Name: Promotor captura Hola-C: Perfiles de alta resolución, genoma de interacciones promotor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprende a implementar Promoter Capture Hi-C para identificar interacciones cromosómicas de largo alcance entre promotores y elementos reguladores. Este método permite vincular variantes no codificantes asociadas a enfermedades con sus genes diana.

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Agradecemos Valeriya Malysheva lectura crítica del manuscrito y ayuda de un experto con la figura 1. Este trabajo fue apoyado por el Consejo de investigación médica, Reino Unido (Señor/L007150/1) y el Reino Unido biotecnología y Consejo de investigación de ciencias biológicas, Reino Unido (BB/J004480/1).

Autores no tienen nada que revelar.

Diseño modular del promotor capturar Hi-C
Promotor de captura Hi-C está diseñado para específicamente enriquecer bibliotecas Hi-C para interacciones con promotores. Estas interacciones constituyen sólo un subconjunto de productos de ligadura en una biblioteca de C Hi.
Captura de Hi-C puede modificarse fácilmente para enriquecer bibliotecas Hi-C para cualquier región genómica o regiones de interés por cambiar el sistema de captura. Captura de regiones pueden ser continua de segmentos genomic44,45,46,48, potenciadores que se han identificado en PCHi-C (' inversa capturar Hi-C'35), o DNasa y sitios hipersensibles49 . El tamaño del sistema de captura puede ajustarse dependiendo del ámbito experimental. Por ejemplo, Dryden et al. blanco 519 fragmentos de cebo en tres desiertos de genes asociados con cáncer de mama44. El sistema de captura por Martin et al. objetivos de ambos segmentos genomic continuo ('Captura de región': 211 regiones genómicas en total; 2.131 fragmentos de restricción) y promotores (3.857 promotores de genes)45.
SureSelect bibliotecas están disponibles en diferentes tamaños: 1 kb a 499 kb (5.190-4.806), 500 kb a 2,9 Mb (5.190-4.816) y 3 Mb a Mb 5,9 (5.190-4.831). Como cada captura individual biotina-RNA 120 nucleótidos de largo, estos capturan sistemas de acomodar a un máximo de 4.158, 24.166 y 49.166 individual captura las puntas de prueba, respectivamente. Esto corresponde a 2.079, 12.083 y fragmentos de restricción específicas 24.583, respectivamente (nota que los números de fragmentos de restricción son límites inferiores basadas en el supuesto que dos sondas de captura individual pueden ser diseñadas para cada restricción fragmento — en realidad debido a secuencias repetitivas esto no será el caso para cada restricción del fragmento (véase también figura 1B, C), resultando en un mayor número de fragmentos de restricción targetable para un número constante de sondas de captura disponible ).
El protocolo aquí descrito se basa en el uso de una enzima de restricción con un sitio de reconocimiento de bp 6 para descubrir las interacciones de largo alcance. Usando una enzima de restricción con un sitio de reconocimiento de bp 4 para una mayor resolución de interacciones más proximales es también posible40,49.
Limitaciones de PCHi-C
Una limitación inherente de todo cromosoma conformación captura de ensayos es que su resolución está determinada por la enzima de restricción utilizada para la generación de la biblioteca. Las interacciones que se producen entre elementos de ADN situados en el mismo fragmento de restricción son invisibles para los ensayos de 'Tipo C'. Además, en PCHi-C, en algunos casos más de un sitio de inicio de transcripción puede encontrarse en el mismo fragmento de restricción que contiene el promotor y PIRs en algunos casos albergan ambas marcas histona activo y represivo, lo que es difícil de identificar que regulador elementos median las interacciones y para predecir la salida regulador de las interacciones del promotor. Usando enzimas de restricción con 4 sitios de reconocimiento de bp atenúa este problema pero viene a expensas de mucho mayor complejidad de biblioteca Hi-C (Hi-C bibliotecas generadas con enzimas de restricción de sitio de reconocimiento 4 de bp son al menos 100 veces más complejas que Hi-C bibliotecas generadas con enzimas de restricción de sitio de reconocimiento 6 de bp) y los costos asociados para la siguiente secuencia de generación.
Otra limitación es que el actual protocolo de PCHi-C requiere de millones de células como material, que el análisis de las interacciones de promotor en tipos raros de la célula de partida. Una versión modificada de PCHi-C para permitir que el interrogatorio de los contactos de promotor en poblaciones celulares con 10.000 a 100.000 células (por ejemplo durante el desarrollo embrionario o células madre hematopoyéticas) por lo tanto sería una adición valiosa a la captura Hola C caja de herramientas.
Por último, como todos los métodos que se basan en la fijación de formaldehído, PCHi-C sólo registra las interacciones que se 'congelan' en el momento de la fijación. Por lo tanto, para estudiar la cinética y dinámica de las interacciones del promotor, se requieren métodos como la microscopía de superresolución vivo de la célula junto con PCHi-C.
Métodos para disecar la organización espacial del cromosoma en alta resolución
La gran complejidad de las bibliotecas cromosómicas interacción prohíbe la identificación confiable de los productos de la interacción entre dos fragmentos de restricción específica con significación estadística. Para evitar este problema, captura de secuencia se ha utilizado para enriquecer Hi-C33,34,40,44 o50,de 3 C51 bibliotecas de interacciones específicas. La ventaja principal de usar bibliotecas de bibliotecas sobre 3C Hi-C para el paso de enriquecimiento es que Hi-C, a diferencia de C 3, incluye un paso de enriquecimiento de productos genuinos de la ligadura. Como consecuencia, el porcentaje de lecturas válidas en bibliotecas PCHi-C es aproximadamente 10 veces mayor que en captura-C Lee bibliotecas50, que contenía alrededor de 5 – 8% válido después de filtrar HiCUP. Sahlen et al han comparado directamente captura-C a HiCap, que como PCHi-C utiliza bibliotecas Hi-C para el enriquecimiento de la captura, en contraste con C de captura que utiliza bibliotecas C 3. De acuerdo con nuestros resultados, encontraron que las bibliotecas de captura de C se componen principalmente de fragmentos ligados no40. Además, las bibliotecas HiCap tenían una complejidad mayor de las bibliotecas de captura de C40.
Una variante de captura-C, llamado generación captura C52 NG captura-C utiliza un oligo por final de fragmento de restricción, como previamente establecidas en el PCHi-C33,34, en lugar de la superposición de las sondas utilizadas en el original Protocolo de captura de C50. Esto aumenta el porcentaje de lecturas válidas en comparación con C captura modestamente, pero NG captura-C emplea dos ciclos secuenciales de captura de enriquecimiento, y un número relativamente elevado de PCR ciclos (ciclos de 20 a 24 en total, en comparación con 11 ciclos típicamente PCHi-c), que inevitablemente resulta en un número de secuencia duplicados y menor complejidad de la biblioteca. En experimentos de prueba durante la optimización de PCHi-C, encontramos que el porcentaje de único (es decir, no duplicados) lee pares era solamente alrededor 15% cuando se utilizaron 19 ciclos PCR (13 ciclos de pre-capturan + 6 ciclos post capturan; datos no mostrados), sin embargo optimización a un menor número de ciclos de PCR, típicamente rinde 75 – 90% únicos pares de leer. Por lo tanto, reduce sustancialmente el número de ciclos PCR aumenta la cantidad de datos de la secuencia informativa.
Un método reciente combina ChIP con Hi-C para centrarse en las interacciones cromosómicas mediadas por una proteína específica de interés (HiChIP53). Comparado con el animal doméstico de ChIA54, que se basa en una lógica similar, HiChIP datos contienen un mayor número de lecturas de secuencia informativa, permitiendo mayor confianza interacción llamando a53. Sería muy interesante comparar directamente la correspondiente HiChIP y conjuntos de datos de captura Hi-C una vez que estén disponibles (por ejemplo HiChIP usando un anticuerpo contra la cohesina unidad Smc1a53 con captura de Hi-C para todos Smc1a obligado restricción fragmentos) lado a lado. Una diferencia inherente entre estos dos enfoques es que captura Hi-C no depende de inmunoprecipitación de cromatina y por lo tanto es capaz de interrogar a interacciones cromosómicas independientemente de la ocupación de la proteína. Esto permite la comparación de la organización del genoma 3D en la presencia o ausencia de atascamiento del factor específico, como se ha utilizado para identificar PRC1 como un regulador clave del ratón ESC genoma espacial arquitectura7.
PCHi-C y GWAS
Estudios de Asociación de genoma completo (GWAS) han revelado que más del 95% de enfermedad asociada a variantes de la secuencia se encuentran en regiones no codificantes del genoma, a menudo a grandes distancias para genes de codificación de la proteína55. Suelen ser variantes GWAS encontró en proximidad cercana a DNasa I sitios hipersensibles, que es una seña de identidad de secuencias con potencial actividad reguladora. PCHi-C y capturar Hi-C se han utilizado extensivamente para vincular promotores a loci de riesgo GWAS implicados en cáncer de mama44, cáncer colorrectal48y enfermedad autoinmune35,45,46. Un PCHi-C estudio de 17 células hematopoyéticas humano diferentes tipos encontrar SNPs asociados con enfermedad autoinmune se enriquecieron en el PIRs en células linfoides, mientras que variantes de la secuencia asociadas a rasgos específicos de plaquetas y glóbulos rojos se encontraron predominantemente en los macrófagos y eritroblastos, respectivamente35,56. Así, promotor específico tipo de tejido interactomes por PCHi-C puede ayudar a entender la función de no codificación asociada a enfermedad de variantes de secuencia e identificar nuevos genes de enfermedades potenciales para la intervención terapéutica.
Características de las regiones de interacción promotor
Varias líneas de evidencia enlace promotor interactomes al control de la expresión de genes. En primer lugar, varios estudios de PCHi-C han demostrado que regiones genómicas interactuando con los promotores de genes expresados (altamente) se enriquecen en marcas asociadas con actividad enhancer, como la acetilación de H3K27 y p300 enlace33,34 , 37. se encontró una correlación positiva entre el nivel de expresión génica y el número de reforzadores interactuantes, lo que sugiere que los efectos aditivos de resultado potenciadores en la expresión génica aumento niveles34,35. En segundo lugar, naturales loci de rasgos cuantitativos (eQTLs) están enriquecidos en PIRs que están conectados a los mismos genes cuya expresión se ve afectada por los eQTLs35de expresión. En tercer lugar, mediante la integración de viaje57 y PCHi-C datos, Cairns et al. encontrado que genes del reportero viaje a PIRs en ratón CES muestran a reportero más fuerte expresión génica de genes del reportero en los sitios de integración en las regiones de interacción de promotor no 58, lo que indica que los PIRs poseen actividad de regulación transcripcional. Juntos, estos resultados sugieren que promotor interactomes descubiertas por PCHi-C en varios tipos de células humanas y ratón incluyen módulos regulatorios claves para el control de la expresión de genes.
Cabe destacar que los Potenciadores representan sólo una pequeña fracción (~ 20%) de los PIRs por PCHi-C33,34. Otros PIRs podrían tener funciones estructurales o topológicas en lugar de funciones de regulación transcripcionales directas. Sin embargo, también hay evidencia que PCHi-C puede descubrir elementos de ADN con función reguladora que no albergan marcas clásica potenciador. En una línea de células linfoides humanas, el promotor BRD7 fue encontrado para interactuar con una región desprovista de marcas potenciador que fue demostrada para poseer actividad potenciador en reportero gene ensayos33. Elementos reguladores de similares características pueden ser más abundantes que actualmente apreciado. Por ejemplo, una pantalla basada en CRISPR para regulación ADN elementos identificados sin marcar elementos reguladores (UREs) que controlan la expresión génica pero están desprovistos de reforzador marca59.
En otros casos, han demostrado PIRs puerto marcas cromatina asociadas con la represión transcripcional. PIRs y promotores interactúan por PRC1 en ratón CES participaron en una extensa red espacial de genes reprimidos teniendo que el represivo Marcos H3K27me37. En células linfoblastoides humanas, un elemento distante interactuando con el promotor de BCL6 reprimido transgen reportero gene expresión33, sugiriendo que puede funcionar para reprimir la transcripción de BCL6 en su contexto nativo.
PIRs enriquecidas para la ocupación de la proteína del aislador de cromatina CTCF en CES y CNE humano37 puede representar otra clase de PIRs. Colectivamente, estos resultados sugieren que PIRs albergan una colección de actividades reglamentarias gene a caracterizarse funcionalmente.

La acumulación de pruebas sugiere que la organización tridimensional del genoma juega un papel funcional importante en una variedad de procesos nucleares, incluyendo gene activación1,2,3, represión4 ,5,6,7,8, recombinación9,10, DNA repair11, DNA replication12,13, y senescencia celular14. Potenciadores del distantes se encuentran en estrecha proximidad espacial a los promotores regulan15,16,17, que es esencial para el control de la expresión de gene spatio-temporal adecuada. Eliminaciones de reforzador muestran que potenciadores distales son esenciales para el objetivo gene transcripción18,19,20,21,22y 'forzado cromatina bucles' demuestra que es suficiente para impulsar la activación transcripcional23ingeniería tethering entre un intensificador y su promotor de destino en el lugar geométrico de la Hbb . Además, los cambios del genoma que llevan genes bajo el control de reforzadores ectópicos pueden resultar en activación de gen inadecuado y enfermedad24,25,26. Juntos, estos ejemplos ilustran que las interacciones promotor enhancer son esenciales para el control del gen y requieren regulación apretada para expresión génica adecuada. El ser humano y los genomas del ratón cada uno se estima que alrededor 1 millón potenciadores del puerto. Para la gran mayoría de estos potenciadores, genes de la blanco son desconocidos, y las reglas de enfrentamiento entre promotores y potenciadores son poco conocidas. Asignar sus genes diana transcripcionales enhancers así sigue siendo un desafío importante en descifrar el control de la expresión de genes mamíferos.
Nuestra comprensión de la arquitectura tridimensional del genoma ha sido revolucionado por la introducción de 3C27 (captura de la conformación de cromosoma) y sus variantes28,29,30,31 . La más poderosa de estas técnicas, Hi-C (captura de conformación de cromosoma de alto rendimiento) está diseñada para identificar todo el conjunto de interacciones cromosómicas dentro de una población celular. Hola C bibliotecas, normalmente generadas por millones de células, son altamente complejas con un estimado 1011 productos de ligadura independientes entre fragmentos de ~ 4 kb en el genoma humano32. Como una consecuencia, identificación confiable y reproducible de las interacciones entre la restricción individual fragmentos (como los que contienen un promotor o potenciador) de datos Hi-C no están factibles a menos que Hi-C bibliotecas son objeto de secuenciación profunda ultra, que no es una solución económicamente viable para preparar bibliotecas Hi-C rutinariamente los laboratorios. Para evitar esta carencia, hemos desarrollado promotor capturar Hi-C específicamente enriquecer productos de ligadura que contienen el promotor de Hi-C bibliotecas. Nos enfocamos en promotores por dos razones. En primer lugar, contactos promotor enhancer han demostrado ser cruciales para los niveles de expresión génica adecuada en numerosos estudios (ver referencias anteriores), y en segundo lugar, como promotores en gran medida invariantes entre tipos celulares, el mismo sistema de captura de cebo puede utilizarse para interrogar el circuito regulador en múltiples tipos celulares y condiciones. Nuestro enfoque se basa en la solución en hibridación de bibliotecas Hi-C con decenas de miles de 120mers biotinilado RNA complementario a los productos que contienen el promotor Hi-C ligadura y posterior captura de bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina. Esto se traduce en bibliotecas PCHi-C con mucho menor complejidad en comparación con la original biblioteca de HI-c, centrándose sólo en la identificación de los fragmentos que se unen a los promotores a significativamente altas frecuencias.
Hemos utilizado PCHi-C en un número de humanos y tipos de células de ratón para contribuir a una mejor comprensión del control de expresión del gene por descubrir regiones interacción promotor distal largo alcance con supuesta función reguladora, así como no-al azar contactos de promotor-promotora en el espacio tridimensional del núcleo. Los estudios han asignado cientos de miles de contactos promotor potenciador a través de numerosas células tipos33,34,35,36,37,38, 39, identificado organización mediado Polycomb represivo complejo espacial genoma en células madre embrionarias de ratón7, demostró gran cableado de interactomes promotor durante la diferenciación celular37, 38 , 39y vinculado no codificante asociada a enfermedad de la secuencia de variantes de genes promotores35.
PCHi-C es un método ideal para mapear el genoma conjunto de secuencias de ADN interaccionando con los promotores. Enfoques relacionados, tales como captura de HI-c de regiones genómicas continuadas (ver discusión) son el método de elección para obtener perfiles de interacción de alta resolución para las regiones genómicas. PCHi-C y capturar Hi-C son muy similares desde el punto de vista experimental (la única diferencia es la elección del sistema de captura), para que los consejos y directrices que le ofrecemos son aplicables a ambos enfoques. Aquí, presentamos una descripción detallada de PCHi-C. Esquema de la lógica y el diseño de un experimento de PCHi-C, proporcionar un protocolo de generación de biblioteca PCHi-C paso a paso e ilustran cómo se puede supervisar la calidad de bibliotecas PCHi-C en varios pasos en el protocolo para producir datos de alta calidad.

<table><tbody><tr><td>Solución de paraformaldehído al 16% (vol/vol)</td><td>Agar Scientific</td><td>R1026</td><td></td></tr><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) 1x</td><td>Life Technologies</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS) estéril filtrado</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de filtro de baja retención&nbsp;</td><td>Starlab</td><td>S1180-3810, S1180-1810, S1180-8810 y S1182-1830</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>70011-036</td><td></td></tr><tr><td>Agua de grado de biología molecular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>i8896</td><td></td></tr><tr><td>5 m NaCl&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>24740-011</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de la proteasa (sin EDTA)&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de restricción 2 (10x NEBuffer 2)</td>Tubo LoBind de ADN <td>B7002</td><td></td>de <td>New England Biolabs</td></tr><tr><td>, 1,5 mL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.051</td><td></td></tr><tr><td>Tubo LoBind de ADN, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td></td></tr><tr><td>20% (peso/vol) SDS&nbsp; &nbsp;</td><td>Laboratorios Bio-Rad</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>20% (vol/vol) Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>HindIII, 100 u/uL</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dCTP&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18253-013</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dGTP</td><td>Life Technologies</td><td>18254-011</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dTTP&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18255-018</td><td></td></tr><tr><td>0,4 mM Biotina-14-dATP</td><td>Life Technologies</td><td>19524-016</td><td></td></tr><tr><td>ADN polimerasa I fragmento grande (Klenow) 5000 unidades/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 T4 tampón de reacción de ligasa&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202</td><td></td></tr><tr><td>100x 10mg/ml Albúmina sérica bovina &nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa, 1 U/&mu; L&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15224-025</td><td></td></tr><tr><td>RNasa A&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K, recombinante, grado PCR&nbsp;</td><td>Roche</td><td>3115836001</td><td></td></tr><tr><td>20 000 veces; g tubo de centrífuga de 50 ml</td><td>VWR</td><td>525-0156</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8,0&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Fenol pH 8.0&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: Cloroformo: Alcohol isoamílico 25:24:1&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio pH 5.2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de extracción de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit de purificación</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de restricción 2.1 (10x NEBuffer 2.1)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7202</td><td></td></tr><tr><td>NheI, 100U/uL</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131</td><td></td></tr><tr><td>Micro TUBE AFA Fiber Tapón a presión precortado 6x16mm viales& nbsp;</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>Para perlas SPRI de sonicación</td></tr><tr><td>(Agencourt AMPure XP)&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1 perlas&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dATP&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18252-015</td><td></td></tr><tr><td>ADN polimerasa T4 3000 unidades/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK 10000 unidades/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>Klenow exo menos 5000 unidades/mL&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de reacción de ligadura rápida&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B6058</td><td></td></tr><tr><td>NEB DNA Quick ligasa&nbsp;</td>Adaptador de PE <td>M2200</td><td></td>de <td>New England Biolabs</td></tr><tr><td>1.0 (5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGC AGGAATGCCGAG-3')</td>Adaptador de PE de <td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.0 (5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3')Kit de</td> PCR Phusion <td>NEB de Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>PE PCR primer 1.0 (5'-AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT-3')</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE PCR primer 2.0 (5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GATCGGTCTCGGCATTCCT GCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3')&nbsp;</td><td>Tiras de PCR Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>410022 y 401425 kit de</td><td></td></tr><tr><td>adaptador completo SureSelect SSEL TE Reagent ILM PE&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>931108</td><td></td></tr><tr><td>biblioteca personalizada SureSelect de 3-5,9 Mb&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-4831</td><td>diseño personalizado ratón o sistema PCHi-C humano</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>E220&nbsp; ultrasonido focalizado de alto rendimiento</td><td>Corvaris</td><td>E220</td><td></td></tr></tbody></table>

promotor captura hola-c: perfiles de alta resolución, genoma de interacciones promotor

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

La organización tridimensional del genoma está ligada a su función. Por ejemplo, elementos reguladores como potenciadores transcripcionales controlan de la expresión espacio-temporal de sus genes diana a través del contacto físico, a menudo salvar distancias genómica considerable (en algunos casos cientos de kilobases) y pasando por alto genes cercanos. El genoma humano alberga un estimado potenciadores 1 millón, la mayoría de los cuales tiene desconocido objetivos gen. Así es crucial para entender el control de la expresión de gene asignar distales regiones reguladoras de sus genes diana. Hemos desarrollado promotor capturar Hi-C (PCHi-C) para permitir la detección de genoma de regiones de interacción promotor distales (PIR), para todos los promotores en un solo experimento. PCHi-c, altamente complejo Hi-C bibliotecas son enriquecidas específicamente para secuencias de promotor a través de la selección de híbridos en solución con miles de cebos biotinilado RNA complementarios a los extremos de los fragmentos de restricción que contiene el promotor. El objetivo es secuencias de promotor entonces hacia abajo y sus compañeros de interacción frecuente como potenciadores y otros posibles elementos reguladores. Después de la secuenciación de alto rendimiento extremo apareado, se aplica una prueba estadística a cada fragmento de restricción ligada promotor identificar PIRs significativas a nivel de fragmento de restricción. Hemos utilizado PCHi-C para generar un atlas de interacciones de largo alcance promotor en decenas de humanos y tipos de células de ratón. Estos mapas del interactoma promotor han contribuido a una mayor comprensión del control de la expresión de genes mamíferos asignando regiones reguladoras supuestas a sus genes diana y revela redes de interacción espacial preferencial promotor-promotora. Esta información también tiene gran importancia para entender la enfermedad genética humana y la identificación de genes de enfermedades potenciales, vinculando no codificante asociada a enfermedad secuencia variantes en o cerca de secuencias de control a sus genes diana.

Promotor de captura Hi-C se ha utilizado para enriquecer ratón7,34,36,39 y humano33,35,37,38 Hi-C bibliotecas para interacciones del promotor. Un protocolo similar (llamado HiCap) ha sido descrito por el grupo de Sandberg40. Figura 1A muestra el mismo flujo de trabajo para promotor de captura Hi-C. En el protocolo descrito aquí, Hi-C bibliotecas se generan utilizando ligadura en núcleo41, que se traduce en un número significativamente reducido de ligadura falsos productos42. PCHi-c, ratón muy complejo o humana Hi-C bibliotecas son objeto de solución en hibridación y capturan usando 39.021 ARN biotinilado complementario a 22.225 fragmentos de la restricción de Hinel dIII que contienen el promotor del ratón, o ARN biotinilado 37.608 dirige a 22.076 humanos que contienen el promotor HindIII fragmentos de restricción, respectivamente. Promotor que contiene fragmentos de restricción puede ser objetivo en uno o ambos extremos de individual biotinilado RNAs (figura 1B). Encontramos que captura de los dos termina mejor cobertura de promotores individuales (figura 1; Lee secuencia cruda) casi doble, como se esperaba. Por lo tanto, siempre que sea posible (es decir, en regiones no repetitivas), aconsejamos utilizar ARN biotinilado complementario a ambos extremos de un fragmento de la restricción para ser capturados.
Evaluar la calidad de biblioteca PCHi-C en una etapa temprana durante la preparación de la biblioteca, realizamos dos controles después de ligadura de ADN y purificación, como se describió anteriormente31. La primera es utilizar pares de imprimación específica para amplificar productos ligadura como 3 C27. Utilizamos pares de cartilla (tabla 1) para amplificar productos invariante ligadura de largo alcance de tipo de la célula, tales como entre el gene de Myc y sus conocidos potenciadores situado aproximadamente 2 Mb de distancia (figura 2A) o entre los genes de la (lugar geométrico) Hist1 separados por 1,5 Mb) y entre dos regiones ubicadas en las proximidades de lineal ('control' de corto alcance).
El segundo control de calidad se lleva a cabo para determinar la eficacia de la incorporación de biotina durante el relleno de Klenow-mediada de restricción sitio voladizos con biotina-dATP. Relleno de Klenow éxito y posterior ligadura de Roma-final resultados en la desaparición del sitio original de restricción entre las moléculas de ADN de un producto de la ligadura y en el caso de HindIII en la formación de un nuevo sitio de reconocimiento de NheI (figura 2B ). La proporción de HindIII al producto digerido ligadura de NheI es una lectura directa de la eficacia de incorporación de biotina. Una biblioteca de Hi-C mala calidad mostrará un alto nivel de HindIII digestión, mientras que las bibliotecas de alta calidad tienen digestión de NheI casi completa de los productos de ligadura (figura 2B).
Después de la preparación de biblioteca Hi-C (es decir, después de biotina-estreptavidina tire hacia abajo de tamaño seleccionado Hi-C ligadura productos, ligadura de adaptador y pre-captura de PCR), la distribución de la biblioteca de C de alta integridad y tamaño es evaluada por equipo Bioanalyzer (figura 2 C). el mismo control se realiza al final de la preparación de biblioteca PCHi-C (es decir, después de la captura de la hibridación de productos que contienen el promotor de la ligadura y post-captura de PCR). Comparación de los perfiles de HI-c y equipo Bioanalyzer PCHi-C muestra que como se esperaba, Hi-C bibliotecas son mucho más concentradas que las correspondientes bibliotecas de PCHi-C, pero la distribución de tamaño de las bibliotecas es muy similar, indicando que la captura en PCHi-C no introduce un sesgo de tamaño (figura 2, D).
Después de la secuencia final emparejado, se asigna el PCHi-C Lee, calidad controlada y había filtrada utilizando la tubería HiCUP del43. Bibliotecas de PCHi-C de alta calidad contienen entre 70-90% 'pares válidos' (es decir, la secuencia de final emparejado lee entre dos fragmentos de restricción que no son vecinos en el mapa genómico lineal; Figura 3A, B). La ligadura en núcleo protocolo41,42, el porcentaje de trans Lea pares (es decir, la secuencia de final emparejado lee entre dos fragmentos de restricción que se encuentran en diferentes cromosomas) son generalmente bajos, entre 5 y 25%, lo que refleja la existencia de territorios del cromosoma e indicando la calidad de la buena biblioteca. Comparación directa del porcentaje de pares de válido entre bibliotecas Hi-C y sus correspondientes de las bibliotecas de PCHi-C35, muestra que en todos los casos el porcentaje de pares válidos es mayor en las bibliotecas de PCHi-C (figura 3B). Esto se acompaña de una reducción en el porcentaje de lecturas no válidas 'mismo fragmento interno' en PCHi-C (figura 3). Se espera, como el paso de la captura no sólo enriquece para productos que contienen el promotor de la ligadura, sino también para los extremos del fragmento de restricción, debido a la posición de los oligos de captura en la restricción de los fragmentos (ver figura 1B).
Después HiCUP filtrado, determinamos la eficiencia de captura. PCHi-C bibliotecas contienen tres tipos de lecturas de secuencia válido después de filtrar HiCUP: 1.) promotor: genoma Lee (es decir, lecturas entre un fragmento promotor capturados y un fragmento de restricción HindIII no promotor en cualquier lugar del genoma) 2.) promotor: promotor Lee (lee entre dos fragmentos del promotor capturado) 3.) genoma: genoma Lee (productos de fondo Hi-C ligadura donde ninguno de los socios producto de la ligadura se asigna a un promotor capturado). Estos son desechados antes de análisis de aguas abajo.
Bibliotecas de PCHi-C de alta calidad tienen eficiencias de captura (suma de las categorías 1 y 2) entre 65-90% (figura 3D). Una comparación directa a bibliotecas Hi-C muestra que PCHi-C resulta en un ~ 15 dobleces enriquecimiento para promotor-productos que contienen la ligadura (figura 3D), en algunos casos 17-fold. Esto está cerca del máximo hipotético (19.6-fold) enriquecimiento PCHi-c, que es dependiente en el porcentaje de los fragmentos de restricción del genoma cubiertos por el sistema de captura. Mayor enriquecimiento puede lograrse mediante el diseño de sistemas de captura a menos restricción fragmentos44,45,46.
Análisis de interactomes promotor demuestra células tipo y linaje-especificidad33,34,35, con cambios pronunciados durante la diferenciación celular37,38,39 . Figuras 4 y 5 muestran ejemplos de dinámicas de especificidad y diferenciación de linaje en promotores específicos. Por ejemplo, ALAD se expresa constitutivamente en todas las células pero su expresión es upregulated en eritroblastos47. El promotor de la ALAD en contacto varios fragmentos distales en todas las células hematopoyéticas y se involucra en interacciones adicionales específicamente en eritroblastos (figura 4). IL-8 no muestra interacciones estadísticamente significativas en las células de B, muy pocas interacciones en las células de T, pero decenas de interacciones en las células del linaje mieloide, incluyendo interacciones específicas del tipo de células (neutrófilos, monocitos y megacariocitos Figura 5). Estos ejemplos demuestran cómo se puede utilizar PCHi-C desentrañar interactomes específicos del tipo de la célula e identificar regiones promotor interactuando con potencial regulatorio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig1.jpg"> Figura 1 : Promotor capturar Hi-C justificación y captura cebo diseño. Flujo de trabajo esquemático (A) PCHi-c. Ligadura en núcleo Hi-C41,42 (I) es seguida por solución en hibridación con cebos biotinilado RNA (II) dirigidas a los fragmentos de restricción de todo humano (representado aquí) o ratón de promotores de genes (III). (B) diseño de cebo para PCHi-C. Cebos de la captura de ARN biotinilado (líneas curvas rojas) están diseñados contra los extremos de los fragmentos de restricción que contiene el promotor (gris, nota que las secuencias de promotor se (rojo) sólo son blanco de los cebos de captura RNA si están situados en la restricción extremos del fragmento). Productos de ligadura de promotor que contiene fragmentos de restricción (gris) y sus interacción fragmentos de restricción (amarillo y verde) son aislados mediante hibridación de secuencia-complementariedad entre cebo de RNA y DNA Diana y posterior biotina-estreptavidina desplegable, como se muestra en (C) comparación de PCHi-A.c. eficiencia de captura de fragmentos de restricción que contiene el promotor dirigido por un RNA cebo captura sonda vs dos sondas de captura de cebo RNA (ver diagrama b). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig2.jpg"> Figura 2 : Controles de calidad de la secuencias de PCHi-C. (A) a la izquierda, esquema de yuxtaposición espacial entre promotor y PIR, resultando en un producto de la ligadura de Hi-C que consiste en un fragmento de restricción que contiene el promotor (gris, secuencia de promotor en rojo) y un fragmento de la restricción de PIR (amarillo). Derecha, ADN gel electroforesis mostrando ejemplos de ligadura Hi-C los productos amplificados con pares de primer específico (como se muestra en el esquema de la izquierda). (B) a la izquierda, digiere los ejemplos representativos de restricción HindIII, NheI y NheI/HindIII de Hi-C ligadura (productos PCR se muestra en la A). A la derecha, esquema de ADN secuencia después de la ligadura de la Hi-C después de fracasado (arriba) o relleno de Klenow de dNTP exitosa (parte inferior) de las ensambladuras de la restricción y la ligadura subsecuente. (C) representante Hi-C biblioteca bioanalyzer el perfil (dilución al 1/5). (D) representante PCHi-C biblioteca bioanalyzer el perfil (sin dilución). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig3.jpg"> Figura 3 : Controles de calidad de la secuencias de PCHi-C. (A) comparación de la secuencia válida porcentaje Lee pares después HiCUP43 en PCHi-C vs correspondientes bibliotecas Hi-C (datos de Javierre et al., 201635). (B) representante HiCUP PCHi-C resultado mostrando válido Lee pares y otras categorías de secuencia que son desechados antes de análisis aguas abajo (datos de Javierre et al., 201635). (C) comparación de porcentaje 'mismo fragmento interno' Lee después HiCUP en PCHi-C vs correspondientes bibliotecas Hi-C (datos de Javierre et al., 201635). (D) comparación de la secuencia de porcentaje Lee con fragmentos del promotor con cebo (eficiencia de captura) en PCHi-C vs correspondientes bibliotecas Hi-C (datos de Javierre et al., 201635). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig4.jpg"> Figura 4: ALAD PCHi-C perfil en células hematopoyéticas humanas. Interacciones promotor de tipos de la célula mieloide se muestran como arcos azules, y las interacciones promotor de tipos de células linfoides se muestran como arcos púrpura. Las interacciones específicas del erythroblast se indican con flechas rojas (datos de Javierre et al., 201635). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig5.jpg"> Figura 5 : IL8 Perfil de PCHi-C en las células hematopoyéticas humanas. Interacciones promotor de tipos de la célula mieloide se muestran como arcos azules, y las interacciones promotor de tipos de células linfoides se muestran como arcos púrpura. Interacciones específicas de monocitos están indicadas por las flechas verdes, interacciones neutrófilos específicos se indican con flechas rojas, y una interacción específica de megacariocitos está indicada por una flecha marrón (datos de Javierre et al., 201635). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="9">Humano</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nombre</td>
			<td colspan="3">Secuencia de</td>
			<td>Cromosoma</td>
			<td>Strand</td>
			<td>Inicio GRCh38/hg38</td>
			<td>Final GRCh38/hg38</td>
			<td>Combinaciones de cartilla para probar las interacciones de 3C y biotina incorporación</td>
		</tr>
<tr>
<td>Capítulo AHF64 Dekker</td>
			<td colspan="3">GCATGCATTAGCCTCTGCTGTTCTCTGAAATC</td>
			<td>11</td>
			<td>+</td>
			<td>116803960</td>
			<td>116803991</td>
			<td>utilizar en combinación con hs AHF66 Dekker</td>
		</tr>
<tr>
<td>Capítulo AHF66 Dekker</td>
			<td colspan="3">CTGTCCAAGTACATTCCTGTTCACAAACCC</td>
			<td>11</td>
			<td>+</td>
			<td>116810219</td>
			<td>116810248</td>
			<td>utilizar en combinación con hs AHF64 Dekker</td>
		</tr>
<tr>
<td>lugar geométrico MYC HS</td>
			<td colspan="3">GGAGAACCGGTAATGGCAAA</td>
			<td>8</td>
			<td>-</td>
			<td>127733814</td>
			<td>127733833</td>
			<td>usar en combinación con hs MYC +1820 o capítulo MYC-538</td>
		</tr>
<tr>
<td>Capítulo MYC +1820</td>
			<td colspan="3">AAAATGCCCATTTCCTTCTCC</td>
			<td>8</td>
			<td>+</td>
			<td>129554527</td>
			<td>129554547</td>
			<td>usar en combinación con el locus MYC de capítulo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Capítulo MYC-538</td>
			<td colspan="3">TGCCTGATGGATAGTGCTTTC</td>
			<td>8</td>
			<td>-</td>
			<td>127195696</td>
			<td>127195716</td>
			<td>usar en combinación con el locus MYC de capítulo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Capítulo HIST1 F</td>
			<td colspan="3">AAGCAGGAAAAGGCATAGCA</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>26207174</td>
			<td>26207193</td>
			<td>utilizar en combinación con hs HIST1 R</td>
		</tr>
<tr>
<td>Capítulo HIST1 R</td>
			<td colspan="3">TCTTGGGTTGTGGGACTTTC</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>27771575</td>
			<td>27771594</td>
			<td>utilizar en combinación con hs HIST1 F</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="9">Ratón</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">Secuencia de</td>
			<td>Cromosoma</td>
			<td>Strand</td>
			<td>Inicio GRCm38/mm10</td>
			<td>Final GRCm38/mm10</td>
			<td>Combinaciones de cartilla para probar las interacciones de 3C y biotina incorporación</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">TCATGAGTTCCCCACATCTTTG</td>
			<td>8</td>
			<td>+</td>
			<td>84841090</td>
			<td>84841111</td>
			<td>usar en combinación con mm Calr2</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">CTGTGGGCACCAGATGTGTAAAT</td>
			<td>8</td>
			<td>+</td>
			<td>84848519</td>
			<td>84848541</td>
			<td>usar en combinación con mm Calr1</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">TATCAAGGGTGCCCGTCACCTTCAGC</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>125163098</td>
			<td>125163123</td>
			<td>usar en combinación con Gapdh4 Dekker</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGGCTTTTATAGCACGGTTATAAAGT</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>125163774</td>
			<td>125163799</td>
			<td>usar en combinación con Gapdh3 Dekker</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGAGGAGGGAAAAGGAGTGATT</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>52212829</td>
			<td>52212850</td>
			<td>usar en combinación con mm Hoxa13</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">CAGGCATTATTTGCTGAGAACG</td>
			<td>6</td>
			<td>-</td>
			<td>52253490</td>
			<td>52253511</td>
			<td>usar en combinación con mm Hoxa7</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGGTAATGGTGTCACTAACTGG</td>
			<td>13</td>
			<td>+</td>
			<td>23571284</td>
			<td>23571305</td>
			<td>usar en combinación con m Hist1h3e o m Hist1h4i</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGGTTTGATGAGTTGGTGAAG</td>
			<td>13</td>
			<td>+</td>
			<td>23566541</td>
			<td>23566561</td>
			<td>usar en combinación con mm Hist1h2ae</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">TTGGGCCAAAGCCTATATGA</td>
			<td>13</td>
			<td>+</td>
			<td>22043085</td>
			<td>22043104</td>
			<td>usar en combinación con mm Hist1h2ae</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Secuencias de Primer control de calidad de humano y ratón Hi-C bibliotecas.

Elementos reguladores del ADN, como potenciadores, controlan la expresión génica físicamente en contacto con promotores de genes de la blanco, a menudo a través de interacciones cromosómicas largo alcance que abarca grandes distancias genómicas. Promotor de captura Hi-C (PCHi-C) identifica interacciones significativas entre promotores y regiones distales, permitiendo la asignación de posibles secuencias reguladoras a sus genes diana.

Promotor captura Hola-C: Perfiles de alta resolución, genoma de interacciones promotor

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Dado que los elementos reguladores, como los potenciadores transcripcionales, pueden localizarse a grandes distancias genómicas de sus genes diana, que regulan a través de interacciones cromosómicas de largo alcance, el objetivo de Promoter Capture Hi-C es vincular los elementos reguladores de genes con sus genes diana. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la estructura y función del genoma, como cómo la arquitectura tridimensional de un genoma afecta el control de la expresión génica. La principal ventaja de esta técnica es que permite la detección de interacciones significativas entre los promotores, una sola restricción de la solución.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia, ya que puede vincular variantes de secuencias asociativas de enfermedades no codificantes en o cerca de secuencias de control reguladoras con sus genes diana. Comience con un mínimo de 20 millones de células por experimento. En el caso de las células de suspensión, recoja y centrifugue las células a 400 veces g y 20 grados centígrados durante tres minutos.Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de celda en 30.625 mililitros de medio con 10% de FBS a temperatura ambiente. A continuación, añada 4.375 mililitros de paraformaldehído sin metanol al 16% hasta una concentración final del 2%Fije las células durante 10 minutos a temperatura ambiente mezclando suavemente en un balancín. Apague la reacción agregando 5 mililitros de glicina helada de un molar recién preparado.Mezclar durante cinco minutos meciendo suavemente a temperatura ambiente. A continuación, incubar en hielo durante 15 minutos con inversión ocasional. A continuación, centrifugar las celdas de suspensión a 760 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos.Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de celda en 50 mililitros de PBS frío como hielo pH 7.4. Finalmente, centrifugar las células a 400 veces g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos y retirar con cuidado el sobrenadante. Después de la lisis celular como se describe en el protocolo de texto, lave los núcleos celulares con un tampón de restricción 1.25x 2.Para ello, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón helado y transfiera los núcleos resuspendidos a un tubo de 1,5 mililitros. Gire los núcleos a 760 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos antes de eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en 1790 microlitros de tampón de restricción 1,25x 2.A continuación, divida la suspensión en cinco alícuotas, cada una de las cuales contiene de cinco a 10 millones de núcleos celulares en 358 microlitros. Añadir 11 microlitros de 10%peso por volumen SDS por alícuota y agitar a 950 revoluciones por minuto durante 30 minutos a 37 grados centígrados en una termobatidora. Si aparecen aglomeraciones de células, disociarlas mediante pipeteo evitando hacer burbujas.A continuación, agregue 75 microlitros de Triton X-100 al 10% por alícuota y agite a 950 rpm y 37 grados centígrados durante 15 minutos en una termobatidora. Añadir 12 microlitros de 100 unidades por microlitro de HindIII por alícuota. Incubar a 37 grados centígrados durante la noche mientras se agita a 950 rpm en una termobatidora.Después de la digestión, realice una PCR cuantitativa como se detalla en el protocolo de texto. A continuación, agregue 60 microlitros de mezcla maestra de biotinilación por alícuota y mezcle. Incubar las alícuotas a 37 grados centígrados durante una hora, agitando a 700 rpm durante cinco segundos cada 30 segundos.Después de una hora, coloque las alícuotas en hielo. Realice la biblioteca Hi-C como se detalla en el protocolo de texto. Transfiera entre 500 nanogramos y un microgramo de la biblioteca Hi-C a un tubo nuevo y luego evapore la muestra en un concentrador de vacío hasta que se seque.Vuelva a suspender la biblioteca Hi-C evaporada agregando 3,6 microlitros de agua de grado de biología molecular, 2,5 microlitros de bloqueador 1, 2,5 microlitros de bloqueador 2 y 0,6 microlitros de bloqueador personalizado. Transfiera la muestra a un pocillo de una nueva tira de tubo de PCR, ciérrela con la tira de tapa de PCR y coloque la muestra en hielo. Etiquete el pocillo como D para Hi-C DNA.Prepare el búfer de hibridación como se describe en el protocolo de texto. Incubar el tampón a 65 grados centígrados durante cinco minutos en una termobatidora. Transfiera el tampón a un pocillo de una nueva tira de tubos de PCR, ciérrelo con la tira de tapa de PCR y manténgalo a temperatura ambiente.Etiquete el pozo como H para el búfer de hibridación. En un pocillo de una nueva tira de tubo de PCR, mezcle cinco microlitros de 100 nanogramos por microlitro de sondas de ARN biotinilado, 0,5 microlitros de inhibidor de ARNasa B y 1,5 microlitros de agua de grado de biología molecular. Cierre la tira de tubo de PCR con una tira de tapa de PCR y colóquela en hielo.Etiquete el tubo como R para ARN. Configure la máquina de PCR como se detalla en el protocolo de texto. Proceda lo más rápido posible durante todos los procedimientos mientras la máquina de PCR está en funcionamiento para evitar la evaporación de la muestra.Coloque la tira de tubo de PCR D en la máquina de PCR, cierre la tapa de la máquina de PCR e inicie la reacción de PCR. Cuando el programa de PCR alcance los 65 grados centígrados, abra la tapa de la máquina de PCR y coloque la tira de tubo de PCR H en la máquina de PCR. Cierre la tapa de la máquina de PCR e incube durante tres minutos.Luego abra la tapa de la máquina de PCR, coloque la tira de tubo de PCR R en la máquina de PCR y cierre la máquina de PCR. Después de dos minutos, abra la tapa de la máquina de PCR y todas las tiras de tubos de PCR. Transfiera 13 microlitros del pocillo H al pocillo R y luego todo el volumen del pocillo D al pocillo R. Pipete hacia arriba y hacia abajo tres veces para mezclar la reacción y cerrar la tira de tubo de PCR.Retire las tiras de tubos de PCR H y D y cierre la tapa de la máquina de PCR. Incubar la reacción a 65 grados centígrados durante 24 horas. Agregue 60 microlitros de perlas magnéticas acopladas a estreptavidina en un tubo nuevo.Coloque el tubo en el soporte de separación magnética durante un minuto antes de retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender las cuentas con 200 microlitros de tampón de unión 1x y gire durante tres minutos a temperatura ambiente y 15 rpm en una rueda giratoria. Haga girar suavemente el tubo en una centrífuga de sobremesa durante dos o tres segundos para recoger la muestra.Después de colocar el tubo en el soporte de separación magnética durante tres minutos, retire el sobrenadante. Repite este lavado dos veces. A continuación, vuelva a suspender las perlas en 200 microlitros de tampón de unión 1x.Abra la máquina de PCR y la tira de tubo de PCR mientras el programa de PCR aún está en ejecución y transfiera la reacción de hibridación al tubo con las perlas magnéticas. Incubar la reacción y las perlas a temperatura ambiente durante 30 minutos en una rueda giratoria a tres rpm. Recupere las perlas en el soporte de separación magnética y retire el sobrenadante transparente.Después de volver a suspender las perlas en 500 microlitros de tampón de lavado, 1 incube la muestra durante 15 minutos a 20 grados centígrados mientras agita a 950 rpm en una termomezcladora. De nuevo, reclama las cuentas y retira el sobrenadante transparente. Ahora vuelva a suspender las perlas en 500 microlitros de tampón de lavado 2 y mezcle.Incubar la muestra durante 10 minutos a 65 grados centígrados mientras se agita a 950 rpm en una termobatidora. Repita este lavado con tampón de lavado 2 dos veces más. A continuación, coloque la muestra en el soporte de separación magnética, retire el sobrenadante transparente y vuelva a suspender las perlas en 200 microlitros de tampón de restricción 1x 2.Después de recuperar las perlas y eliminar el sobrenadante nuevamente, vuelva a suspender las perlas en 30 microlitros de tampón de restricción 1x 2. Esta figura muestra el perfil de interacción Hi-C de captura del promotor para el promotor IL8 en 17 tipos de células hematopoyéticas humanas. Las interacciones promotoras de los tipos de células linfoides se muestran como arcos púrpuras y las interrupciones del promotor de los tipos de células mieloides se muestran como arcos azules.Las interacciones específicas de los monocitos se indican con flechas verdes, las interacciones específicas de los neutrófilos se indican con flechas rojas y la interacción específica de los megacariocitos se indica con una flecha marrón. Al intentar este procedimiento, es importante recordar trabajar con la mayor precisión posible. No es magia negra, pero es un protocolo largo, por lo que los pequeños errores se sumarán para afectar negativamente la calidad de los datos al final.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la edición del epigenoma del genoma CRISPR/Cas9, con el fin de interrogar la función biológica de las regiones que interactúan con el promotor descubiertas por el promotor Capture Hi-C. Después de ver este video, esperamos que tenga una buena comprensión de cómo implementar el promotor Capture Hi-C en su laboratorio.

promoter-capture-hi-c-high-resolution-genome-wide-profiling-promoter

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

El método de Hi-C permite la identificación imparcial de todo el genoma de las interacciones entre la cromatina (1). Hi-C parejas ligadura de proximidad y de secuenciación masiva en paralelo. Los datos resultantes se pueden utilizar para estudiar arquitectura genómica a diferentes escalas, los resultados iniciales identificaron características tales como los territorios de cromosomas, la segregación de la cromatina abierta y cerrada, y la estructura de la cromatina en la escala de megabase.

Hi-C: Un método para estudiar la arquitectura tridimensional de los genomas.

Aquí, describimos un protocolo de secuencia de ChIP de alto rendimiento optimizado y tubería de análisis computacional para la determinación de patrones de estado de todo el genoma cromatina de líneas celulares y tejidos del tumor congelado.

Una plataforma integrada para la asignación de todo el genoma de cromatina Estados mediante secuenciación del ChIP de alto rendimiento en los tejidos del Tumor

Se trata de un método para identificar nuevas proteínas DNA-que obran recíprocamente en lugares geométricos específicos, basándose en la captura de la secuencia específica de cromatina reticular para análisis proteómicos posteriormente. No se requiere ningún conocimiento previo sobre posibles proteínas, ni modificaciones de la célula. Inicialmente desarrollado para la levadura, la tecnología ahora se ha adaptado para células de mamífero.

Adaptación de la hibridación de captura de las proteínas asociadas a cromatina para proteómica a células de mamíferos

La identificación de interacciones físicas entre los genes y elementos reguladores es un reto, pero ha sido facilitada por los métodos de captura de conformación de cromosoma. Esta modificación al Protocolo de 4C-seq mitiga sesgo PCR minimizando la amplificación excesiva de plantillas de PCR y maximiza el mappability de Lee mediante la incorporación de un paso de síntesis de enzima de la restricción además.

Captura de alto rendimiento identificación de secuencias reguladoras de genes utilizando secuenciación de próxima generación de conformación Circular cromosoma (4C-seq)

Informamos de la aplicación de la captura cuantitativa de conformación cromosómica seguida de la secuenciación de alto rendimiento en cuerpos embrionarios generados a partir de células madre embrionarias. Esta técnica permite identificar y cuantificar los contactos entre potenciadores putativos y regiones promotoras de un gen dado durante la diferenciación de células madre embrionarias.

Identificación de contactos potenciadores-promotores en cuerpos embrionarios por captura cuantitativa de conformación cromosómica (4C)

Este protocolo describe el método Capture Hi-C utilizado para caracterizar la organización 3D de regiones genómicas específicas de tamaño megabasado en alta resolución, incluidos los límites de los dominios de asociación topológica (TAD) y las interacciones de cromatina de largo alcance entre los elementos reguladores y otros elementos de secuencia de ADN.

Descifrando la organización de la cromatina 3D de alta resolución a través de Capture Hi-C

ATAC-seq es un método de secuenciación de ADN que utiliza la transposasa mutante hiperactiva, Tn5, para mapear los cambios en la accesibilidad de la cromatina mediada por factores de transcripción. ATAC-seq permite el descubrimiento de los mecanismos moleculares subyacentes a las alteraciones fenotípicas en las células cancerosas. Este protocolo describe los procedimientos de optimización para ATAC-seq en tipos de células epiteliales, incluidas las células cancerosas.

Optimización ATAC-SEQ para la investigación epigenética del cáncer

La expresión génica está regulada por interacciones de promotores génicos con elementos reguladores distales. Aquí, describimos cómo la baja entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite la identificación de estas interacciones en tipos de células raras, que antes no se podían medir.

Un flujo de trabajo integrado para estudiar la arquitectura del genoma espacio-temporal centrada en el promotor en poblaciones celulares escasas

Presentamos un flujo de trabajo sin codificación para que los biólogos identifiquen potenciadores genéticos específicos de tejidos utilizando solo herramientas basadas en navegador. Nuestro protocolo aprovecha las marcas públicas de histonas H3K4me1/H3K27ac y los datos de Hi-C, lo que permite a los investigadores sin experiencia en programación acceder, analizar e identificar posibles elementos reguladores asociados con sus genes de interés.

Un flujo de trabajo basado en la web para seleccionar potenciadores específicos de genes y tejidos

Este protocolo proporciona una canalización computacional optimizada para cuantificar las transcripciones de potenciadores nacientes. Al integrar la accesibilidad de la cromatina, la característica de la cromatina y los datos transcripcionales, permite una detección precisa y un análisis específico de la actividad potenciadora de la hebra en regiones intragénicas complejas, sin dejar de ser accesible para los investigadores sin una amplia formación en bioinformática.

Una canalización computacional para la cuantificación de ARN potenciador intergénico / intragénico en células madre embrionarias de ratón

Aprende a implementar Promoter Capture Hi-C para identificar interacciones cromosómicas de largo alcance entre promotores y elementos reguladores. Este método permite vincular variantes no codificantes asociadas a enfermedades con sus genes diana.

Promotor captura Hola-C: Perfiles de alta resolución, genoma de interacciones promotor

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