Name: Construcción de fagos sintético muestra fabulosa biblioteca con diversidad a medida (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Aprende a construir una biblioteca de anticuerpos sintéticos con diversidad a medida mediante tecnología de fagos. Este método permite desarrollar anticuerpos terapéuticos de alta afinidad sin necesidad de inmunización animal.

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Los autores agradecemos Dr. Frederic Fellouse del laboratorio de Sidhu para comentarios críticos en la construcción de biblioteca de Kunkel método basado sintético phage Fab. Los autores aprecian la Sra. Alevtina Pavlenco y otros miembros del laboratorio Sidhu ayuda valiosa de la preparación competente de electro de alta eficiencia de células de e. coli y de alta calidad dU-ssDNA. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Grant No.: 81572698, 31771006) a DW y por la Universidad de ShanghaiTech (Grant No.: F-0301-13-005) al laboratorio de ingeniería de anticuerpos.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Para la construcción de alta diversidad, fago muestra Fab bibliotecas, control de calidad puntos de control son necesarios para monitorear distintas etapas del proceso de construcción, incluyendo la capacidad de células electro-competentes, calidad de la plantilla dU ssDNA, eficiencia de CCC-dsDNA síntesis, título después de la electroporación, plegable Fab y diversidad de aminoácidos de CDRs por análisis de la secuencia de los clones de fago Fab.
Alto rendimiento y pureza de dU-ssDNA es esenc...

mAbs tienen amplias aplicaciones que van desde la investigación básica a la terapia y el diagnóstico de la enfermedad. A partir de 2016, mAbs más de 60 han sido aprobados por la administración de la droga (FDA) y alimentos de Estados Unidos para el tratamiento clínico de enfermedades autoinmunes, cáncer y enfermedades infecciosas1,2.
En 1975 Kohler y Milstein reportaron una técnica para la generación continua de anticuerpos de una especificidad clonal solo de una fuente celular denominada "Hibridomas" y esta técnica se ha convertido posteriormente en un eje fundamental en la medicina y la industria3 ,4. Generación de mAbs por este método requiere varios pasos, incluyendo la producción de antígeno, ratón vacunación, extracción de los linfocitos B, fusión de las células B con células de mieloma para formar células de hibridoma inmortal, selección de clones y para aplicaciones terapéuticas, humanización es necesaria para evitar el anticuerpo humano del anti-ratón (HAMA)4,5. Sin embargo, para esta tecnología, incluyendo toxinas, patógenos y proteínas altamente conservadas de los antígenos son relativamente ineficaces en accionar en vivo respuesta inmune para mAb producción5.
En 1978, Hutchison et al. divulgó el uso de un oligonucleótido a mutagénesis directa de un residuo en una sola hebra bacteriófago virus6. En 1985, Smith informó que fragmentos génicos extranjeros se pueden fusionar de marco con el gene que codifica la proteína de la cápsida del fago III y así pueden verse en la superficie de fagos sin comprometer su infectividad7. Estos pioneros trabajos sentaron las bases para la posterior construcción de las bibliotecas de fagos que aparecen anticuerpos en inmune, ingenuo, y forma sintética con los formatos de fragmento variable de cadena simple (scFv) y fragmento de antígeno-que ata (Fab) para terapéutica mAb desarrollo8,9. Desde el punto de vista técnico, desarrollo de anticuerpos basados en pantalla de fago ofrece un enfoque complementario al desarrollo mAb basados en hibridomas que puede ayudar a eludir las limitaciones de que algunos antígenos pueden presentar y la humanización del proceso los anticuerpos derivados de hibridoma a menudo requieren5. A partir de 2016, 6 mAbs de derivados de exhibición phage han sido aprobados en el mercado, incluyendo Humira, uno de los más exitosos mAbs utilizados para el tratamiento de la artritis reumatoide, y muchos candidatos de anticuerpos derivados de exhibición phage están en diversas etapas clínicas investigación10.
Para inmune ingenuo phage anticuerpo las bibliotecas y, la diversidad de determinantes de complementariedad (CDRs) de regiones de cadena ligera y pesada se deriva del repertorio inmune natural (es decir, de las células de B). Por el contrario, la diversidad de CDR ' s en las bibliotecas de anticuerpos sintéticos phage es totalmente artificial. Enfoques sintéticos para la construcción de la Biblioteca proporcionan un control preciso sobre el diseño de la diversidad de la secuencia y ofrecen oportunidades para el estudio de mecanismos de la estructura del anticuerpo y función11,12. Además, el marco para las bibliotecas sintético puede optimizarse antes de la construcción de la biblioteca para facilitar aguas abajo, el desarrollo industrial a gran escala11,12.
En 1985, Kunkel informó de un enfoque de mutagénesis basadas en plantillas de ADN (ssDNA) monocatenario introducir mutaciones sitio-dirigida en bacteriófago M13 eficientemente13. Este enfoque fue utilizado posteriormente para la construcción de bibliotecas de fagos que aparecen. Oligonucleótidos de DNA químicamente sintetizados diseñados para introducir diversidad en Fab CDRs se incorporan en un phagemid con una plantilla de columna vertebral del anticuerpo. En este proceso, la phagemid se expresa como una ssDNA que contiene uracilo (dU-ssDNA) y los oligonucleótidos son recocidos en la ECCD y extendidos para sintetizar ADN de doble cadena (dsDNA) en presencia de polimerasa de la DNA T7 y ligase de la DNA de T4. Finalmente, ds-DNA generado puede introducirse en Escherichia coli por la electroporación.
Para alta diversidad, construcción de biblioteca muestran en fago, electroporación de alta tensión de una mezcla de dos componentes de células electro-competentes y covalente dsDNA circular cerrada (CCC-dsDNA) debe ser preparado cuidadosamente. Sidhu et al modificar la preparación de células competentes de electro y el ADN de los métodos tradicionales y de diversidad de biblioteca mejorado en gran medida14.
En este protocolo, se describe un método para la construcción de bibliotecas Fab fago muestra sintéticas con diversidades de9-10 1010 con una única electroporación. La figura 1 muestra un resumen de la biblioteca construcción incluyendo: 1) preparación de células competentes electro alta eficiencia; 2) extracción de dU-ssDNA; 3) el método de Kunkel basa mutagénesis dirigida por oligonucleótidos; 4) electroporación y cálculo del tamaño de la biblioteca; 5) proteína A/L basado en ELISA para doblar y la evaluación de la diversidad funcional; y 6) análisis de la secuencia del ADN de la diversidad. Todos los reactivos, cepas y equipos se enumeran en la tabla de materiales. La tabla 1 muestra la configuración del reactivo.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.0 M H3PO4</td><td>Fisher</td><td>AC29570</td><td></td></tr><tr><td>1.0 M Tris, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>10 mM ATP</td><td>Invitrogen</td><td>18330-019</td><td></td></tr><tr><td>100 mM ditiotreitol</td><td>Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTP mezcla</td><td>la solución GE Healthcare</td><td>28-4065-60</td><td>que contiene 25 mM de dATP, dCTP, dGTP y dTTP.</td></tr><tr><td>3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB)</td><td>Kirkegaard & Perry Laboratories Inc</td><td>50-76-02</td><td></td></tr><tr><td>50X TAE</td><td>Invitrogen</td><td>24710030</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Fisher</td><td>BP160</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillina, carbohidrato</td><td>Sigma</td><td>C1389</td><td>100 mg/mL en agua,&nbsp; 0.22 &mu; m filtro-esterilizador, concentración de trabajo: 100 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Cloranfenicol, cmp</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>100 mg/mL en etanol, 0,22 &mu; m filtro-esterilizador, concentración de trabajo: 10 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9620G</td><td></td></tr><tr><td>Agar granulado</td><td>VWR</td><td>J637-500G</td><td></td></tr><tr><td>H2O2 sustrato de peroxidasa</td><td>Kirkegaard & Perry Laboratories Inc</td><td>50-65-02</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin, kan</td><td>Fisher</td><td>AC61129</td><td>50 mg/mL en agua,&nbsp; 0.22 &mu; m filtro-esterilizador, concentración de trabajo: 50 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>94046</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>U19C015</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Fisher</td><td>ND2000C</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS256</td><td>! PRECAUCIÓN El NaOH causa quemaduras.</td></tr><tr><td>Leche en polvo desnatada</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600669</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Fisher</td><td>BP233</td><td></td></tr><tr><td>Proteína A-HRP conjugada</td><td>Invitrogen</td><td>101123</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin M13 Kit</td><td>Qiagen</td><td>22704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de extracción de gel</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit de purificación</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Proteína recombinante L</td><td>Fisher</td><td>77679</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN polimerasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 polinucleótido quinasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T7 ADN polimerasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0274S</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina, tet</td><td>Sigma</td><td>T7660</td><td>50 mg/mL en agua, 0. 22 y mu; m filtro-esterilizador, concentración de trabajo: 10 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Fisher</td><td>0123-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol ultrapuro</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3750</td><td>25 mg/mL en etanol, concentración de trabajo: 0,25 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>VWR</td><td>DF0127-08</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comentarios</td></tr><tr><td>Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E.coli CJ236</td><td>New England Biolabs</td><td>E4141</td><td>Genotipo: dut-&nbsp; ung-&nbsp; thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Se utiliza para la preparación de dU-ssDNA.</td></tr><tr><td>E.coli SS320</td><td>Lucigen</td><td>60512</td><td>Genotipo: [F'proAB+lacIq lacZ&Delta; M15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 &Delta; (araABC-leu)7679 y Delta; lacX74 galUgalK rpsL thi. Optimizado para electroporación de alta eficiencia y producción de bacteriófagos filamentosos.</td></tr><tr><td>M13KO7</td><td>New England Biolabs</td><td>N0315S</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </strong</td><td>>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Equipo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 cm de espacio cubeta de electroporación</td><td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 pocillos 2mL Placas de pocillos profundos</td><td>Fisher</td><td>278743</td><td></td></tr><tr><td>de 96 pocillos Inmunoplacas Maxisorp Nunc</td><td></td><td>151759</td><td></td></tr><tr><td>Frascos deflectores</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa</td><td>Eppendorf</td><td>5811000096</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de centrífuga</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECM-630 Electroporador</td><td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnético barras agitadoras</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Thermo Fisher</td><td>Fisher Agitador</td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>alta velocidad</td><td>TAITEK</td><td>MBR-034P</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de microplacas</td><td>QILINBEIER</td><td>QB-9002</td><td></td></tr><tr><td>Manipulador de líquidos para 96 y 384 pocillos</td><td>RAININ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal</td><td>RAININ</td><td>E4XLS</td><td></td></tr><tr><td>Amicon concentrador</td><td>Merck</td><td>UFC803096</td><td></td></tr></tbody></table>

construcción de fagos sintético muestra fabulosa biblioteca con diversidad a medida

Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity

Demanda de anticuerpos monoclonales (mAbs) en investigación básica y medicina está aumentando cada año. Tecnología de hibridoma ha sido el método dominante para el desarrollo de mAb desde su primer informe en 1975. Como una tecnología alternativa, métodos de exhibición phage para mAb desarrollo son cada vez más atractivos puesto que Humira, el primer anticuerpo derivado de phage y uno de los superventas mAbs, fue aprobado para el tratamiento clínico de la artritis reumatoide en 2002. Como no animal basado en tecnología de desarrollo de mAb, exhibición phage omite la inmunogenicidad del antígeno, humanización y mantenimiento animal que se requiere del desarrollo de anticuerpos hibridomas tradicional basado en la tecnología. En este protocolo, se describe un método para la construcción de bibliotecas Fab fago muestra sintéticas con diversidades de9-10 1010 con una única electroporación. Este protocolo consta de: 1) preparación de células competentes electro alta eficiencia; 2) extracción de uracil-ADN monocatenario (ssDNA-dU); 3) el método de Kunkel basa mutagénesis dirigida por oligonucleótidos; 4) electroporación y cálculo del tamaño de la biblioteca; 5) enzima-ligado del inmunosorbente ensayo proteína basada en A/L (ELISA) para doblar y la evaluación de la diversidad funcional; y 6) análisis de la secuencia del ADN de la diversidad.

Siguiendo el diagrama de flujo de la construcción de la fabulosa biblioteca (ver figura 1), preparamos M13KO7 ayudante phage previamente infectado SS320 de e. coli células electro-competentes. La eficacia de estas células electro-competentes se estima como el 2 X 109 UFC/μg cuando se utilizó la espina dorsal de la Fab phagemid para la construcción de la biblioteca (figura 4).
<p class="jove_content" fo:kee...

Este protocolo describe un procedimiento detallado para la construcción de una biblioteca de fago que aparecen anticuerpos sintéticos con diversidad a medida. Anticuerpos sintéticos tienen amplias aplicaciones desde la investigación básica para diagnósticos de enfermedad y terapéutica.

Construcción de fagos sintético muestra fabulosa biblioteca con diversidad a medida

Demand for monoclonal antibodies (mAbs) in basic research and medicine is increasing yearly. Hybridoma technology has been the dominant method for mAb ...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar a los lectores una experiencia práctica detallada en la construcción de una biblioteca de anticuerpos humanos sintéticos visualizada por fagos con una diversidad personalizada. Las bibliotecas de anticuerpos mostradas por fagos sintéticos tienen un gran potencial para reemplazar las técnicas tradicionalmente basadas en hibridomas para el desarrollo de anticuerpos monoclonales terapéuticos al evitar la necesidad de inmunización animal y la posterior humanización de anticuerpos. La ventaja de la biblioteca de anticuerpos sintéticos es que la diversidad personalizada se introduce en un marco de anticuerpos utilizando la información sobre la diversidad posicional que respalda una interacción de alta afinidad y propiedades proteicas deseables.Más allá de la utilidad práctica, las bibliotecas de anticuerpos sintéticos también se pueden utilizar para probar experimentalmente el papel de aminoácidos específicos en las interacciones biomoleculares, apoyando así su propia mejora continua. Este procedimiento será demostrado por el estudiante graduado llamado Zhenwei Zhong y el doctor Shin-chen Hou de nuestro laboratorio. Ser

construction-synthetic-phage-displayed-fab-library-with-tailored

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este video, demostramos la técnica de visualización de fagos para aislar fagos prediseñados que expresan proteínas con alta afinidad por la proteína objetivo.

Uso de la visualización de fagos para seleccionar proteínas con alta afinidad con una proteína objetivo

La presentación en fagos es una técnica poderosa para capturar las proteínas o restos de proteínas que interactúan con una molécula inmovilizada de interés. Una vez que se ha tomado una decisión del tipo de fago biblioteca de cDNA para crear y pantalla, el protocolo aquí descrito permite la selección por afinidad eficaz que conduce a la identificación de los interactores.

Un Protocolo de fagos y de selección de afinidad utilizando cebos proteína recombinante

Se describe un método con acompañamiento visual para conducir, las selecciones de rendimiento altos escalables de bibliotecas de anticuerpos sintéticos combinatorios fagos contra cientos de antígenos simultáneamente. El uso de este enfoque paralelo, hemos aislado fragmentos de anticuerpos que exhiben alta afinidad y especificidad para diversos antígenos que son funcionales en inmunoensayos estándar.

Escalable de alto rendimiento seleccion de bibliotecas de anticuerpos sintéticos fagos

Una nueva generación de plataformas de transcripción-traducción libre de la célula ha sido diseñada para la construcción de sistemas bioquímicos en vitro a través de la ejecución de circuitos de gene. En este artículo describimos cómo bacteriófagos como MS2, ΦΧ174 y T7, son sintetizados a partir de su genoma mediante un todo e. coli sin células TXTL sistema.

Síntesis de bacteriófagos infecciosas en una e. coli -basan sistema de expresión libre

Los protocolos descritos permiten la construcción, caracterización y selección (contra el blanco de la opción) de una biblioteca de "domainome" de cualquier fuente de ADN. Esto se logra mediante una tubería de investigación que combina diferentes tecnologías: exhibición phage, un reportero plegable y próxima generación la secuencia con una herramienta web de análisis de datos.

Interactoma-Seq: Un protocolo para la biblioteca de Domainome construcción, validación y selección de Phage Display y la siguiente secuencia de generación

La creación de sistemas de dimerización de proteínas inducidos químicamente con la afinidad y especificidad deseadas para cualquier ligando de moléculas pequeñas dado tendría muchas aplicaciones de detección y accionamiento biológico. Aquí, describimos un método eficiente y generalizable para la ingeniería de novo de sistemas de dimerización inducidos químicamente a través de la selección escalonada de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio visualizada por fago.

Creación de sistemas de dimerización de proteínas altamente específicos inducidos químicamente por la selección de fagos escalonados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio

La ubiquitinación es una proteína crítica de modificación post-traduccional, cuya desregulación se ha implicado en numerosas enfermedades humanas. Este protocolo detalla cómo se puede utilizar la visualización de fagos para aislar nuevas variantes de ubiquitina que pueden unirse y modular la actividad de las ligasas E3 que controlan la especificidad, la eficiencia y los patrones de ubiquitinación.

Uso de la pantalla de fagos para desarrollar moduladores de variantes de ubiquitina para ligasas E3

Un método simple para la identificación de los patógenos bacterianos prioridad es el uso de fagos reportero de la ingeniería genética. Estos fagos reportero, que son específicos de su especie huésped particular, son capaces de transducir una respuesta rápida de la señal bioluminiscente a las células huésped. En este documento, se describe el uso de fagos reportero para la detección...

&quot;Bioluminiscente &#39;reportero fagos para la detección de patógenos bacterianos de la categoría A

Este protocolo establece un procedimiento paso a paso para controlar el comportamiento de células individuales de bacterias diferentes en el tiempo el uso automatizado de fluorescencia time-lapse microscopía. Además, proporcionar directrices a analizar las imágenes de microscopía.

Imágenes de células vivas de Bacillus subtilis Y Streptococcus pneumoniae Automatizada utilizando Time-lapse microscopía

Se describe un método eficiente para separar ADN de cadena sencilla, doble cadena de ADN y las moléculas de ARN viral de las comunidades del medio ambiente. Los ácidos nucleicos son fraccionados utilizando cromatografía de hidroxiapatita con una creciente concentración de fosfato que contienen buffers. Este método permite el aislamiento de todos los tipos de ácido nucleico viral de las muestras ambientales.

La separación de una sola hebra de ADN, el ADN de doble cadena y el ARN de una comunidad ambiental viral mediante cromatografía de hidroxiapatita

Aprende a construir una biblioteca de anticuerpos sintéticos con diversidad a medida mediante tecnología de fagos. Este método permite desarrollar anticuerpos terapéuticos de alta afinidad sin necesidad de inmunización animal.

Construcción de fagos sintético muestra fabulosa biblioteca con diversidad a medida

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