Name: El protocolo MPLEx para Multi-omic análisis de muestras de suelo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprenda el protocolo MPLEx para extraer metabolitos, proteínas y lípidos de una sola muestra de suelo. Este método mejora la precisión y reduce el tiempo de preparación en estudios multi-ómicos de microbiología ambiental.

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Los autores desean agradecer a Nathan Johnson por su asistencia en la preparación de las figuras. Esta investigación fue apoyada por el programa de Panamericanos-ómicas que es financiado por el Departamento de energía de Estados Unidos Oficina de biológicos y la investigación ambiental (programa de Ciencias Genómicas), el Microbiomes en transición (menta) laboratorio dirigido investigación desarrollo Iniciativa en el Pacific Northwest National Laboratory, así como el nacional institutos de salud nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental (R01 ES022190) y NIH (P42 ES027704). KEBJ quiere agradecer R21 HD084788 apoyo financiero desarrollar y validar técnicas de extracción de novela multi-omic. Este trabajo fue realizado en el W. R. Wiley ambiental Molecular Ciencias de laboratorio (Page), una instalación de usuario científico nacional de DOE en el laboratorio nacional del Noroeste Pacífico (PNNL). PNNL es un laboratorio nacional de multi-programa operado por Battelle para la coneja bajo contrato DE-AC06-76RL01830.

Nota: Suelos muy húmedos pueden ser liofilizados antes de la extracción sin perjuicio de la eficacia de la extracción. Suelo mojado también se puede utilizar pero debe considerarse al agregar reactivos en proporciones específicas.
Nota: Se recomienda usar 20 g de peso de suelo seco por extracción, que debe ser dividida entre los dos tubos de 50 mL (máximo de 10 g de suelo por el tubo de 50 mL). Las extracciones se pueden escalar hacia arriba o abajo dependiendo de la muestra disponible.
Nota: Las muestras de suelo seco pueden ser tamizadas a través de una pantalla de 3 mm con el fin de homogeneizar y eliminar piedras y raíces pequeñas. Tamiz no de muestras de suelo húmedo, como la muestra se atranca en la pantalla.
1. lisis celular y extracción de metabolitos, proteínas y lípidos (sincronización d ~ 1) del suelo
<ol><li>Por muestra de suelo de 20 g, pesar 10 g en dos tubos separados 50 mL metanol/cloroformo compatible. Sea extremadamente cuidadoso con los tubos escogidos, como cloroformo lixiviará a mayoría de los plásticos, contaminar las muestras. Utilizar el vidrio siempre que sea posible o plástico tubos hechas de polipropileno o politetrafluoroetileno (PTFE). Nota: Mantener el suelo en el hielo y tan frescas como sea posible durante los primeros pasos de pesaje y homogeneización.</li>
	<li>Añadir 10 mL de cloroformo-lavado de acero inoxidable y perlas de granate a cada tubo. En el hielo, añadir 4 mL de frío ultrapura (véase Tabla de materiales para sistema de la purificación) de agua a cada tubo (una muestra dividida entre dos tubos) y transferir las muestras en un cubo de hielo en una campana de humos.</li>
	<li>Rápidamente utilizando una pipeta serológica de vidrio de 25 mL, añadir 20 mL de helado 2:1 cloroformo: metanol (v/v). Atención: Cloroformo: metanol tiene efectos de salud potenciales agudos: irritación al sistema respiratorio, irritación y posibles quemaduras químicas de la piel. Puede afectar a los riñones, hígado y corazón. Guantes, ropa y gafas de protección adecuadas y siempre trabajar en una campana de humos.</li>
	<li>Apriete los párpados y vórtice en solución. choloroform:methanol 2:1 ayuda a romper la pared celular de procariotas y también inactiva la actividades enzimáticas.</li>
	<li>Fije los tubos y accesorios de 50 mL tubo vortex horizontal vortex durante 10 min a 4 ° C dentro de una nevera si es posible. Luego, coloque las muestras dentro de un congelador de-80 ° C ~ 15 minutos para enfriar completamente.</li>
	<li>Utilizando un sonicador de sonda dentro de una campana de humos, someter a ultrasonidos cada muestra con una sonda de 6 mm (1/4") en amplitud 60% para 30 s en el hielo. PRECAUCIÓN: Se recomienda utilizar un sonido disminuir la protección del recinto y oído mientras sonicando. Alto voltaje está presente en el cable de alimentación y de alta frecuencia. Evite tocar el fondo o las paredes del vaso de muestra con una sonda activa; puede romper o derretir el plástico.</li>
	<li>Coloque las muestras en el congelador de-80 ° C de ~ 15 minutos, como sonicando puede generar mucho calor.</li>
	<li>Repita los pasos 1.5-1.7. Nota: Asegúrese de que las muestras permanezcan frías durante todo el procedimiento de lisis.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 4.000 x g durante 5 min, 4 ° C. En este punto, la muestra se separará en la capa superior del metabolito, la capa intermediaria de la proteína y la capa más baja de lípidos (y pellets de residuos restantes). Vea la figura 1.</li>
	<li>Coloque las muestras en hielo en una cubitera y, dentro de una campana de humos y usando una pipeta serológica de vidrio de 10 mL, retire las capas superiores del metabolito de los dos tubos de 50 mL en frasco de vidrio grande. Nota: Evitar la aspiración de la capa de proteína dentro de la pipeta; Deje una pequeña capa de metabolito si es necesario.</li>
	<li>Incline levemente el tubo de 50 mL para liberar la capa de proteína que está flotando libre en la capa más baja de lípidos. Cuidadosamente con una espátula de laboratorio de cabeza plana de acero inoxidable limpio, primicia de los separadores de proteínas y colocarlos juntos en un nuevo tubo de 50 mL.</li>
	<li>Usando una pipeta serológica de vidrio de 25 mL, retire las capas más bajas de lípidos en un frasco de cristal grande. Nota: Tratar de evitar a las partículas del suelo; sin embargo, algunos residuos de suelo y partículas aspiraban junto con los lípidos se eliminará posteriormente.</li>
	<li>Lugar las membranas transpirables en la parte superior del metabolito y lípidos frascos de vidrio y seco en un concentrador de vacío hasta sequedad (lípidos ~ 4-5 h, metabolitos durante la noche).</li>
	<li>El tubo de muestra de la proteína y los tubos de pellets de residuos restantes, añadir 20 mL de metanol helada a cada uno y de vortex. Esto se hace para las pelotillas de escombros para enjuagar cloroformo antes de intentar solubilizar cualquier posible proteína restante fuera de la basura antes de tirarlo.</li>
	<li>Centrifugar el pellets de residuos y la proteína de la capa intermediaria a 4.000 x g durante 5 min, 4 ° C, luego decantar el metanol en un contenedor de residuos peligrosos dentro de una campana de humos.</li>
	<li>Congelar las pelotillas de la proteína y los residuos en nitrógeno líquido y en seco en un liofilizador (con una temperatura del colector de-105 ° C por metanol tiene un muy bajo punto de congelación de-98 ° C) durante 2 horas. Nota: No seque demasiado las pelotillas, que serán más difíciles de solubilizar.</li>
	<li>Añadir 10 mL de tampón de solubilización de proteínas (4% SDS, 100mM DTT (DL-Ditiotreitol) en 50mM de tampón tris, pH 8.0; vea Configuración reactivo complementario) a la capa intermediaria tubo de proteína y 20 mL a cada uno de los pellets de residuos. PRECAUCIÓN: SDS causa toxicidad aguda y es inflamable. Es un irritante de las vías respiratorias, piel y ojo. Use guantes y gafas de seguridad.</li>
	<li>En campana, sonda someter a ultrasonidos las muestras a 20% amplitud de 30 s para solución. Vortex por 2 min.</li>
	<li>Coloque la muestra de proteína capa intermediaria en un agitador de tubo de laboratorio durante 30 min a 300 rpm, 50 ° C, para solubilizar la proteína.</li>
	<li>Horizontal vórtice las muestras de escombros por un adicional 10 min para lyse las células intactas restantes, luego gire con las muestras de proteína capa intermediaria para los restantes 20 minutos.</li>
	<li>Centrifugar todas las muestras a 4.500 x g durante 10 min, temperatura ambiente (RT) y recoger el sobrenadante de cada tubo por muestra en dos tubos de 50 mL.</li>
	<li>Añadir 10 mL de solubilización del almacenador intermediario para el precipitado de proteína capa intermediaria, luego someter a ultrasonidos y vórtice en solución y centrifugar como antes.</li>
	<li>Igualmente se combinan los sobrenadantes en los dos tubos de 50 mL y centrifugar a 8.000 x g durante 10 min, 4 ° C, en un rotor de ángulo fijo cubo. Nota: Una centrifugación final es necesario para eliminar la contaminación excesiva de las sustancias húmicas.</li>
	<li>Decantar el sobrenadante en dos tubos de 50 mL por lo que hay 30 mL en cada uno. Luego, utilizando una pipeta serológica de vidrio de 10 mL, añadir 7,5 mL de TCA (ácido tricloroacético) a cada tubo. Vórtice en solución. Esto hace que 20% TCA en cada muestra de 30 mL (Ayuste), PRECAUCIÓN: TCA es cáustico, tóxico y mayo causar quemaduras en la piel. Use guantes y gafas de seguridad.</li>
	<li>Coloque las muestras en un congelador de-20 ° C por 2 h para toda la noche. Nota: Las proteínas precipitan típicamente dentro de 1 h pero pueden ser dejado toda la noche (hasta 18 h). Nota: No deje que la extracción del TCA van más de 18 h debido a la posible hidrólisis ácida de la proteína. Si la muestra es congelada, la descongele el hielo; No permita que la muestra caliente más allá de deshielo.</li>
	<li>Para la proteína precipitada de la pelotilla, centrifugar la muestra a 4.500 x g durante 10 min, 4 ° C y decantar el sobrenadante en residuos.</li>
	<li>Añadir 10 mL de acetona helada 100% a cada pellet de proteína, vortex y se combinan como pelotillas en un tubo.</li>
	<li>Centrifugar el tubo que contiene la pastilla combinada (con balanza) y luego decantar el sobrenadante en residuos. PRECAUCIÓN: La acetona puede causar irritación de la piel y los ojos y vías respiratorias y es un líquido inflamable y el vapor de. Use gafas de seguridad guantes y una bata de laboratorio, en una campana de humos.</li>
	<li>Lavar el pellet dos veces con 1,5 mL de acetona y por último transferir a un tubo de 2 mL para el final de la vuelta a 10.000 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Decantar el sobrenadante en residuos y permiten la pelotilla secar invertida en una toallita de papel en una campana de humos para ~ 20 min o bajo una corriente de nitrógeno hasta que el pellet ligeramente comienza a agrietarse.</li>
	<li>Añadir 100-200 μL del buffer de solubilización de proteína, dependiendo del tamaño de la pelotilla. Nota: Mantenga el volumen de tampón de solubilización añadido a la muestra lo más baja posible. Posterior filtro asistido por ejemplo preparación (FASP) sólo puede utilizar hasta 50 μL de muestra solubilizado por columna; alguno más debe ser dividido en varias columnas FASP.</li>
	<li>Someter a ultrasonidos y agitar el sedimento en solución. Tenga en cuenta que la muestra puede ser viscosa debido a sustancias húmicas precipitando junto con la proteína, que se eliminará con una posterior centrifugación.</li>
	<li>Agite la muestra en un incubadora/agitador durante 30 min a 300 rpm, 40 ° C, para solubilizar la proteína en solución y proceder a la digestión de proteínas.</li>
	<li>Snap freeze la muestra en nitrógeno líquido y guardar en un congelador de-80 ° C hasta que esté listo para la digestión de proteínas.</li>
</ol>2. lípidos preparación (tiempo ~ 20 min)
<ol><li>Una vez secas las muestras de lípidos, añadir 200 μL de 2:1 cloroformo: metanol al frasco, vortex en solución y la transferencia en un tubo de polipropileno de 1.5 mL, agregar un adicional 200 μL para el vidrio del frasco, vortex y pipetee los restantes lípidos y transferir al tubo.</li>
	<li>Centrifugue los escombros fuera de la muestra a 12.000 x g durante 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Transferir el sobrenadante a un frasco de cristal lípidos y conservar a-20 ° C hasta análisis de LC-MS/MS (detalles adicionales para LC-MS/MS en Métodos complementarios).</li>
	<li>Si las muestras no pueden ser analizadas inmediatamente después de la preparación, los lípidos necesitan almacenarse en solvente a-20 ° C para evitar la oxidación y la degradación.</li>
</ol>3. metabolito preparación y derivatización (tiempo ~ 5 h)
<ol><li>El día después de la extracción, quitar las muestras del metabolito de la aspiradora de velocidad y almacenar seco a-20 ° C hasta que esté listo para la derivatización y análisis en el GC. Si no ejecuta los metabolitos en un GC, luego prepararlos usando el protocolo apropiado para el instrumento.</li>
	<li>Inmediatamente antes de derivatizando los metabolitos para análisis en el GC, transferirlas desde los frascos grandes de vidrio mediante la adición de 200 μL de metanol, Vortex y agregar a un tubo de polipropileno de 1.5 mL. Repetir una vez.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 12.000 x g durante 10 min, 4 ° C. Transferir el sobrenadante a pequeños frascos de cristal, añadir una membrana respirable a la parte superior y completamente seca en una aspiradora de velocidad.</li>
	<li>Derivatize los metabolitos añadiendo 20 μl de solución de methoxyamine al frasco de la muestra y vortex durante 30 s en un Vortex a velocidad media. PRECAUCIÓN: El clorhidrato de Methoxyamine causa quemaduras graves y daños a los ojos, puede causar sensibilización por contacto con la piel. Usar gafas de seguridad, guantes y bata de laboratorio y trabajar en una campana de humos.</li>
	<li>Utilice un sonicador de baño para asegurar que la muestra esté completamente disuelta.</li>
	<li>Incubar la muestra en una incubadora con una tapa de condensación prevención mantenida a 37 ° C por 1 h 30 min con agitación de 1.000 rpm.</li>
	<li>Invierta el frasco de una vez para mezclar las muestras con gotas condensadas en la superficie de la tapa. Desactivación la muestra a 1.000 x g durante 1 min, RT</li>
	<li>Realizar silanización agregando 80 μl (utilizando una jeringa) de N-metil - N-(trimetilsilil) trifluoroacetamida con trimetilclorosilano % 1. Vortex para 10s. PRECAUCIÓN: MSTFA + 1% TMCS puede causar corrosión de la piel, daños oculares graves y toxicidad para los órganos específicos y es un líquido inflamable y el vapor. Usar gafas de seguridad, guantes y bata de laboratorio y trabajar en una campana de humos.</li>
	<li>Incubar la muestra en una incubadora con una tapa de condensación prevención mantenida a 37 ° C por 30 min con agitación de 1.000 rpm.</li>
	<li>Invierta el frasco de una vez para mezclar las muestras con gotas condensadas en la superficie de la tapa.</li>
	<li>Desactivación la muestra durante 5 min a 2.000 x g, RT</li>
	<li>Transferir la solución reaccionada en frascos apropiados para el análisis de GC-MS.</li>
</ol>4. proteína digestión (tiempo ~ 1 d)
<ol><li>Centrifugar la muestra a 15.000 x g durante 5 min, RT, para que sedimenten los residuos.</li>
	<li>Realizar filtro-ayudado--preparación de muestras (FASP) para la digestión utilizando FASP kits (véase Tabla de materiales) siguiente modificado instrucciones31,32 del fabricante:<ol>
<li>Añadir 400 μL de la solución de urea de 8 M en una columna FASP (500 filtro MWCO de spin μL de 30 K).</li>
		<li>Una vez terminada la muestra centrifugando, pipeta de sobrenadante (Deseche los pellets) y añadir hasta 50 μL de la muestra a 400 μL de urea de 8 M en la columna. Nota: Agregar sólo hasta 50 μL de muestra por columna. Si hay más de 50 μL de muestra, utilizar múltiples columnas y los péptidos se combinan después de la digestión. Es mejor dejar este volumen tan bajo como sea posible (30 μL es ideal) para asegurar el FASP columna eliminará de la SDS que dramáticamente puede interferir con el análisis de masa spec.</li>
		<li>Coloque la columna en el tubo incluido 1.5 mL y centrifugar la muestra a 14.000 x g por 30 min, RT</li>
		<li>Quitar el flujo a través a basura y añadir 400 μL de urea de 8 M para la columna y centrifugar nuevamente.</li>
		<li>Repita el paso anterior una vez más para un total de 3 enjuagues de urea. Nota: Asegúrese de que la muestra va cerca de sequedad en la columna, si hay alguna más de ~ 30 μL queda en el filtro después de cada vuelta, continuar con centrifugación.</li>
		<li>Añadir 400 μL de 50 mM NH4HCO3 y centrifugar a 14.000 x g por 20 min, desechar los residuos y repetir una vez.</li>
		<li>Transferir las columnas a un tubo de centrífuga limpio de 1,5 mL.</li>
		<li>Añadir 75 μL de tampón de digestión de tripsina a las columnas e incubar a 37 ° C durante 3 horas en una incubadora con una tapa de condensación prevención a 750 rpm.</li>
		<li>Agregar 40 μl de 50 mM NH4HCO3 para las columnas.</li>
		<li>Centrifugar la muestra a 14.000 x g durante 15 minutos recoger los péptidos en el tubo manteniendo los contaminantes de alto peso molecular en la cima de la columna.</li>
		<li>Agregar 40 μL de 50mM NH4HCO3 a la columna y centrifugue de nuevo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deseche el columna, seco abajo los péptidos en el tubo de una aspiradora de velocidad a 30 μl y ensayo BCA (kit de ensayo de proteína ácido Bicinchoninic; véase Tabla de materiales) los péptidos.</li>
	<li>Opcionalmente, realizar un paso de limpiar si se sospecha de contaminación de la SDS (burbujas visibles)33. Una extracción en fase sólida debe hacerse luego si elegir esta opción. Toda la información sobre este método de limpieza está disponible en los Métodos complementarios.</li>
	<li>Diluir la muestra para análisis de MS u opcionalmente proceder al fraccionamiento de HPLC (dos pasos).
</li>
	<li>Para fraccionar, diluir muestras hasta un volumen de 400 μL con tampón de formiato de amonio 10 mM (pH 10.0).</li>
	<li>Resolver en una columna C18 (véase Tabla de materiales) separando a 0,5 mL/min utilizando un sistema HPLC con formiato de amonio fases móviles (A) 10 mM, pH 10.0 y (B) 10 formiato de amonio mM, pH 10.0/acetonitrilo (10:90).<ol>
<li>Ajustar el degradado de en 100% A 95% A durante los primeros 10 minutos, 95% un 65% A largo min 10 a 70, un 65% a un 30% sobre el minuto 70 a 85, mantener en 30% A sobre el minuto 85 al 95.</li>
		<li>Volver a equilibrar con 100% un sobre min 95 a 105 y sostenga al 100% A hasta el minuto 120.</li>
		<li>Recoger fracciones cada minuto 1,25 (96 fracciones sobre el gradiente de todo) y finalmente combinar cada fila para un total de 12 muestras o cada otra fila para 24 muestras (cada una con n = 8 o n = 4 fracciones agrupadas).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seco todas las fracciones en vacío y añadir 15 μl de agua ultrapura a cada uno para el almacenamiento a-20 ° C hasta el análisis por LC-MS/MS.</li>
</ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Es importante tener en cuenta que no todos los laboratorios tendrán el mismo equipo disponible para que ciertos métodos, por ejemplo el paso de lisis, pueden ser adaptados. Aquí utilizamos un vórtex y sonicando, sin embargo el uso de una batidora de grano grande 50 mL funcionaría. Si no encuentra un liofilizador con una temperatura del colector de-105 ° C, las muestras pueden ser secadas bajo una corriente de nitrógeno. También tipos de suelo varían mucho y pueden incluir arena, limo, arcilla, turba y Marga (etc.</em...

Evaluación de las comunidades microbianas del suelo tiene importantes implicaciones para la comprensión de carbono bicicleta y el cambio climático. Sin embargo estudios recientes han puesto de manifiesto dificultades, como la falta de los genomas secuenciados de microbiota en varios tipos de suelo y la función desconocida de muchas de las proteínas detectadas. Resultado de estos desafíos debido al suelo que la comunidad microbiana más compleja conocida hasta la fecha1,2,3. Análisis multi-omic, que combinan los resultados de la metagenómica, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolómicos y lipidómicos estudios, recientemente se han aplicado en numerosos estudios de suelo para obtener una mayor comprensión en los microbios presentes, mientras que obtener información completa sobre los cambios moleculares que debido a las perturbaciones ambientales1,4,5. Un reto con multi-omic estudios que es la espectrometría de masas (MS)-basado en mediciones metaproteomic, metabolómicos y lipidómicos requieren típicamente un proceso de extracción específico para cada omic que MS compatible6,7 , 8 , 9. estos procedimientos precisa hacen su aplicación extremadamente difícil o imposible cuando sólo hay una cantidad limitada de muestra disponible. Estos desafíos han llevado a investigar un simultáneo metabolitos, proteínas y lípidos (MPLEx) método de extracción capaz de masas o volúmenes de muestra pequeños, mejorar la precisión y proporcionando más rápidas preparaciones de muestra para los análisis de tres 10. hasta la fecha, no hay ningún procedimiento de extracción suelo alternativo que puede lograr todos estos objetivos.
Para habilitar multi-omic global análisis de una muestra de suelo solo, un protocolo de extracción con disolvente orgánico basado en cloroformo, metanol y agua separaciones fue utilizado10. Este método fue desarrollado originalmente para lípido total extracciones9,11 y más recientemente fue modificado para la extracción simultánea de metabolitos, proteínas y lípidos de una sola muestra12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30, lo que permite menor cantidad de muestra y variabilidad experimental10. En el protocolo MPLEx, cloroformo no es miscible con agua, que proporciona la base para el trifásico separación química de los componentes de la muestra en distintas fracciones. Por lo tanto, la fase superior acuosa contiene los metabolitos hidrofílicos, seguidos de un disco de proteína y una capa lipídica en la fase de cloroformo del fondo (figura 1). Cuando MPLEx se aplica a la mayoría de los suelos, desechos de partículas se acumulan en la parte inferior de los tubos de muestreo y pueden ser desechado después de que se recogen todas las capas. Cada tipo de suelo puede ser diferente, sin embargo y en suelos altamente orgánicos como turba, los restos de suelo permanece en la capa media y no caen en la parte inferior del tubo de muestreo. MPLEx proporciona varias ventajas al aislamiento de la molécula de múltiples tipos de la misma muestra como 1) pequeñas cantidades de muestra pueden utilizarse para el análisis de multi-omic, 2) multi-omic extracciones de la misma muestra disminución variabilidad general experimental, y 3) mayor número de muestras se puede preparar mucho más rápido para mayor rendimiento de estudios10. Juntos estos beneficios son vitales para ofrecer mejores capacidades de medición para la evaluación de las muestras de suelo y de sus comunidades microbianas complejas.

<table><tbody><tr><td>El cloroformo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498</td><td>almacenado a -20 grados; C ! Precaución el cloroformo tiene efectos potenciales agudos para la salud, irritación de la piel y posibles quemaduras químicas, irritación del sistema respiratorio, puede afectar los riñones, el hígado, el corazón. Use gafas, ropa y guantes protectores adecuados, trabaje en una campana extractora.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>almacenado a -20 grados; C ! Precaución El metanol puede causar irritación de las vías respiratorias, la piel y los ojos, puede dañar los nervios, los riñones y el hígado. Use gafas, ropa y guantes protectores adecuados, trabaje en una campana extractora.</td></tr><tr><td>Agua purificada del</td><td>sistema de purificación de agua</td> <td>Millipore Milli-Q</td><td></td>.</tr><tr><td>¡Dodecil sulfato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6026</td><td>! Precaución: El SDS causa toxicidad aguda y es inflamable. Es un irritante de la piel, los ojos y las vías respiratorias. Use guantes y gafas de seguridad.</td></tr><tr><td>Kit de extracción de proteínas del suelo</td><td>MoBio, NoviPure Kit de extracción de proteínas del suelo, Qiagen</td><td>30000-20</td><td></td></tr><tr><td>DL-dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>1M Trizma HCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2694</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tricloroacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td>! Precaución El TCA es cáustico, tóxico y puede causar quemaduras en la piel. Use guantes y gafas de seguridad.</td></tr><tr><td>acetona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td><td>almacenado a -20 grados; C ! Precaución: La acetona puede causar irritación de las vías respiratorias, la piel y los ojos. Líquidos y vapores inflamables. Use gafas de seguridad, guantes y una bata de laboratorio, trabaje con una campana extractora.</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208884</td><td>! Precaución La urea es un irritante para los ojos y la piel, use guantes y gafas de seguridad</td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio</td><td>Fluka</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Promega</td><td>V528A</td><td>20&micro; g viales Kit de ensayo de proteínas de</td></tr><tr><td>ácido bicinconínico</td><td>Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Formiato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09735</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998</td><td>! Precaución El acetonitrilo es un irritante de la piel y los ojos. Altamente inflamable. Use guantes y gafas de seguridad. Trabaje en una campana extractora.</td></tr><tr><td>¡Ácido trifluoroacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td>! Precaución El TFA es extremadamente peligroso en caso de contacto con la piel, contacto con los ojos, ingestión e inhalación. Puede producir daño tisular, particularmente en las membranas mucosas de los ojos, la boca y las vías respiratorias. El contacto con la piel puede producir quemaduras. Use guantes, bata de laboratorio, gafas de seguridad y trabaje con una campana extractora.</td></tr><tr><td>Clorhidrato de metoxiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>226904</td><td>! Precaución El clorhidrato de metoxiamina causa quemaduras graves y daños graves en los ojos, puede causar sensibilización por contacto con la piel. Use gafas de seguridad, guantes y bata de laboratorio, trabaje con una campana extractora.</td></tr><tr><td>¡Piridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td>! Precaución La piridina puede causar irritación de la piel y los ojos, depresión del sistema nervioso central. El vapor puede provocar un incendio repentino. Use gafas de seguridad, guantes y bata de laboratorio, trabaje con una campana extractora.</td></tr><tr><td>N-Metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetamida con 1% de trimetilclorosilano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69478</td><td>! Precaución MSTFA + 1% TMCS puede causar corrosión de la piel, daños oculares graves y toxicidad específica en órganos diana. Líquidos y vapores inflamables. Use gafas de seguridad, guantes y bata de laboratorio, trabaje con una campana extractora.</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de purificación de agua Milli-Q</td><td>Millipore</td><td></td><td>modelo MPGP04001</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Vortex Genie 2</td></tr><tr><td>Sonda sonicador</td><td>FisherBrand</td><td></td><td>modelo FB505</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>modelo 5810R</td></tr><tr><td>Tubo de 50mL rotor de cuchara basculante</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-44</td><td></td></tr><tr><td>50mL rotor de ángulo fijo</td><td>Eppendorf</td><td>FA-45-6-30</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>OHAUS</td><td></td><td>modelo V22PWE150IT</td></tr><tr><td>controlador de pipetas serológicas</td><td>Eppendorf</td><td>12-654-100</td><td></td></tr><tr><td>10mL, 25mL pipetas serológicas de vidrio</td><td>FisherBrand</td><td>13-678-27F, 13-678-36D</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer con Thermotop</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015, 5308000003</td><td></td></tr><tr><td>0,9 &ndash; 2,0 mm mezcla de perlas de acero inoxidable</td><td>NextAdvance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>0,15 mm perlas de granate</td><td>MoBio</td><td>13122-500</td><td></td></tr><tr><td>Plato agitador magnético</td><td>FisherBrand</td><td>11-100-16SH</td><td></td></tr><tr><td>Barra agitadora magnética</td><td>FisherBrand</td><td>14512130</td><td></td></tr><tr><td>pH tiras de papel, pH Rango 0&ndash; 14</td><td>FisherBrand</td><td>M95903</td><td></td></tr><tr><td>15mL, 50mL tubo de centrífuga cónico de polipropileno</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-103 21-108</td><td>compatible con cloroformo</td></tr><tr><td>50mL accesorio de vórtice</td><td>MoBio</td><td>13000-V1-50</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de hielo</td><td>FisherBrand</td><td>02-591-44</td><td></td></tr><tr><td>viales de vidrio de 27,25x70mm</td><td>FisherBrand</td><td>03-339-22K</td><td></td></tr><tr><td>Breathe Membranas de placa más fáciles</td><td>Midwest Scientific</td><td>BERM-2000</td><td></td></tr><tr><td>Toallitas con alcohol</td><td>Biotech diversificado</td><td>BPWP-1000</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora agitadora de calentador</td><td>Benchmark, Incu-Shaker Mini</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotador de tubo analógico</td><td>SoCal BioMed, LLC</td><td>82422001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de preparación de muestras asistido por filtro</td><td>FASP; Expedeon</td><td>44250</td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas</td><td>Biotek, Congelador EPOCH-20</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>grados Celsius</td><td>Fisher Congelador</td> de <td>13986149-80</td><td></td></tr> <tr><td>grados Celsius</td><td>Stirling Ultracold</td><td>SU78OUE</td><td></td></tr><tr><td>Q-Exactive espectrómetro de masas con trampa de iones</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 7890A acoplado a un solo cuadrupolo Espectrómetro de masas 5975C</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap Velo</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema NanoEquityTM UPLC de Waters</td><td>Millford, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Botella de medios de 250 ml</td><td>FisherBrand</td><td>1395-250</td><td></td></tr><tr><td>Waters</td><td>vial de Waters 186002805</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass MS vial de muestra e insertos MicroSolv</td><td></td><td>9502S-WCV, 9502S-02ND</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio Frasco de HPLC y tapones a presión</td><td>MicroSolv</td><td>9512C-0DCV, 9502C-10C-B</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos de HPLC</td><td>Agilent</td><td>5042-6454</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidrio grande 27.25x70mm</td><td>FisherBrand</td><td>03-339-22K</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>Labconco</td><td>7934021</td><td></td></tr><tr><td>Espátula de cabeza plana de acero inoxidable pulido</td><td>Spoonula; Toallitas FisherBrand</td><td>14-375-10</td><td></td></tr><tr><td>Kim</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34721</td><td></td></tr><tr><td>XBridge C18, 250x4,6 mm, 5 &mu; M con columna de protección de 4,6x20 mm</td><td>Waters</td><td>186003117, 186003064</td><td></td></tr><tr><td>sistema de HPLC de la serie Agilent 1100</td> Tubo de centrífuga <td>Agilent</td><td>Technologies G1380-90000</td><td></td></tr><tr><td>de 1,7 ml</td><td>Sorenson</td><td>11700</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton jeringas de vidrio, 5 ml, 50 y micro; L y 250&micro; L</td><td>Hamilton</td><td>81517, 80975, 81175</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur</td><td>FisherBrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Bombillas de pipeta Pasteur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z111597</td><td></td></tr><tr><td>baño Sonicator</td><td>Branson 1800 Limpiador</td><td></td><td></td>ultrasónico</tr><tr><td>Centrífuga de vacío</td><td>Labconco Centrivap Sistema concentrador resistente a los</td><td></td><td></td>ácidos</tr><tr><td>MicroSpin Columnas, C18 Sílice</td><td>El Grupo Nido</td><td>SEM SS18V</td><td></td></tr></tbody></table>

el protocolo mplex para multi-omic análisis de muestras de suelo

The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples

Espectrometría de masas (MS)-base metaproteomic integrado, metabolómicos y lipidómicos (multi-omic) estudios están transformando nuestra capacidad de comprender y caracterizar las comunidades microbianas en sistemas ambientales y biológicos. Estas mediciones están permitiendo incluso mejorados análisis de comunidades microbianas de suelo complejas, que son los más complejos sistemas microbianos conocidos hasta la fecha. Análisis multi-omic, sin embargo, tienen problemas de preparación de muestra, puesto que típicamente son necesarias extracciones separadas para cada estudio de omic, así grandemente ampliando el tiempo de preparación y cantidad de muestra necesaria. Para solucionar esta limitación, un 3 en 1 método para la extracción simultánea de metabolitos, proteínas y lípidos (MPLEx) de la misma muestra de suelo fue creado mediante la adaptación de un enfoque basado en solvente. Este protocolo MPLEx ha demostrado para ser sencilla y robusta para muchos tipos de muestras, incluso cuando se utilizan para cantidades limitadas de muestras complejas. El método MPLEx también permitió la medición rápida multi-omic necesaria para obtener una mejor comprensión de los miembros de cada comunidad microbiana, mientras que la evaluación de los cambios ocurridos en las perturbaciones biológicas y ambientales.

Cuando se utiliza el protocolo MPLEx para extraer moléculas de suelo de pradera nativa de Kansas (un suelo Mollisol), los análisis por triplicado previeron resultados 3376 péptidos, 105 lípidos y 102 metabolitos polares (todas las identificaciones únicas). Mientras que el protocolo MPLEx ha sido bien establecido para la extracción general de lípidos y metabolitos12,13,14,<sup class="xr...

Un protocolo se presenta de forma simultánea extracción de metabolitos, proteínas y lípidos en una muestra de suelo solo, permitiendo tiempos de preparación de muestra reducida y multi-omic análisis de espectrometría de masas de las muestras con cantidades limitadas.

El protocolo MPLEx para Multi-omic análisis de muestras de suelo

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and ...

Este método se utiliza en los campos de la proteómica, la metabolómica y la lipidómica al ayudar a obtener información completa sobre los cambios moleculares que tienen lugar en las comunidades microbianas asociadas al suelo debido a las perturbaciones ambientales. La principal ventaja de esta técnica es que la obtención de múltiples analitos a partir de una sola muestra de suelo aumenta la precisión y la exactitud, al tiempo que disminuye el tiempo y el esfuerzo de preparación de la muestra. Para empezar, por cada muestra de suelo de 20 gramos, pese 10 gramos en dos tubos separados de metanol/cloroformo de 50 mililitros.Utilice tubos de plástico hechos de PTFE, ya que el cloroformo lixiviará la mayoría de los plásticos, contaminando las muestras. Agregue aproximadamente 10 mililitros de acero inoxidable lavado con cloroformo y cuentas de granate a cada tubo. Luego, mientras está en hielo, agregue cuatro mililitros de agua ultrapura fría a cada tubo y transfiera las muestras en un balde de hielo a una campana extractora.Con una pipeta serológica de vidrio de 25 mililitros, agregue rápidamente 20 mililitros de cloroformo helado de dos a un volumen de metanol a los tubos. Apriete las

the-mplex-protocol-for-multi-omic-analyses-of-soil-samples

Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

Se describe un método multiplex para la detección de microorganismos en una muestra utilizando oligonucleótidos junto perlas fluorescentes. Amplificación de todos los organismos dentro de una muestra se hibridó con un panel de cuentas, junto sonda. Un instrumento Luminex o Bio-Plex se utiliza para consultar cada cuenta para el tipo de cuentas y la señal de hibridación.

Multiplex detección de bacterias en el complejo de muestras clínicas y ambientales utilizando oligonucleótidos de acoplamiento de microesferas fluorescentes

ácidos grasos de fosfolípidos proporcionan información sobre la estructura de las comunidades microbianas del suelo. Presentamos métodos para la extracción de muestras de suelo con una mezcla de fase única de cloroformo, el fraccionamiento de los lípidos extraídos usando columnas de extracción en fase sólida, y metanolisis para producir ésteres metílicos de ácidos grasos, que se analizan por cromatografía de gases capilar.

Extracción y análisis de ácidos grasos de fosfolípidos microbiana en suelos

Este estudio presenta un método de excavación para la investigación hidrológica subterránea, geoquímica, y la heterogeneidad microbiológica de un lisímetro suelo. El lisímetro simula una ladera artificial que era inicialmente bajo condición homogénea y se había sometido a aproximadamente 5000 mm de agua durante ocho ciclos de riego en un período de 18 meses.

Lisímetro suelo de excavación para acoplados hidrológicos, geoquímicos, e investigaciones microbiológicas

El artículo describe un método que incrementa el rendimiento mientras se equilibra el esfuerzo y precisión para la extracción de lípidos de las membranas celulares de los microorganismos para su uso en la caracterización tanto de los lípidos totales como de la abundancia relativa de los lípidos indicadores para determinar la estructura microbiana comunitaria en estudios con muchas muestras.

Un método de extracción y análisis de lípidos para caracterizar los microbios del suelo en experimentos con muchas muestras

Nanopore technology para secuenciación de biomoléculas tiene amplias aplicaciones en Ciencias de la vida, incluyendo la identificación de patógenos, supervisión de la seguridad del alimento, análisis genomic, metagenomic monitoreo ambiental y caracterización de bacterias resistencia a los antibióticos. En este artículo, el procedimiento de secuenciación de ADN de suelo de metagenómica para identificación de especies utilizando la tecnología de secuenciación nanopore es demostrado.

Secuencia de la DNA Nanopore para análisis de metagenómica suelo

Aquí, describimos un protocolo para obtener datos de la secuencia del amplicón del suelo, rizosfera y raíz endosphere microbiomes. Esta información puede utilizarse para investigar la composición y diversidad de las comunidades microbianas asociadas de planta y es conveniente para el uso con una amplia gama de especies de plantas.

Explorar el microbioma de la raíz: extracción de datos de la comunidad bacteriana del suelo, rizosfera y raíz Endosphere

Identificación de variantes genéticas que contribuyen a enfermedades humanas complejas nos permite identificar nuevos mecanismos. Aquí, demostramos un enfoque genotyping multiplex para genes candidatos o análisis de la vía genética que maximiza la cobertura a bajo costo y es favorable a los estudios de cohorte.

Genes candidatos en estudios de cohorte clínica con genotipificación multiplexado y espectrometría de masas

Excavación de raíces de las plantas del campo, así como procesamiento de muestras en endosphere, rizosfera y suelo se describen en detalle, incluyendo métodos de análisis de datos y extracción de ADN. Este documento está diseñado para permitir a otros laboratorios a utilizar estas técnicas para el estudio del suelo, endosphere y microbiomes de la rizosfera.

Aislamiento y análisis de comunidades microbianas en el suelo, rizosfera y raíces en los experimentos de pastos perennes

Este protocolo describe un rendimiento único para técnicas complementarias analíticas y ómicas que culmina en una caracterización totalmente emparejado de materia orgánica natural y proteómica microbiana en diferentes ecosistemas. Este enfoque permite comparaciones robustas para la identificación de rutas metabólicas y transformaciones importantes para describir la producción de gas de efecto invernadero y predecir las respuestas al cambio ambiental.

Técnicas analíticas de alta resolución complementarias solo rendimiento para caracterizar mezclas complejas de materia orgánica Natural

Este protocolo es un método eficaz y rápido de cultivo de levaduras y el moho Aspergillus fumigatus a partir de grandes conjuntos de muestras de suelo en tan solo 7 días. Los métodos se pueden modificar fácilmente para acomodar una variedad de medios de incubación y temperaturas según sea necesario para los experimentos.

Aislamiento de levaduras y mohos cultivables de los suelos para investigar la estructura de la población de hongos

Aprenda el protocolo MPLEx para extraer metabolitos, proteínas y lípidos de una sola muestra de suelo. Este método mejora la precisión y reduce el tiempo de preparación en estudios multi-ómicos de microbiología ambiental.

El protocolo MPLEx para Multi-omic análisis de muestras de suelo

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