glial y la expresión de TSPO. Tenga en cuenta que el uso de la radiactividad puede ser extremadamente peligroso. Para minimizar su exposición, utilice ropa protectora, protectores de plomo y aumente su distancia al realizar este procedimiento.