El protocolo MPLEx para Multi-omic análisis de muestras de suelo

Este método se utiliza en los campos de la proteómica, la metabolómica y la lipidómica al ayudar a obtener información completa sobre los cambios moleculares que tienen lugar en las comunidades microbianas asociadas al suelo debido a las perturbaciones ambientales. La principal ventaja de esta técnica es que la obtención de múltiples analitos a partir de una sola muestra de suelo aumenta la precisión y la exactitud, al tiempo que disminuye el tiempo y el esfuerzo de preparación de la muestra. Para empezar, por cada muestra de suelo de 20 gramos, pese 10 gramos en dos tubos separados de metanol/cloroformo de 50 mililitros.

Utilice tubos de plástico hechos de PTFE, ya que el cloroformo lixiviará la mayoría de los plásticos, contaminando las muestras. Agregue aproximadamente 10 mililitros de acero inoxidable lavado con cloroformo y cuentas de granate a cada tubo. Luego, mientras está en hielo, agregue cuatro mililitros de agua ultrapura fría a cada tubo y transfiera las muestras en un balde de hielo a una campana extractora.

Con una pipeta serológica de vidrio de 25 mililitros, agregue rápidamente 20 mililitros de cloroformo helado de dos a un volumen de metanol a los tubos. Apriete las tapas y convierta la mezcla de tierra en la solución. El cloroformo-metanol ayuda a descomponer la pared celular de los procariotas y también inactiva las actividades enzimáticas.

A continuación, conecte los tubos a los accesorios de vórtice de tubos de 50 mililitros y pórtice horizontalmente durante 10 minutos a cuatro grados centígrados dentro de un refrigerador si es posible. Luego, coloque las muestras dentro de un congelador a 80 grados centígrados negativos durante aproximadamente 15 minutos para enfriarlas por completo. Luego, usando un sonicador de sonda dentro de una campana de gases, sonique cada muestra con una sonda de seis milímetros y 1/4 de pulgada al 60% de amplitud durante 30 segundos en hielo.

Después de la sonicación, coloque las muestras en un congelador a 80 grados centígrados negativos, ya que la sonicación puede generar mucho calor. Después de repetir los pasos de vórtice horizontal, sonicación y congelación, centrifugar las muestras a 4.000 veces la gravedad y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. En este punto, la muestra se separará en la capa superior de metabolitos, la capa intermedia de proteínas y la capa lipídica inferior.

Coloque las muestras en hielo. A continuación, dentro de una campana extractora, utilice una pipeta serológica de vidrio de 10 mililitros para transferir las capas superiores de metabolitos de los dos tubos de 50 mililitros a un vial de vidrio grande. Ahora, incline ligeramente el tubo de 50 mililitros para liberar la capa intermedia de proteínas de modo que flote libremente sobre la capa lipídica inferior.

Luego, con una espátula de laboratorio limpia de acero inoxidable de cabeza plana, saque con cuidado ambas capas intermedias de proteínas y colóquelas juntas en un nuevo tubo de 50 mililitros. Con una pipeta serológica de vidrio de 25 mililitros, transfiera las capas lipídicas inferiores a un vial de vidrio grande. Agregue 20 mililitros de metanol helado a los dos tubos con residuos y al tubo con la capa intermedia de proteínas.

Agite brevemente los tubos y centrifugue los gránulos de escombros y la capa intermedia de proteínas a 4.000 veces la gravedad y cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Luego, decantar el metanol en un contenedor de desechos peligrosos dentro de una campana extractora. Congele las proteínas y los gránulos de residuos en nitrógeno líquido y séquelos en un liofilizador durante unas dos horas.

Agregue 20 mililitros de tampón de solubilización de proteínas en tampón tris de 50 milimolares, pH 8.0, a cada uno de los gránulos de desechos y 10 mililitros al tubo de la capa intermedia de proteínas. En la campana extractora, sonda sonique las muestras al 20% de amplitud durante 30 segundos para llevarlas a la solución. Agite las muestras durante dos minutos.

A continuación, coloque la muestra de la capa intermedia de proteínas en un rotador de tubos de laboratorio a 50 grados centígrados durante 30 minutos para solubilizar la proteína. Agite horizontalmente las muestras de escombros durante 10 minutos adicionales para lisar las células intactas restantes. A continuación, rotar con las muestras de la capa intermedia de proteínas durante los 20 minutos restantes.

Centrifugar todas las muestras a 4.500 veces la gravedad a temperatura ambiente durante 10 minutos y recoger el sobrenadante de cada tubo por muestra en dos tubos de 50 mililitros. Agregue 10 mililitros de tampón de solubilización al pellet de la capa intermedia de proteínas. A continuación, sonicate y haz un vórtice de la pellet para que vuelva a la solución.

Después de la centrifugación, combine igualmente los sobrenadantes en los dos tubos de 50 mililitros con los sobrenadantes de pellets de escombros y centrifugue los tubos en un rotor de cubo de ángulo fijo a 8.000 veces la gravedad y cuatro grados Celsius durante 10 minutos para pellets cualquier residuo restante. Divide los sobrenadantes en dos tubos de 50 mililitros. A continuación, con una pipeta serológica de vidrio de 10 mililitros, añada 7,5 mililitros de TCA a cada tubo.

Convierte las muestras en un vórtice en solución. Luego, coloque las muestras en un congelador a 20 grados centígrados negativos durante dos horas o toda la noche. Para granular la proteína precipitada, centrifugar la muestra a 4.500 veces la gravedad y cuatro grados Celsius durante 10 minutos, y decantar el sobrenadante en residuos.

Agregue 10 mililitros de acetona 100% helada a cada gránulo de proteína. Agita los tubos y combínalos como gránulos en un solo tubo. Centrifugar y luego decantar la acetona.

Con un volumen menor de acetona, lave el pellet dos veces y transfiera la suspensión a un tubo de 1,5 o dos mililitros para el centrifugado final. Decantar el sobrenadante hasta convertirlo en residuos y dejar que el pellet se seque invertido en una toallita de papel en una campana extractora durante aproximadamente 20 minutos. Dependiendo del tamaño del pellet, agregue de 100 a 200 microlitros del tampón de solubilización de proteínas.

Sonicar y convertir el pellet en solución. Tenga en cuenta que la muestra puede ser viscosa debido a las sustancias húmicas que precipitan junto con la proteína, que se eliminarán con una centrifugación posterior. Finalmente, agite la muestra en una incubadora o agitador a 300 rpm y 40 grados Celsius durante 30 minutos, para solubilizar la proteína en solución antes de proceder a la digestión de la proteína o a la congelación instantánea para su procesamiento futuro.

Utilizando el protocolo MPLEx demostrado en este video, se extrajeron 3.376 péptidos, 105 lípidos y 102 metabolitos polares del suelo de las praderas nativas de Kansas, y la extracción de proteínas del protocolo se compara con los kits de extracción de proteínas y las extracciones SDS que utilizan LC-MS/MS de fase inversa. Al comparar inicialmente tres réplicas del kit comercial de extracción de proteínas y los métodos SDS, solo el 12% de los péptidos se superponían entre las dos técnicas, lo que demuestra la complejidad de la comunidad microbiana y los diferentes efectos de extracción. Al comparar MPLEx con un kit comercial de extracción de proteínas y extractos de SDS, alrededor del 38% de los péptidos observados con el método MPLEx también se detectaron cuando se utilizaron las extracciones de SDS y/o kits comerciales.

Teniendo en cuenta el número de especies en la comunidad bacteriana del suelo de Kansas y su metagenoma, la superposición de las identificaciones de péptidos es razonable. Como se muestra aquí, la amplia aplicabilidad del enfoque MPLEx se ha evaluado previamente utilizando la arquea S. acidocaldarius, un consorcio unicianobacteriano, tejido de la corteza cerebral de ratón, orina humana y hojas de A. thaliana. En todos los casos, el número de proteínas observadas con el método MPLEx fue similar al de los controles, lo que indica su utilidad para muchos tipos de muestras diferentes.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener proteínas, metabolitos y lípidos de una sola muestra de suelo. Al intentar este procedimiento, es importante ser flexible, ya que todos los tipos de suelo son diferentes. Por ejemplo, el tamaño de la capa intermedia de proteínas variará en función de la biomasa del suelo y de las sustancias húmicas presentes en el suelo.

No olvide que trabajar con cloroformo puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como trabajar en una campana extractora al intentar este procedimiento.