Utilizando mediada por la transferasa Terminal dUTP Nick End-etiquetado (TUNEL) y caspasas 3/7 ensayos a muerte celular epidérmica, medida en ranas con la quitridiomicosis
16 de mayo de 2018
Cuantificar la muerte celular epidérmica en ranas con quitridiomicosis usando dos métodos. En primer lugar, utilizamos terminal transferasa-mediated dUTP nick etiquetado final (TUNEL) en situ histología para determinar las diferencias entre animales clínicamente infectados y no infectados. En segundo lugar, llevamos a cabo un análisis de series temporales de la apoptosis sobre la infección usando un análisis de la proteína caspasa 3/7.
El objetivo general de este experimento es observar el efecto del patógeno fúngico anfibio batrachochytrium dendrobatidis sobre la apoptosis y la muerte celular en el tejido epidérmico de ranas. Este método puede ayudarnos a comprender las enfermedades de la fauna silvestre, por ejemplo, si la infección causa la muerte celular o, por el contrario, si existen mecanismos inmunológicos contra la infección. La principal ventaja de esta técnica es que se puede realizar en muestras de biopsia de tejido pequeño, de modo que se pueden muestrear repetidamente individuos pequeños durante el curso de la infección.
Para comenzar este procedimiento, prepare portaobjetos de vidrio hidrófilo con tejido de muestra como se describe en el protocolo de texto. Para desparafinar las secciones de tejido, lave los portaobjetos tres veces con xileno durante cinco minutos cada uno en un frasco de coplin. A continuación, lave los portaobjetos con etanol al 100% dos veces durante cinco minutos cada una.
Después de esto, lave los portaobjetos con 95% de etanol y 70% de etanol durante tres minutos cada uno. Luego, lave los portaobjetos una vez con PBS durante cinco minutos. Para preparar portaobjetos experimentales y de control negativo, se debe pretratar el tejido añadiendo proteinasa K recién diluida directamente a los portaobjetos.
Incuba los portaobjetos durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego, lave los portaobjetos en PBS dos veces durante dos minutos cada uno. Para preparar portaobjetos de control positivo, pretrate el tejido con tampón DN y luego incube los portaobjetos a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Después de esto, disuelva la DNasa uno en tampón DN hasta una concentración final de 0,1 microgramos por mililitro. Agregue la solución de DNasa preparada a los portaobjetos. Incuba los portaobjetos durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Luego, lave los portaobjetos con agua destilada en un frasco de coplin cinco veces durante tres minutos cada uno. Apague la reacción en peróxido de hidrógeno al 3% en PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave los portaobjetos en PBS dos veces durante dos minutos cada uno.
A continuación, añada un tampón de equilibrio al tejido de los portaobjetos. Incubar durante 10 segundos a temperatura ambiente. Luego, retira el exceso de líquido alrededor de la sección de tejido.
Enzima desoxinucleotidil transferasa terminal diluida en tampón de reacción. Luego, agréguelo al tejido en los portaobjetos experimentales y de control positivo. Incubar en una cámara humidificada durante una hora a 37 grados centígrados.
Después de esto, coloque los portaobjetos en un frasco de coplin que contenga la concentración de trabajo del tampón de parada. Agite durante 15 segundos y luego incube los portaobjetos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego, lave los portaobjetos con PBS tres veces durante un minuto cada una y retire el exceso de líquido.
A continuación, agregue el conjugado anti-digoxigenina, precalentado a temperatura ambiente, directamente sobre el tejido. Incube los portaobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente en una cámara oscura humidificada. Una vez completada la incubación, lave los portaobjetos con PBS cuatro veces durante dos minutos cada uno.
Retira el exceso de líquido. Luego, agregue medio de montaje a las guías. Agregue 15 microlitros de solución DAPI al medio de montaje en los portaobjetos.
Cubra cada portaobjetos con un cubreobjetos y séllelo con esmalte de uñas. Deje que los portaobjetos se sequen en la oscuridad. Usando un microscopio fluorescente, observe los portaobjetos inmediatamente después de completar el proceso de colocación.
Tome fotos 400 veces a intervalos aleatorios a lo largo de cada sección de la piel. Cuente los glóbulos azules teñidos con DAPI para asegurarse de que al menos 100 células por sección de piel por animal sean visibles. A continuación, cuente el número de células TUNEL-positivas que aparecen como células individuales rojas con bordes de celda claros.
Para comenzar, use un microscopio de luz invertida 40 veces para tomar una foto de cada uno de los dedos de la rana. Dibuja líneas alrededor del borde de la pinza del dedo del pie y usa un software de imágenes para estimar el área dentro de la forma. Para evaluar el área superficial de la muestra de piel tridimensional, multiplique el área estimada por pi.
Para extraer proteínas de una muestra congelada de dedo de rana, coloque la muestra en un tubo de microcentrífuga con tapón de rosca de 1,5 mililitros que contenga 100 microlitros de tampón de muestra y dos perlas de acero inoxidable. Utilice un batidor de cuentas a máxima velocidad para lisar las células. Después de esto, coloque el tubo en hielo durante tres minutos.
Luego, centrifuga el tubo para recoger el sobrenadante. Para realizar el ensayo de caspasa 3/7 en una placa de 384 pocillos, agregue 10 microlitros de tampón de muestra en blanco y 10 microlitros de extracto de proteína por triplicado. A continuación, pipetee 10 microlitros de reactivo de caspasa 3/7 disponible en el mercado en el extracto proteico y en los pocillos en blanco.
A continuación, agite la placa suavemente durante 15 segundos para mezclar los dos reactivos. Incubar a temperatura ambiente en oscuridad durante 30 minutos. Por último, utilice un lector de placas luminiscentes para medir la luminiscencia de la muestra.
En este estudio, los animales infectados muestran significativamente más células TUNEL-positivas en comparación con los animales de control, como lo ilustran las células teñidas de rojo o rosa. En los animales control, hay pocas células TUNEL-positivas, y no se concentran en la epidermis. En los animales infectados, las células TUNEL-positivas son más frecuentes en la epidermis.
Las células TUNEL positivas están más concentradas en las imágenes de las células infectadas y directamente adyacentes a ellas. Además, hay células TUNEL-positivas más extendidas sobre la epidermis y en las capas epidérmicas que son más profundas que donde residía el patógeno fúngico. En los animales infectados, hay más células TUNEL-positivas en los tres tipos de piel, con un nivel particularmente alto en la piel del muslo y del ventral.
En el ensayo de caspasas, la intensidad de la infección se correlaciona positivamente con la actividad de la caspasa 3/7. Además, la actividad de la caspasa 3/7 en animales infectados y no infectados difirió con el tiempo. La actividad de la caspasa 3/7 disminuyó en las primeras semanas después de la inoculación y luego aumentó hacia el final de la séptima semana en animales infectados.
La actividad de la caspasa 3/7 se mantuvo constante en individuos no infectados. Al intentar el procedimiento para el ensayo TUNEL, es importante leer los portaobjetos el mismo día del ensayo para evitar la pérdida de sensibilidad y mantener los portaobjetos en un lugar fresco y oscuro para proteger los tintes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo detectar la apoptosis y la muerte celular utilizando dos métodos de detección diferentes en muestras de tejido pequeñas como la piel de anfibio.
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Descripción general
Este estudio investiga el impacto del patógeno fúngico de los anfibios Batrachochytrium dendrobatidis en la apoptosis y la muerte celular en el tejido epidérmico de las ranas. Mediante el uso de histología in situ TUNEL y análisis de proteínas caspasa 3/7, la investigación busca esclarecer la relación entre la infección y la muerte celular.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Enfermedad silvestre
- Biología celular
Antecedentes
- La quitridiomicosis representa una amenaza importante para las poblaciones de anfibios.
- Comprender los mecanismos de muerte celular puede orientar los esfuerzos de conservación.
- La apoptosis podría desempeñar un papel en la respuesta a las infecciones fúngicas.
- Muestras pequeñas de tejido permiten análisis repetidos a lo largo de la infección.
Objetivo del estudio
- Cuantificar la muerte celular epidérmica en ranas infectadas con quitridiomicosis.
- Determinar las diferencias en apoptosis entre ranas infectadas y no infectadas.
- Analizar el curso temporal de la apoptosis durante la infección.
Métodos Utilizados
- Etiquetado de extremos de rotura con dUTP mediado por transferasa terminal (TUNEL) para análisis histológico.
- Análisis de proteínas caspasa 3/7 para evaluación en series temporales.
- Preparación de portaobjetos de vidrio hidrófilos con muestras de tejido.
- Desparafinización de secciones de tejido mediante lavados con xileno y etanol.
Resultados principales
- Se observaron diferencias en las tasas de apoptosis entre ranas infectadas y no infectadas.
- El análisis de series temporales reveló tendencias en la muerte celular durante el curso de la infección.
- Los métodos demostraron ser efectivos para analizar muestras pequeñas de tejido.
- Los conocimientos obtenidos podrían contribuir a comprender las respuestas inmunitarias frente a la infección.
Conclusiones
- El estudio proporciona datos valiosos sobre los efectos de la quitridiomicosis en las células epidérmicas de las ranas.
- Comprender la apoptosis en este contexto podría ayudar en las estrategias de conservación de la vida silvestre.
- Investigaciones futuras podrían explorar los mecanismos inmunitarios contra las infecciones fúngicas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este estudio demuestra cómo los ensayos de apoptosis pueden utilizarse para evaluar el daño tisular inducido por patógenos en modelos de enfermedades silvestres, proporcionando un marco para la reducción mecanicista de riesgos en la validación temprana de dianas. Al cuantificar la muerte celular epidérmica en ranas infectadas con Batrachochytrium dendrobatidis, este enfoque fortalece la confianza predictiva al evaluar las interacciones huésped-patógeno e impulsa el descubrimiento de biomarcadores traslacionales. El uso de biopsias tisulares pequeñas permite muestreos longitudinales, lo cual es fundamental para rastrear la progresión de la enfermedad y la intervención terapéutica en sistemas preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas al distinguir la apoptosis inducida por el patógeno de los mecanismos de defensa del huésped en el tejido epitelial.
- Valor operativo: Proporciona datos espacialmente resueltos sobre la muerte celular mediante tinción TUNEL para aclarar los mecanismos de alteración tisular en modelos de enfermedades infecciosas.
- Valor predictivo: Refuerza la confianza en el blanco al correlacionar la actividad de las caspasas 3/7 con la carga de infección a lo largo del tiempo, permitiendo perfiles de dosis-respuesta y análisis temporales.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Valor científico: Establece protocolos estandarizados para la detección de apoptosis en muestras de tejido pequeñas, lo que permite cribados reproductibles de compuestos en condiciones con material limitado.
- Valor operativo: El ensayo de caspasa 3/7 ofrece compatibilidad con alto rendimiento para experimentos de curso temporal, mientras que TUNEL proporciona validación de los patrones espaciales de apoptosis.
- Preparación del ensayo: La microscopía fluorescente y las lecturas luminiscentes generan resultados cuantitativos adecuados para la optimización del ensayo y la reproductibilidad entre laboratorios.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Relaciona la apoptosis epidermal con la gravedad de la enfermedad, apoyando la alineación de biomarcadores entre lecturas moleculares y la progresión clínica de la infección.
- Valor operativo: Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante el seguimiento de la dinámica de las caspasas 3/7 a lo largo de las etapas de la infección en estudios longitudinales.
- Continuidad traslacional: Demuestra cómo pueden combinarse ensayos histológicos y bioquímicos de apoptosis para fortalecer la validez preclínica en modelos de enfermedades infecciosas.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar lecturas de apoptosis que informan la validación de objetivos y la identificación de compuestos prometedores, particularmente en estudios donde la accesibilidad del tejido limita la histología convencional.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis sobre si la exposición al patógeno induce o suprime la apoptosis en el tejido hospedador, aclarando los mecanismos de daño tisular.
- Selección: El ensayo de caspasa 3/7 permite la selección cuantitativa y escalable de moduladores que afectan la apoptosis en muestras pequeñas de biopsia.
- Análisis: Las señales luminiscentes y fluorescentes proporcionan mediciones cuantificables y normalizadas para comparar la apoptosis entre diferentes condiciones y puntos temporales.
- Investigación Traducional: Correlaciona la actividad molecular de la apoptosis con cambios histopatológicos, apoyando la validación de biomarcadores en modelos preclínicos.
- Reutilización Empresarial: El enfoque combinado de TUNEL y caspasa 3/7 establece una plataforma reutilizable de perfilado de apoptosis para estudios de enfermedades infecciosas y toxicología.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al distinguir la localización y la cinética de la apoptosis en tejidos infectados frente a tejidos de control.
- Valor operativo: Protocolos estandarizados de preparación de portaobjetos e imágenes garantizan la reproducibilidad entre laboratorios y lotes de muestras.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones tempranas de avance o interrupción al proporcionar biomarcadores precoces del estrés tisular y el impacto del patógeno.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización basada en riesgos de objetivos al cuantificar la apoptosis como una lectura funcional del mecanismo de la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en histología, microscopía de fluorescencia y extracción de proteínas a partir de muestras de tejido limitadas.
- Depende del acceso a un criostato, microscopio fluorescente y lector de placas luminiscentes para los ensayos TUNEL y caspasa 3/7.
- Exige la estandarización entre usuarios en el corte de tejidos, el tiempo de tinción y los ajustes de imagen para mantener la sensibilidad del ensayo.
- La adaptación a otros sistemas modelo requiere la validación de la penetración de anticuerpos y la accesibilidad de enzimas en diferentes tipos de tejidos.
- Limitación práctica: las biopsias pequeñas de la punta del dedo del pie restringen el rendimiento de proteína, lo que exige métodos alternativos de normalización, como la estimación del área de superficie cutánea mediante imágenes, para evitar el consumo del extracto.
