Name: Utilizando mediada por la transferasa Terminal dUTP Nick End-etiquetado (TUNEL) y caspasas 3/7 ensayos a muerte celular epidérmica, medida en ranas con la quitridiomicosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Aprende a detectar apoptosis en tejido epidérmico de ranas infectadas con quitridiomicosis usando TUNEL y ensayos de caspasas 3/7. Este método permite analizar muestras pequeñas de biopsia repetidamente.

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Agradecemos a las siguientes personas que ayudaron con cría y recogida de datos: Tegtmeier D. C. De Jong, J. Hawkes, K. Fossen, Percival S., M. McWilliams, L. Bertola, M. Stewart, Harney N. y T. Knavel; y M. Merces ayuda con disecciones. También nos gustaría agradecer a M. McFadden, P. Harlow y Taronga Zoo para aumentar la L. v. alpinay G. Marantelli para levantar los p. corroboree. Agradecemos a F. Pasmans, A. Martel para asesoramiento en ensayos de apoptosis, Constantino C., Kladnik A. y R. Webb ayuda con ensayo TUNEL, y Emeto T. y W. Weßels para ayudan con el protocolo y kit para análisis de caspasas 3/7. Este manuscrito y el protocolo se ha adaptado de Brannelly et al 2017 Peer J22.

Universidad James Cook aprobó ética animal en aplicaciones A1875 para p. corroboree y A1897 y A2171 L. v. alpina.
1. cría de animales y control de
<ol><li>Animales de la casa individualmente, en un ambiente apropiado para la especie, con un agua apropiada, alimentación y limpieza horario. Revise diariamente los animales.<ol>
<li>Individuos adultos de la críticamente amenazada Pseudophryne corroboree (para el ensayo TUNEL, sección 4) y el amenazado Litoria verreauxii alpina (para el análisis caspasas 3/7, sección 5), donados por cautivo instalaciones de cría. Mantener los animales en 15-18 ° C, sobre un musgo y grava sustrato niebla ellos diariamente con agua de ósmosis inversa y alimentar 3 veces semanalmente con grillos gut cargado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recoger los datos cada vez individual semanal. Esponja a los individuos para Bd , como se describe en el paso 2.1. Pesar cada animal a lo 0.1 g estaba usando una escala y medir su hocico para salida longitud de (SVL) a la más cercana 0,01 mm con pinzas de disco.</li>
	<li>Después de la inoculación (como se describe en la sección 3), ver animales diariamente para signos clínicos de infección (slough de piel irregulares, inapetencia, enrojecimiento de la pierna, letargia o retrasada righting reflex) conforme a las directrices de la ética animal. Eutanasia de animales si la morbilidad y los signos clínicos están presentes.<ol>
<li>Eutanasia con sobredosis de tricaine methanesulfonate (MS222) (0.1% w/v MS222 a pH 6-7 con bicarbonato de sodio de agua del grifo). Mantener animales MS222 para 10 minutos después de todo movimiento cesa y no mostrar respuesta a estímulos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. pruebas para la infección de la Bd
<ol><li>Vajillas para Bd
	<ol>
<li>Limpiar cada animal con un nuevo hisopo estéril de rayón (una esponja por animal). Utilice el siguiente método desmoldante: cinco veces en el vientre, cinco veces en cada muslo, lateral y extremidades. Se trata de un total de 45 movimientos.</li>
		<li>Gire suavemente la torunda durante y entre pasadas para asegurar la efectiva captura de ADN. Romper la punta del hisopo en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y almacenar a-20 ° C hasta la extracción.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extracción de ADN y análisis de qPCR<ol>
<li>Extraiga el ADN genómico de los hisopos por añadiendo 50 μl de un reactivo de extracción de ADN disponible en el mercado con 30-40 mg de perlas de sílice de 0,5 mm. Grano de golpe las muestras en un disruptor de células grano batidor a velocidad máxima durante 2 minutos. Tras el paso del grano de batidor, centrifugar las muestras a 2.000 x g durante 1 minuto.</li>
		<li>Incubar las muestras a 100 ° C durante 10 minutos y deje que se enfríe. Centrifugar las muestras a 5.000 x g durante 3 min y luego transferir el sobrenadante a tubos de centrífuga micro individual 1.5 mL y almacenar a-20 ° C hasta qPCR.</li>
		<li>Uso de PCR cuantitativa (qPCR) después de Boyle et al. 200418 para analizar la carga de la infección. Utilice las siguientes modificaciones:<ol>
<li>Diluir el DNA 6:100 de muestras de extracción con agua desionizada. Añadir 0,7 μl de albúmina de suero bovino (BSA) en cada pocillo para evitar la inhibición de la polimerización en cadena. Ejecute cada muestra en singlicate. En cada placa de utilizar un control negativo (sin plantilla) y un control positivo con una serie de normas de dilución para estimar la carga de la zoospora (infección).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. inoculación
<ol><li>Cultura Bd
	<ol>
<li>Para preparar cultivo caldo añadir 16 g de triptona, 2 g de hidrolizado de gelatina y 4 g de lactosa (TGHL) a 1 L de agua desionizada. Autoclave (121 ° C durante 40 min) y permita que el caldo se enfríe.</li>
		<li>Inocular la cepa de Bd (en este caso, aislado de Nueva Gales del sur aislado, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, pasaje número 11) en un caldo TGHL y crecer por 7 d a 23 ° C, y luego transferir el caldo de cultivo en placas de agar TGHL.</li>
		<li>Para hacer las placas, añadir 16 g de triptona, 2 g de hidrolizado de gelatina, 4 g de lactosa (TGHL) y 10 g de agar bacteriológico a 1 L de agua desionizada y autoclave (121 ° C durante 40 minutos). Una vez que la mezcla esté lo suficientemente fría como para tocar, pero antes de que se solidifica, vierta el agar TGHL 92 mm diámetro placas de cultura por lo que son 1/4 a 1/3 completo, en el gabinete de seguridad biológico una clase II.</li>
		<li>Cuando se haya solidificado el agar y haya enfriado por completo, inocule cada placa con 0,5 mL de Bd del caldo líquido y espárcelo de forma pareja. Permitir que la mezcla de caldo de Bd secar en placa por aproximadamente 1 h y luego sellar las placas con película de plástico de la parafina. Incubar con el agar hacia las placas abajo a 23 ° C durante 5-7 días.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placas de inundación para la solución de inoculación de zoospora<ol>
<li>Compruebe la movilidad de la zoospora bajo un microscopio de luz invertido para asegurar viabilidad diariamente antes de la inoculación. Cuando liberación de zoospora es alta, con muchas zoosporas nadar fuera de los esporangios, la cultura está lista para la inoculación.</li>
		<li>Inundación cada plato con 3 mL de agua del grifo o agua de los estanques artificiales, verter el agua en la placa y la incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos permitir que las zoosporas a liberar en el agua. Después de la incubación, decantar la suspensión de la zoospora en un recipiente estéril nuevo.</li>
		<li>Estimar la concentración de la zoospora siguiendo las instrucciones del fabricante utilizando un hemocitómetro. Una vez se conoce la concentración de la suspensión de la zoospora, diluir la suspensión a una concentración de 1 x 106 zoosporas por 3 mL de agua.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inocular a animales<ol>
<li>Inocular cada animal por verter 3 mL de mezcla de inóculo sobre su vientre19 en envases individuales de 50 mL. Permite exceso inóculo recoger en la base del envase de inoculación. Dejar cada animal en envase individual de inoculación durante 24 h para la infección y después de la inoculación de 24 h, volver a cada uno a un terrario desinfectado.<ol>
<li>Desinfectar el terrario con un 13% volumen/volumen (v/v) blanqueador comercial solución20, enjuagar al menos dos veces con agua, luego dejar para secar por no menos de 24 h.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para Bd-negativa controles, simulado inocular a los animales con los mismos métodos que en 3.2-3.3, pero inundaciones Bd-placas de agar libre con 5 mL de agua del grifo en lugar de Bd inocularon las placas de agar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. TUNEL ensayo
<ol><li>Eutanasia de animales que muestran signos clínicos de la quitridiomicosis, tal como se describe en el paso 1.3.1 y un número igual de Bd-negativo animales de control.</li>
	<li>Disecar la piel (dorsal, ventral y muslo) muestras de cada animal. Fijar las muestras de piel para 2 h de formaldehído al 4% v/v tamponada fosfato. Corto y constante de tiempo de fijación permiten que los tejidos a ser completamente fijo, sino que también permite para la tinción de inmunohistoquímica efectiva y precisa. Luego se transfieren a etanol al 80% hasta incrustar para seccionamiento.</li>
	<li>Incrustar la piel en la cera de parafina para preparación histológica siguiendo métodos estándar21. Brevemente, el protocolo es el siguiente:<ol>
<li>Deshidratar los tejidos en una serie gradual de etanol y claro el etanol con xileno. Incrustar el tejido en parafina y colocar todas las muestras de piel de tres para cada individuo en bloque de uno parafina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Piel de sección usando un micrótomo después de la preparación histológica estándar21. Sección del tejido en serie a 5 μm y luego fijar en portaobjetos de vidrio hidrofílico. Coloque cuatro histosections serie por tipo de piel por diapositiva. Realizar tres diapositivas por persona con secciones de piel serie, recuerda que cada diapositiva tiene cuatro secciones de cada tejido fijada.</li>
	<li>La mancha las diapositivas en el siguiente orden:<ol>
<li>La primera diapositiva se tiñen con hematoxilina seguida de eosina contratinción (H & E). Esta diapositiva es visualizar la ubicación de los esporangios de la Bd dentro de la piel.</li>
		<li>La segunda diapositiva después de un ensayo TUNEL comercialmente disponible para la preparación histológica de la mancha y siga las instrucciones del fabricante, que se describen a continuación.<ol>
<li>En primer lugar, Desparafinizar las secciones de tejido en un frasco de coplin por lavado de los portaobjetos con tres cambios de xileno durante 5 minutos por lavado y seguir con dos cambios de etanol al 100% durante 5 minutos cada lavado. Siga con un lavado de etanol al 95% por 3 min y etanol 70% durante 3 minutos acabado con un lavado de PBS durante 5 minutos.</li>
			<li>Prepare el tejido con la proteína recién diluida digerir la enzima (proteinasa K a una concentración de 20 μg/mL diluido en PBS) y añadir directamente a la diapositiva. Dejar para incubar durante 15 minutos de lavado con dos cambios de PBS en una jarra de coplin durante 2 minutos.</li>
			<li>Tap off el exceso de líquido y saciar en peróxido de hidrógeno de 3.0% en PBS en una jarra de coplin para 2 min a temperatura ambiente. Enjuague dos veces con PBS durante 5 minutos cada lavado.</li>
			<li>Toque del exceso de líquido y luego aplicar 75 μl/5 cm2 de la solución de equilibrio directamente sobre el tejido sobre el portaobjetos. Incube durante 10 s. Elimine el exceso de líquido alrededor de la sección y aplicar 55 μl/5 cm2 de trabajo terminal deoxynucleotidyl (TdT) de tranferase enzima. Incubar en una cámara humidificada durante 1 h a 37 ° C.</li>
			<li>Después de la incubación de la TdT, colocar la corredera en una jarra de coplin trabajo fuerza parada/tampón de lavado, agite por 15 s e incubar 10 min a temperatura ambiente. Lavar el portaobjetos con tres cambios de PBS durante 1 minuto por lavado. Tap off el exceso de líquido.</li>
			<li>Aplica el conjugado anti-digoxigenina (rodamina) que ha sido calentado a la temperatura en el tejido, 65 μl/5 cm2. Incubar en una cámara humidificada durante 30 min a temperatura ambiente y evitar la exposición a la luz. Lavar con cuatro cambios de PBS durante 2 min por lavado. Tap off el exceso de líquido.</li>
			<li>Acabado por añadir 15 μl de 0.5 - 1 μg/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) en medio de montaje de la diapositiva a la diapositiva, que actúa como un contador. Luego cubrir con un cubreobjetos y sellar con esmalte de uñas o pegamento de caucho. Permite transparencias secar en la oscuridad como el ensayo es sensible a la luz.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mancha la tercera diapositiva se tiñe usando el TUNEL análisis y contratinción DAPI, pero utilizar como control positivo y negativo para cada muestra. Nota: De los 4 histosections en el portaobjetos de control, los primeros 2 son repeticiones de control positivo y los 2 últimos son réplicas del control negativo.<ol>
<li>Para los controles positivos, en lugar de paso 4.5.2.2, tratamiento previo del tejido con tampón de DN (30mM trizma base, pH 7.2, 4mM de MgCl2, 0,1 DDT) y dejar incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego disolver DNasa I en DN del almacenador intermediario para una concentración final de 0.1ug / mL y aplicar directamente a la diapositiva. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.  Luego, lavar el portaobjetos con 5 lavado de dH2O 3 minutos cada lavado. Secar el líquido sobrante. Entonces reanudar el ensayo TUNEL como se indica en la sección 4.5.2.3.</li>
			<li>Para los controles negativos, no agregue el terminal deoxynucleotidyl (TdT) de tranferase enzima a las muestras (como se describe en la sección 4.5.2.4).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Observar diapositivas TUNEL inmediatamente después de terminar el ensayo.<ol>
<li>Tome fotos al azar intervalos a lo largo de cada sección de la piel en 200 X usando un microscopio de fluorescencia, utilizando filtros para ambos la mancha de la rodamina, que revela las células apoptóticas y aparece rojo y DAPI que revela todos los núcleos y aparece azul, para que un recubrimiento de las células se pueden generar. Asegurar por lo menos 100 células son fotografiadas por sección de la piel por ejemplo. Almacenar las diapositivas en una caja oscura microscopio a-20 ° C.</li>
		<li>Cuente las células (DAPI azul manchado) por imagen. Asegúrese de que se cuentan por lo menos 100 células por sección de la piel. Para llegar a 100 células, contar todas las celdas dentro de la imagen. Si menos 100 células están presentes en una imagen, cuenta otra imagen hasta alcanzaron por lo menos 100 células por sección de la piel por animal.</li>
		<li>Luego, cuente el número de células positivas TUNEL en las mismas imágenes (rojo rodamina tinción). Las células positivas TUNEL, que indican la apoptosis y la necrosis ni fondo, son las células con bordes de células claras (las membranas están intactas con no lisis). A veces las células se encogen a cuerpos apoptóticos de forma.</li>
		<li>Localizar las áreas en el ensayo TUNEL y analizar las regiones correspondientes en el H & E tinción de histosections. Confirmar que la H & E tinción de secciones corresponden a sitios de infección de la Bd , que asegura Bd-sitios infectados se utilizan cuando el recuento de células apoptóticas en el ensayo TUNEL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. caspasas 3/7 ensayo
<ol><li>Recoger sugerencias del dedo del pie de cada animal ( Bd- expuesto y Bd- negativo) una vez semanal a través de inoculación de post de la semana 3 y quincenalmente hasta el final del experimento, hasta los dedos del 8 pie por persona.<ol>
<li>Cortar la punta del dedo del pie en la segunda falange con una tijera esterilizada a la llama y colocar en un microtubo de 1.5 mL y congelar inmediatamente a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extracto de proteínas de la muestra congelada del dedo del pie.<ol>
<li>Coloque las muestras en 100 μl de sample buffer (25 mM HEPES de pH 7, 5 mM de MgCl2) con dos granos de acero inoxidable (3.2 mm) en un microtubo de 1.5 mL tapón de rosca. Lisar muestras por 4 ciclos de 1 min grano batiendo a velocidad máxima (en el mismo batidor de grano como paso en 1.2.1) seguida de 3 min sobre hielo. Después de lisis, centrifugar las muestras a 12.000 g y 4 ° C por 5 min recoger sobrenadante a utilizar en el ensayo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuantificar la concentración de proteína por muestra usando el ensayo de Bradford.<ol>
<li>En una placa bien 384, mezclar 10 μl de proteína extracto con 10 μl de reactivo de Bradford e incubar durante 2 min a temperatura ambiente. Realizar cada muestra por duplicado, junto con una serie de 5 doble estándares de dilución de BSA. Leer la absorbancia a 595 nm en un lector de absorbancia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Por otra parte, si las muestras de punta de los pies son demasiado pequeñas (la concentración de proteína es cerca el estándar más bajo determinado desde el ensayo de Bradford en paso 4.3.1, o si las ranas que son muestreadas son menores de 3 g de peso total), estandarizar las muestras por estimación de la superficie de la piel área con fotografías, en lugar del ensayo de Bradford.<ol>
<li>Antes de extraer las proteínas de la muestra para el ensayo de caspasa, fotografiar cada dedo con 40 aumentos con un microscopio de luz invertido.</li>
		<li>Analizar la muestra del dedo del pie, utilizando un equipo de proyección de imagen de software, por estimar el área del dedo del pie. Para ello, trazar una línea alrededor del borde del clip del dedo del pie y tener la proyección de imagen área de estimación de software dentro de la forma. Luego multiplica esa área por pi (3.14), que se aproximan a la superficie de la muestra de piel 3-dimentional (longitud x área de sección transversal (pi x diámetro) da la superficie exterior de un tubo).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar el ensayo de caspasas 3/7.<ol>
<li>En una placa de 384 luminiscencia bien, añadir 10 μl de reactivo comercialmente disponible caspasas 3/7 y 10 μl del extracto de la proteína. Ejecute cada muestra por triplicado.</li>
		<li>Mezcle los reactivos sacudiendo lentamente la placa para incubar s. 15 la placa lejos de la luz durante 30 min a temperatura ambiente. Luminescencia medida usando un lector de placas luminiscentes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+disinfectants+effective+against+the+amphibian+chytrid+fungus+Batrachochytrium+dendrobatidis%5BTitle%5D)+AND+%22Diseases+of+Aquatic+Organisms%22%5BJournal%5D)">Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).</li>
<li>Woods, A., Ellis, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWoods%2C+A+%22Laboratory+Histopathology%3A+A+Complete+Reference%22">Laboratory Histopathology: A Complete Reference</a>. , Churchill Livingstone: Edinburgh. (1994).</li>
<li>Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+cell+death+in+frogs+with+chytridiomycosis%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis.</a> PeerJ. 5, e2925(2017).</li>
</ol>

Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Exploramos epidérmico apoptosis y muerte celular como un mecanismo potencial de la patología de la quitridiomicosis enfermedad mortal o un mecanismo de resistencia a enfermedades en especies susceptibles de Bd . Se utilizaron dos métodos de evaluar la muerte celular en la epidermis, ensayo TUNEL en situ análisis de muerte celular epidérmica y caspasas 3/7 análisis para monitoreo de muerte de las células epidérmicas a lo largo de la evolución de la infección. Se encontró que la muerte celular y la apopto...

Anfibios están experimentando actualmente una las mayores pérdidas de la biodiversidad global de cualquier taxa vertebrados1. Una de las principales causas de estos descensos son la piel fatal enfermedad chytridiomycosis, causada por el hongo patógeno Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2. El patógeno infecta superficialmente la epidermis, que puede conducir a la alteración de la función de la piel resultando en pérdida del electrólito grave, paro cardiaco y muerte3. Varios mecanismos inmunes del huésped potencial contra Bd actualmente se están estudiando, tales como péptidos antimicrobianos4,5, de la flora bacteriana cutánea6, inmune de la célula receptores7,8, y actividad de linfocitos9,10. Sin embargo, pocos estudios explorarán si epidérmica apoptosis y muerte celular es un mecanismo inmune contra este patógeno mortal.
Muerte celular, ya sea a través de la apoptosis (muerte celular programada) o necrosis (muerte), en la epidermis puede ser una patología de la infección de la Bd . La investigación anterior sugiere que Bd infección puede inducir apoptosis debido a la interrupción de uniones intracelulares se observa cuando los explantes de piel están expuestos a zoospora sobrenadantes en vitro11. Además, cambios degenerativos epidérmicos en Bd-ranas infectadas se observan con microscopia electrónica12,13. Análisis transcriptómico indican que las vías de apoptosis son upregulated en piel infectada14y esplenocitos de anfibios sufren apoptosis cuando son expuestos a Bd sobrenadantes en vitro15. A pesar del creciente volumen de evidencia que sugiere que el Bd puede inducir apoptosis y anfitrión célula muerte en vitro, estudios en vivo que explorar o cuantificar apoptosis carecen de mecanismos a través de la progresión de la infección. Además, se desconoce si el host utiliza apoptosis como una estrategia defensiva inmune para luchar contra la infección de la Bd , o si la apoptosis es una patología de la enfermedad.
En este estudio, el objetivo fue detectar muerte celular epidérmica y apoptosis en animales infectados en vivo usando dos métodos: Análisis de la proteína caspasa 3/7 y terminal transferasa-mediated dUTP nick etiquetado final (TUNEL) en situ ensayo. Como cada ensayo detecta diferentes aspectos de la muerte de la célula16, juntos estos métodos proporcionan un completo entendimiento de los mecanismos implicados en la muerte celular y aseguran una medida exacta del efecto. El ensayo de caspasas 3/7 cuantifica la actividad de las caspasas efectoras 3 y 7, que permite la cuantificación de ambos las vías intrínseca y extrínseca de la apoptosis. En contraste, el ensayo TUNEL detecta la fragmentación del ADN, que es causada por mecanismos de muerte celular incluyendo apoptosis, necrosis y pyroptosis17. Utilizamos el ensayo TUNEL para investigar la situación de muerte celular en la epidermis de los animales clínicamente infectados y no infectados con tres secciones de piel diferentes: el dorso, el vientre y el muslo de Pseudophryne corroboree. Este método identifica el sitio anatómico de la muerte de la célula, como distinguiendo su ubicación dentro de capas epidérmicas específicas. Entonces utilizamos el análisis de caspasas 3/7 para llevar a cabo una cuantificación de la serie de tiempo de la apoptosis a través de una infección de 8 semanas en Litoria verreauxii alpina. Tomar muestras de punta de dedo del pie quincenal de los mismos animales y son capaces de correlacionar la carga de infección del patógeno con la actividad de caspasas 3/7.

<table><tbody><tr><td>POLARstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>Lector de placas luminiscentes</td></tr><tr><td>384 pocillos placa de fondo claro plano</td><td>Corning</td><td>3707</td><td></td></tr><tr><td>384 pozo brida baja blanca placa de fondo plano Corning</td><td></td><td>3570</td><td></td></tr><tr><td>Agar bacteriológico (Oxoid)</td><td>Fisher</td><td>OXLP0011B</td><td></td></tr><tr><td>Formal-Fixx 10% Formal-Fixx Formal-Fixx 10% Neutral Formol tamponado</td><td>Fisher 6764254</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caldo de lactosa (oxoide)</td><td>Fisher</td><td>OXCM0137B</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Fisher</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Tricane-S (MS-222)</td><td>Fisher</td><td>NC0872873</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Fisher</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Invitrogen 15561020</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hisopo de rayón estéril</td><td>Medical Wire & Equipo</td><td>MW-113</td><td></td></tr><tr><td>ApopTag Red Kit de detección de apoptosis in situ Merck</td><td>Millipore</td><td>S7165</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Bradford reactivo</td><td>Pierce</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>Caspasa Glo&nbsp; 3/7</td><td>Promega</td><td>G8090</td><td></td></tr><tr><td>Tampón HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1374248-1G</td><td></td></tr><tr><td>Hidrolizado de gelatina Enzimático</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0262</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solución salina tamponada con fosfato), pH 7,2 (1X)</td><td>Thermo/Life</td><td>20-012-043</td><td></td></tr><tr><td>Prepman</td><td>Thermo/Life</td><td>4318930</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4444556</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Clorox blanqueador</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 Prueba, Grado Molecular</td><td>Fisher</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Axio Scan microscopio fluorescente</td><td>Carl Zeiss</td><td>Microscopio fluorescente</td>3,2 mm perlas de <td></td></tr><tr><td>acero inoxidable</td><td>BioSpec</td><td>11079132SS</td><td></td></tr><tr><td>Primer ITSI-3 Chytr (5&prime;-CCTTGAT ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3&prime;)</td><td>Taqman</td><td></td><td>Diseño individual para cebadores y sonda</td></tr><tr><td>Primer 5.8S Chytr (5&prime;-TCGGTT CTCTAGGCAACAGTTT-3&prime;)</td><td>Taqman</td><td></td><td>Diseño individual para imprimaciones y sonda</td></tr><tr><td>Sonda aglutinante de ranura menor Chytr MGB2(5&prime;-CGAGTCGAAC-3&prime;)</td><td>Taqman</td><td></td><td>Diseño individual para cebadores y sonda</td></tr><tr><td>Rotor-Gene qPCR Instruments</td><td>Máquina qPCR</td><td>Qiagen</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga 1,5 ml</td><td>Fisher</td><td>02-681-372</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri para cultivo celular</td><td>Nunc 263991</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0,5 mm</td><td>BioSpec</td><td>11079105Z</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizando mediada por la transferasa terminal dutp nick end-etiquetado (tunel) y caspasas 3/7 ensayos a muerte celular epidérmica, medida en ranas con la quitridiomicosis

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

Anfibios están experimentando una gran pérdida de biodiversidad a nivel mundial y una de las principales causas es la quitridiomicosis enfermedad infecciosa. Esta enfermedad es causada por el hongo patógeno Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), que infecta y afecta epidermis de rana; sin embargo, los cambios patológicos se han no explícitamente caracterizados. Apoptosis (muerte celular programada) puede utilizarse por los patógenos para dañar tejido anfitrión, pero también puede ser un mecanismo de host de resistencia a las enfermedades para la eliminación del patógeno. En este estudio, cuantificar la muerte de las células epidérmicas de los animales infectados y no infectados usando dos análisis diferentes: terminal transferasa-mediated dUTP nick end-etiquetado (TUNEL) y caspasas 3/7. Utilizando tejido de piel de muslo y ventral, dorsal, en el ensayo TUNEL, observamos muerte en las células epidérmicas en situ de los animales clínicamente infectados de la célula y comparar la muerte de la célula con los animales no infectados mediante microscopía fluorescente. Para determinar cómo cambian los niveles de apoptosis en la epidermis en el transcurso de la infección extraer muestras de la punta del dedo del pie quincenal durante un período de 8 semanas y utilizar un ensayo de caspasas 3/7 con proteínas extraídas para cuantificar la actividad dentro de las muestras. Entonces correlacionamos actividad de caspasas 3/7 con la carga de la infección. El ensayo TUNEL es útil para la localización de la muerte de la célula en situ, pero es costoso y el tiempo por muestra. El ensayo de caspasas 3/7 es eficaz para tamaños de muestra grandes y tiempo curso de experimentos. Sin embargo, porque las de biopsias punta del dedo del pie de rana son pequeñas hay extracto limitado disponible para estandarización de la muestra a través de métodos de cuantificación de la proteína, tales como el ensayo de Bradford. Por lo tanto, sugerimos estimar el área superficial de la piel a través del análisis fotográfico de las biopsias del dedo del pie para evitar el consumo de los extractos durante la normalización de la muestra.

Ensayo TUNEL
Había más células positivas TUNEL en los animales infectados que en los animales control no infectado. La ubicación en situ de TUNEL positiva las células difieren en infectados y controlar animales. En animales control, hubo una distribución uniforme del TUNEL positiva las células a lo largo de la dérmica y epidérmica de la piel capas en niveles bajos (ver figura 1A), ...

Cuantificar la muerte celular epidérmica en ranas con quitridiomicosis usando dos métodos. En primer lugar, utilizamos terminal transferasa-mediated dUTP nick etiquetado final (TUNEL) en situ histología para determinar las diferencias entre animales clínicamente infectados y no infectados. En segundo lugar, llevamos a cabo un análisis de series temporales de la apoptosis sobre la infección usando un análisis de la proteína caspasa 3/7.

Utilizando mediada por la transferasa Terminal dUTP Nick End-etiquetado (TUNEL) y caspasas 3/7 ensayos a muerte celular epidérmica, medida en ranas con la quitridiomicosis

Amphibians are experiencing a great loss in biodiversity globally and one of the major causes is the infectious disease chytridiomycosis. This disease is ...

El objetivo general de este experimento es observar el efecto del patógeno fúngico anfibio batrachochytrium dendrobatidis sobre la apoptosis y la muerte celular en el tejido epidérmico de ranas. Este método puede ayudarnos a comprender las enfermedades de la fauna silvestre, por ejemplo, si la infección causa la muerte celular o, por el contrario, si existen mecanismos inmunológicos contra la infección. La principal ventaja de esta técnica es que se puede realizar en muestras de biopsia de tejido pequeño, de modo que se pueden muestrear repetidamente individuos pequeños durante el curso de la infección.Para comenzar este procedimiento, prepare portaobjetos de vidrio hidrófilo con tejido de muestra como se describe en el protocolo de texto. Para desparafinar las secciones de tejido, lave los portaobjetos tres veces con xileno durante cinco minutos cada uno en un frasco de coplin. A continuación, lave los portaobjetos con etanol al 100% dos veces durante cinco minutos cada una.Después de esto, lave los portaobjetos con 95% de etanol y 70% de etanol durante tres minutos cada uno. Luego, lave los portaobjetos una vez con PBS durante cinco minutos. Para preparar portaobjetos experimentales y de control negativo, se debe pretratar el tejido añadiendo proteinasa K recién diluida directamente a los portaobjetos.Incuba los portaobjetos durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego, lave los portaobjetos en PBS dos veces durante dos minutos cada uno. Para preparar portaobjetos de control positivo, pretrate el tejido con tampón DN y luego incube los portaobjetos a temperatura ambiente durante cinco minutos.Después de esto, disuelva la DNasa uno en tampón DN hasta una concentración final de 0,1 microgramos por mililitro. Agregue la solución de DNasa preparada a los portaobjetos. Incuba los portaobjetos durante 15 minutos a temperatura ambiente.Luego, lave los portaobjetos con agua destilada en un frasco de coplin cinco veces durante tres minutos cada uno. Apague la reacción en peróxido de hidrógeno al 3% en PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave los portaobjetos en PBS dos veces durante dos minutos cada uno.A continuación, añada un tampón de equilibrio al tejido de los portaobjetos. Incubar durante 10 segundos a temperatura ambiente. Luego, retira el exceso de líquido alrededor de la sección de tejido.Enzima desoxinucleotidil transferasa terminal diluida en tampón de reacción. Luego, agréguelo al tejido en los portaobjetos experimentales y de control positivo. Incubar en una cámara humidificada durante una hora a 37 grados centígrados.Después de esto, coloque los portaobjetos en un frasco de coplin que contenga la concentración de trabajo del tampón de parada. Agite durante 15 segundos y luego incube los portaobjetos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego, lave los portaobjetos con PBS tres veces durante un minuto cada una y retire el exceso de líquido.A continuación, agregue el conjugado anti-digoxigenina, precalentado a temperatura ambiente, directamente sobre el tejido. Incube los portaobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente en una cámara oscura humidificada. Una vez completada la incubación, lave los portaobjetos con PBS cuatro veces durante dos minutos cada uno.Retira el exceso de líquido. Luego, agregue medio de montaje a las guías. Agregue 15 microlitros de solución DAPI al medio de montaje en los portaobjetos.Cubra cada portaobjetos con un cubreobjetos y séllelo con esmalte de uñas. Deje que los portaobjetos se sequen en la oscuridad. Usando un microscopio fluorescente, observe los portaobjetos inmediatamente después de completar el proceso de colocación.Tome fotos 400 veces a intervalos aleatorios a lo largo de cada sección de la piel. Cuente los glóbulos azules teñidos con DAPI para asegurarse de que al menos 100 células por sección de piel por animal sean visibles. A continuación, cuente el número de células TUNEL-positivas que aparecen como células individuales rojas con bordes de celda claros.Para comenzar, use un microscopio de luz invertida 40 veces para tomar una foto de cada uno de los dedos de la rana. Dibuja líneas alrededor del borde de la pinza del dedo del pie y usa un software de imágenes para estimar el área dentro de la forma. Para evaluar el área superficial de la muestra de piel tridimensional, multiplique el área estimada por pi.Para extraer proteínas de una muestra congelada de dedo de rana, coloque la muestra en un tubo de microcentrífuga con tapón de rosca de 1,5 mililitros que contenga 100 microlitros de tampón de muestra y dos perlas de acero inoxidable. Utilice un batidor de cuentas a máxima velocidad para lisar las células. Después de esto, coloque el tubo en hielo durante tres minutos.Luego, centrifuga el tubo para recoger el sobrenadante. Para realizar el ensayo de caspasa 3/7 en una placa de 384 pocillos, agregue 10 microlitros de tampón de muestra en blanco y 10 microlitros de extracto de proteína por triplicado. A continuación, pipetee 10 microlitros de reactivo de caspasa 3/7 disponible en el mercado en el extracto proteico y en los pocillos en blanco.A continuación, agite la placa suavemente durante 15 segundos para mezclar los dos reactivos. Incubar a temperatura ambiente en oscuridad durante 30 minutos. Por último, utilice un lector de placas luminiscentes para medir la luminiscencia de la muestra.En este estudio, los animales infectados muestran significativamente más células TUNEL-positivas en comparación con los animales de control, como lo ilustran las células teñidas de rojo o rosa. En los animales control, hay pocas células TUNEL-positivas, y no se concentran en la epidermis. En los animales infectados, las células TUNEL-positivas son más frecuentes en la epidermis.Las células TUNEL positivas están más concentradas en las imágenes de las células infectadas y directamente adyacentes a ellas. Además, hay células TUNEL-positivas más extendidas sobre la epidermis y en las capas epidérmicas que son más profundas que donde residía el patógeno fúngico. En los animales infectados, hay más células TUNEL-positivas en los tres tipos de piel, con un nivel particularmente alto en la piel del muslo y del ventral.En el ensayo de caspasas, la intensidad de la infección se correlaciona positivamente con la actividad de la caspasa 3/7. Además, la actividad de la caspasa 3/7 en animales infectados y no infectados difirió con el tiempo. La actividad de la caspasa 3/7 disminuyó en las primeras semanas después de la inoculación y luego aumentó hacia el final de la séptima semana en animales infectados.La actividad de la caspasa 3/7 se mantuvo constante en individuos no infectados. Al intentar el procedimiento para el ensayo TUNEL, es importante leer los portaobjetos el mismo día del ensayo para evitar la pérdida de sensibilidad y mantener los portaobjetos en un lugar fresco y oscuro para proteger los tintes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo detectar la apoptosis y la muerte celular utilizando dos métodos de detección diferentes en muestras de tejido pequeñas como la piel de anfibio.

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Immunology and Infection

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Se presenta un protocolo simple de visualizar regiones de la muerte celular programada (PCD) en embriones de ratón y diferenciadores madre embrionarias (ES) de cultivos de células utilizando un colorante altamente soluble llamada LysoTracker.

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Marcaje final de dUTP nick mediado por transferasa terminal: ensayo TUNEL: un método in situ para detectar la fragmentación del ADN en células apoptóticas

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Ensayo de Caspasa-3/7: Un ensayo basado en luminiscencia para cuantificar la apoptosis midiendo las actividades de Caspasa-3/7 en explantes de piel de rana

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Utilizando mediada por la transferasa Terminal dUTP Nick End-etiquetado (TUNEL) y caspasas 3/7 ensayos a muerte celular epidérmica, medida en ranas con la quitridiomicosis (Video) | JoVE Journal

Utilizando mediada por la transferasa Terminal dUTP Nick End-etiquetado (TUNEL) y caspasas 3/7 ensayos a muerte celular epidérmica, medida en ranas con la quitridiomicosis

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