Double-stranded RNA Oral entrega métodos para inducir la interferencia de ARN en floema e insectos Hemipteran alimentación planta de sap

El objetivo general de estos procedimientos es demostrar un método de administración oral natural. En el caso de los dsRNAs específicos de genes, para inducir interferencias de ARN in vivo y plagas de insectos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo administrar biomoléculas dentro de los insectos, para dilucidar el efecto de los biopesticidas moleculares basados en ARNi y para controlar los insectos en el medio ambiente.

La principal ventaja de esta técnica es que esta entrega a través del silenciamiento génico mediado por ácidos nucleicos se puede aplicar a la alimentación de la savia de las plantas, así como a los insectos masticadores. Aunque los métodos aquí demuestran la entrega de ARN bicatenario a plagas de hemípteros, como la chinche apestosa marrón marmórea, la chinche arlequín y el psílido asiático de los cítricos. Se pueden aplicar a otros insectos.

Para comenzar el protocolo, seleccione una chinche apestosa marrón marmórea de 4º estadio temprano, o ninfas BMSB, eclosionadas de la masa de huevos, y matándolas de hambre durante 24 horas antes de la alimentación con dsRNA. A continuación, seleccione judías verdes delgadas y orgánicas certificadas y lávelas con una solución de hipoclorito de sodio al 0,2% durante cinco minutos. Siga con tres lavados de H2O de doble destilación y deje que los granos se sequen al aire.

Una vez que estén secas, recorte las judías verdes desde el extremo del cáliz hasta una longitud total de 7,5 centímetros con una cuchilla de afeitar limpia. Sumerja las judías verdes lavadas y recortadas en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros sin tapa que contenga 300 microlitros de solución de control. Realice diluciones de los lac Z, JHAMT o VGDSRNA sintetizados in vitro, diluyendo 5 microgramos, o 20 microgramos, y 300 microlitros de ARN, agua libre de ADN para obtener concentraciones finales de 0,017 microgramos por microlitro, o 0,067 microgramos por microlitro respectivamente.

Sumerja las judías verdes lavadas y recortadas en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros sin tapa, que contenga 300 microlitros de solución de dsRNA. Envuelva y selle los bordes de los tubos de microcentrífuga, encerrando los frijoles sumergidos para evitar la evaporación de la solución de dsRNA y para evitar que los animales ingresen al tubo de microcentrífuga. Coloque los tubos en posición vertical a temperatura ambiente durante tres horas, para permitir que la solución de dsRNA se cargue en todo el frijol verde por acción capilar.

Coloque los tubos en recipientes de cultivo limpios de polipropileno y coloque 3 ninfas hambrientas de 4th Instar BMSB en los recipientes de cultivo. Trate tres insectos por recipiente de cultivo. Cada uno contiene tres judías verdes con colorante alimentario verde o solución de dsRNA.

Mantener los insectos a 25 grados centígrados y 72% de humedad relativa, bajo un régimen de 16L, 8D fotoperiodo en una incubadora. Permita que los insectos se alimenten de las judías verdes sumergidas y absorbidas en dsRNA durante cinco días, y repóngalas con dietas frescas de judías verdes tratadas con dsRNA después de tres días. Seleccione plantas o plántulas, y no las riegue durante dos o tres días antes de usarlas, para dejar que la tierra se seque hasta la humedad, pero no completamente seca.

Con una botella rociadora bombeada a mano, aplique 200 mililitros de solución de dsRNA en el dosel inferior. Muestree el nuevo crecimiento de los árboles previamente desmochados después de 25 a 40 días, recolectando aproximadamente 10 hojas de las puntas de cuatro ramas. Extraiga el ARN total y analícelo por RT-PCR y qPCR para detectar la presencia del desencadenante de dsRNA aplicado.

Del mismo modo, rocíe tópicamente 10 mililitros de dsRNA en la región inferior de una plántula o follaje de un árbol en maceta pequeña. Seleccione plantas o plántulas, y no las riegue durante dos o tres días antes de usarlas, para dejar que la tierra se seque, se humedezca, pero no se seque completamente. A continuación, agregue un litro de solución de dsRNA al suelo de las plantas en macetas grandes.

Agrega un litro de agua después de una hora. Aplique 100 mililitros de solución de dsRNA al suelo de árboles en macetas de un metro de altura en suelos parcialmente secos. Deje que las plantas reciban la solución de dsRNA como un empapado de tierra, para remojar durante 30 minutos.

A continuación, aplique un tratamiento de solo agua para ayudar a la absorción por parte de las raíces. Seleccione plántulas de cítricos, plantas nuevas o de aproximadamente 3,5 años para inyectar dsRNA utilizando el grifo del tallo, también conocido como el método de inyecciones en el tronco. Envuelva la punta de cobre de cada inyector de cuatro a seis veces con una tira de película para techo de 0,6 centímetros de ancho para evitar fugas cerca de la punta.

A continuación, llene los inyectores de tronco de árbol con seis mililitros de solución de dsRNA diluida con ADN, agua libre de ARN. Perfore agujeros en las plantas de cítricos con una broca de 10 mililitros y tenga cuidado de no exceder los dos centímetros, o aproximadamente la mitad del diámetro del tallo. Luego, inyecte la solución en el tronco del árbol y deje el inyector en el tronco durante seis a 10 horas para permitir la absorción de la solución de dsRNA.

Deje que los insectos se alimenten de los esquejes de los árboles tratados a los 3, 10 y 30 días después del tratamiento. Vierta 30 gramos del absorbente de arcilla en un tubo cónico de 50 mililitros hasta la marca de 35 mililitros. Vierta 20 mililitros de solución de dsRNA diluida en ADN, agua libre de ARN en el tubo para humedecer todo el absorbente.

Tape el tubo cónico, incline el tubo para ayudar a eliminar el aire, coloque el tubo en posición vertical y déjelo reposar durante uno o dos minutos mientras las partículas de arcilla absorben la solución. Agregue suficiente arcilla empapada en dsRNA a la mezcla de tierra para llenar una maceta de un galón. Mezcle y voltee la tierra a mano para mezclar completamente la arcilla empapada en dsRNA en el suelo.

Utilice la tierra para trasplantar las plántulas seleccionadas para el tratamiento con dsRNA. Riegue el suelo con 200 mililitros de agua corriente, sin dsRNA, después de 30 minutos a una hora. Siga con 100 mililitros de agua corriente.

Después de 24 horas, ponga la planta en un horario de riego normal. Pruebe de cuatro a seis hojas de las plantas en macetas tratadas con absorbentes de arcilla y dsRNA cada mes, después del tratamiento para dsRNA, recolectando las hojas más apicales del crecimiento de nuevas plantas. La QPCR de segmentos de judías verdes inmersos en dsRNA sintetizado in vitro, específico para la chinche apestosa marrón marmórea, o ARNm de BMSB, indicó la inducción exitosa de ARNi ya que la expresión de los objetivos JHAMT y Vg se redujo significativamente in vivo.

Este método de administración también es efectivo en otra plaga de hemípteros, el insecto arlequín. Como lo indican sus excrementos de color verde. Después de ver estas demostraciones visuales, debe tener una buena comprensión de cómo administrar ARN bicatenario a los insectos a través de la ingestión oral para inducir insectos ARNi in vivo.

Los avances que se están realizando en la tecnología de nucelótidos de ARNi continúan ampliando las capacidades de los investigadores para modular el ARN, la expresión génica y los niveles de proteínas en una amplia gama de organismos vivos. Esto va desde las plantas, hasta los insectos y los microorganismos más difíciles. Por lo tanto, mientras el costo de producción de ARN de doble cadena continúa disminuyendo, y los métodos de administración y estabilidad continúan mejorando, el futuro de las tecnologías de ARNi continuará utilizándose para resolver problemas complejos emergentes.