Formación de biopelículas inducida por sales biliares en patógenos entéricos: técnicas para la identificación y cuantificación

El objetivo general de este protocolo de formación y evaluación de biopelículas es determinar la capacidad de los patógenos bacterianos entéricos para formar una biopelícula, especialmente en condiciones que imitan el tránsito gastrointestinal y la exposición a las sales biliares. Los métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la patogénesis bacteriana, como la capacidad de los patógenos entéricos para sobrevivir a las duras condiciones de sales biliares del tracto gastrointestinal. La principal ventaja de las técnicas es que los resultados combinados de los tres ensayos respaldan la caracterización en profundidad de la formación de biopelículas en respuesta a la exposición a las sales biliares de cada patógeno.

Primero tuvimos la idea de los métodos combinados, dada la necesidad de cuantificar completamente la formación de biopelículas inducida por sales biliares en Shigella flexneri. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque algunos aspectos del ensayo pueden limitar la reproducibilidad. Por lo tanto, preste atención a los pasos críticos para garantizar la reproducibilidad.

Los miembros de mi laboratorio, Kourtney Nicherson, becaria postdoctoral, y Alejandro Llanos, becario de investigación clínica, demostrarán los procedimientos. En primer lugar, etiquete dos tubos de 1,5 mililitros como TSB y TSB plus BS. A continuación, añada un mililitro de TSB o TSB más BS a los tubos respectivos. A continuación, inocule los tubos con 20 microlitros de cultivo durante la noche en una dilución de uno a 50.

A continuación, añada 130 microlitros de medios de control no inoculados a cada uno de los tres pocillos en una placa estéril, transparente, de fondo plano, tratada con cultivo de tejidos, de 96 pocillos. Este será el control en blanco. Agregue 130 microlitros de cultivo inoculado en cada uno de los tres pocillos.

Después de agregar el control y el cultivo inoculado en los pocillos respectivos, incubar la placa de 96 pocillos durante cuatro a 24 horas a 37 grados centígrados, estáticamente. Una vez finalizada la incubación, coloque el control en blanco en el lector de placas. A continuación, aspire el medio de cultivo de cada pocillo.

A continuación, lave suavemente los pocillos una vez con 200 microlitros de PBS estéril. Después del lavado, aspire el PBS y luego invierta la placa para que se seque durante unos 20 minutos. Es muy importante garantizar una eliminación suave de los medios y un lavado suave, para garantizar que la matriz de EPS no se altere.

A continuación, agregue 150 microlitros de 0.5% de violeta cristalino a cada uno de los pocillos experimentales y de control. A continuación, incubar la placa durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de cinco minutos, lave los pozos una vez con 400 microlitros de agua destilada.

Agrega 200 microlitros de agua destilada para lavar los pozos cinco veces. Después de los cinco lavados, invierte la placa y déjala secar por completo, protegida de la luz. Para obtener resultados consistentes, es importante que las muestras se sequen completamente antes de continuar.

Después de que la placa esté completamente seca, use 200 microlitros de etanol al 95% para eliminar las manchas de los pocillos. A continuación, deje la placa en la coctelera durante 30 minutos a cuatro grados centígrados, para evitar la evaporación. Después de 30 minutos, registre el OD 540 en el lector de placas.

Para la detección semicuantitativa de EPS, utilice una pipeta multicanal para transferir el medio de cultivo a una placa transparente de 96 pocillos. A continuación, utilice 200 microlitros de reactivo fijador para fijar la placa negra durante 15 minutos a temperatura ambiente. Ahora registre la lectura de OD 600 configurando el pozo de control y la pieza en blanco para la estandarización.

A continuación, registre la lectura del medio de cultivo mientras se fija la población adherente. Una vez completada la fijación, retire el reactivo y deséchelo en el residuo peligroso. A continuación, utilice 200 microlitros de PBS estéril para lavar suavemente los pocillos dos veces.

Después del lavado, aspire el PBS. A continuación, agregue 150 microlitros de 25 microgramos por mililitro de ConA-FITC. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Después de la incubación, lave suavemente los pocillos con 200 microlitros de PBS. Luego agregue 150 microlitros de PBS a cada pocillo y registre la fluorescencia a 488 nanómetros. Después de preparar los reactivos frescos, caliente el PBS, el PBS con glucosa, el PBS con sales biliares y el PBS con glucosa y sales biliares a 27 grados centígrados.

A continuación, registre los valores de OD 600 de la placa de biofilm durante la noche en el lector de placas configurando el pozo de control en blanco. A continuación, aspire el medio de cultivo utilizando una línea de vacío, sin perturbar la población adherente en la superficie de plástico. Lave suavemente los pocillos dos veces con 200 microlitros de PBS estéril.

Después de lavar con PBS, agregue 130 microlitros de PBS precalentado, PBS con glucosa, PBS con sales biliares y PBS con sales biliares y glucosa a cada uno de los tres pocillos, luego incube la placa a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de 30 minutos, retire la placa de la incubadora. Pipetee el sobrenadante en una placa fresca y estéril de 96 pocillos.

Finalmente, prepare de una a 10 diluciones seriadas del sobrenadante con PBS en la placa de 96 pocillos o en un bloque de dilución. A continuación, utilice una pipeta multicanal para transferir cinco microlitros de cada dilución en placas de agar LB. Incubar las placas a 37 grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, cuenta el número de colonias. El diagrama de barras se obtiene para cuantificar la formación de biopelículas dependientes de sales biliares en patógenos entéricos. Esto se hace trazando los valores de OD 540 de las cepas individuales en presencia y ausencia de sales biliares en el medio.

El gráfico muestra un aumento significativo en la formación de biopelículas para la mayoría de las cepas patógenas, excepto E. Coli enteroaggrativa. A continuación, se detecta el EPS producido durante la formación de la biopelícula determinando la cantidad de ConA-FITC retenida por el EPS. El diagrama de barras muestra una lectura de fluorescencia significativamente aumentada en presencia de sales biliares.

Esto confirma la producción de EPS para el patógeno Shigella flexneri. En este caso, la tinción dependiente de ConA-FITC de la matriz de EPS es significativamente alta cuando se expone a las sales biliares. Esto indica la formación de biopelícula bacteriana, caracterizada por la matriz de EPS rica en polisacáridos.

Se utilizan One X PBS y DAPI para mostrar la especificidad dependiente de FITC y la presencia del ADN bacteriano, respectivamente. Finalmente, se cuenta el número de unidades formadoras de colonias para analizar la dispersión de bacterias dependientes de la sal biliar del biofilm. El gráfico muestra que las bacterias se dispersan fácilmente desde las biopelículas en PBS y PBS con glucosa.

Sin embargo, la exposición de las bacterias a las sales biliares inhibe drásticamente su dispersión de las biopelículas. Estos ensayos se desarrollaron para capturar y cuantificar las biopelículas virulentas transitorias formadas por patógenos entéricos, en particular Shigella flexneri, en respuesta a la exposición a sales biliares en el intestino delgado antes de la infección en el colon. Es posible que sea necesario ajustar las modificaciones de los ensayos, como los tipos de medios básicos, la composición de las sales biliares utilizadas y las condiciones de crecimiento bacteriano, según el sitio de infección dentro del tracto gastrointestinal.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar cada uno de los ensayos para evaluar a fondo la formación de biopelículas en su cepa bacteriana o mutante de interés. Recuerde que trabajar con los patógenos y algunas de las soluciones puede ser extremadamente peligroso. Siempre se deben tener en cuenta precauciones como los métodos adecuados de manipulación y eliminación al realizar estos ensayos.

Además, la preparación de los medios de sales biliares frescas, los controles adecuados y la garantía de la reproducibilidad experimental son vitales para el análisis de datos y la confirmación del fenotipo de biopelícula inducido por sales biliares. Las técnicas, que son aplicaciones únicas y creativas de alto rendimiento de los métodos tradicionales, permitirán la cuantificación adecuada del proceso multifacético y dinámico de formación de biopelículas inducidas por sales biliares en patógenos entéricos.