Name: Double-stranded RNA Oral entrega métodos para inducir la interferencia de ARN en floema e insectos Hemipteran alimentación planta de sap (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Aprende métodos de entrega oral de ARN bicatenario para inducir interferencia de ARN en insectos hemípteros alimentadores de savia mediante tejidos vasculares de plantas. Esta técnica permite silenciar genes específicos in vivo y controlar plagas agrícolas de forma específica.

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Los autores reconocen agradecidos Donald Weber y Megan Herlihy (USDA, ARS Beltsville, MD) para proporcionar BMSB y HB para la experimentación y el mantenimiento de las colonias; y Maria T. Gonzalez, Salvador P. López, (USDA, ARS, Fort Pierce, FL) y Jackie L. Metz (Universidad de Florida, Fort Pierce, FL) para el mantenimiento de la Colonia, preparación de muestras y análisis.

1. BMSB de cría
<ol><li>Trasero BMSB insectos según descrita63y la práctica de laboratorio estándar.</li>
	<li>Criar insectos ACP (D. citri) sobre Citrus macrophylla en un invernadero (22 ° C) y luz natural. Uso adulto ACP, en aproximadamente 5-7 días post eclosión.</li>
</ol>2. selección de las regiones de genes y síntesis In Vitro de dsRNA
<ol><li>Seleccionar genes específicos para BMSB de transcriptoma previamente publicado perfiles32.</li>
	<li>Asegúrese de que las regiones de interés seleccionados varían entre 200 a 500 pares de bases.</li>
	<li>Llevar a cabo la reacción en cadena de polimerasa (polimerización en cadena) usando las condiciones descritas a continuación para generar fragmentos asociados con el gen seleccionado de interés de la DNA genomic. Vea la tabla 1 para los oligonucleótidos gene-específico.<ol>
<li>Reacción de PCR: se combinan en un tubo PCR de 0,25 mL, 5 μl de 10 X PCR Buffer, 4 μL de dNTP mezcla (2,5 mM), 2 μl de la plantilla de ADN (50 ng/μL), 2.5 μl de cartillas 1 y 2 (10 μm), 0.25 μl de ADN polimerasa (5 U/μL) , y hasta 50 μl de agua libre de DNasa/Rnasa.</li>
		<li>Condición PCR: ciclo de la reacción de PCR para amplificar la región de interés a 95 ° C por 3 min, seguido de 30 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 55 ° C por 30 s, 72° C durante 1 minuto incubar la reacción a 72 ° C durante un adicional 10 minutos purificar la reacción de PCR utilizando un kit de purificación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Amplificar los fragmentos PCR obtenidos más con iniciadores específicos del gene flanqueados por la secuencia de promotor de T7 ARN polimerasa (5'-GAA TTA ATA CGA CTC ley ATA GGG AGA-3') como mencionado anterior62.</li>
	<li>Utilice gen LacZ como control negativo (mofa) para RNAi. Nota: LacZ es un gen que codifica la β-galactosidasa amplificado de la DNA genomic de Escherichiacoli (los cebadores utilizados se listan en la tabla 1).</li>
	<li>Realizar la transcripción en vitro para producir dsRNA descrito anterior62.</li>
	<li>Disolver y suspender el dsRNA resultante en agua libre de 150 μL DNasa/Rnasa, medir la concentración y a-80 ° C para su uso futuro.</li>
</ol>3. entrega de dsRNA con ejotes
<ol><li>Seleccione desde 4th BMSB ninfas de instar nacieron de la misma masa de huevo y hambre durante 24 h antes de dsRNA de alimentación.</li>
	<li>Seleccione delgados certificadas orgánicas ejotes (Phaseolus vulgaris L.) y lavar con solución de hipoclorito de sodio al 0.2% durante 5 minutos. Nota: Judías verdes delgadas fueron seleccionados para que los granos se pueden acomodar fácilmente en los tubos de microcentrífuga de 2 mL.</li>
	<li>Lavar 3 veces con ddH2O y deje secar al aire.</li>
	<li>Cortar las judías verdes desde el extremo del cáliz de una longitud total de 7,5 cm usando una cuchilla de limpiar.</li>
	<li>Sumerja las judías lavadas y cortadas en un tubo de microcentrífuga de cap-menos de 2 mL conteniendo 300 μL de solución de control (un 1:10 dilución de colorante verde (ingredientes: agua, glicol de propileno, Fd & C amarillo 5, Fd & C azul 1 y propilparabeno como preservativo)).</li>
	<li>Hacer diluciones de la en vitro sintetizan dsRNAs LacZ, JHAMT o Vg por dilución 5 μg o 20 μg en 300 μL de agua libre de DNasa/Rnasa para obtener concentraciones finales de 0.017 μg/μl o 0.067 μg/μl, respectivamente.</li>
	<li>Sumerja las judías lavadas y cortadas en un tubo de microcentrífuga de cap-menos de 2 mL conteniendo 300 μL de solución de dsRNA (del paso 3.6).</li>
	<li>Envolver y sellar los bordes de los tubos de microcentrífuga que encierra los granos sumergidos para evitar la evaporación de la solución de dsRNA y para evitar que los animales entren en el tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Coloque estos tubos de forma vertical a temperatura ambiente durante 3 h permitir que la solución de dsRNA a cargarse a través de la judía verde por acción capilar.</li>
	<li>Colocar los tubos en recipientes de cultivo limpio (polipropileno). Tres murieron a 4th estadio BMSB las ninfas en los recipientes de cultivo.</li>
	<li>Tratar a los tres animales por recipiente de cultivo cada una con tres judías verdes con una solución colorante o dsRNA alimento verde. Mantener los insectos a 25 ° C y 72% de humedad relativa, bajo un fotoperíodo 16 L: 8 en una incubadora.</li>
	<li>Permite que los insectos se alimentan de las judías verdes (inmersos y absorbido con dsRNA) durante 5 días pero reponer con nuevas dietas de granos tratamiento verde de dsARN después de 3 días.</li>
</ol>4. en tiempo real cuantitativa (qPCR) análisis de la expresión siguiente RNAi mediado silenciamiento del gen BMSB
<ol><li>Medir el efecto de RNAi sobre los niveles de expresión de la transcripción por qPCR.</li>
	<li>Aislar el RNA total de los animales Tratado de dsARN y sintetizar el cDNA62.</li>
	<li>Configuración de las reacciones de qPCR utilizando un sistema PCR en tiempo real y los iniciadores figuran en la tabla 1. Utilizar la siguiente condición de ciclismo qPCR: 95 ° C durante 10 min seguida por 40 ciclos de 95 ° C por 15 s, 60 ° C por 1 min, junto con el paso de la disociación entre 95 ° C por 15 s, 60 ° C por 1 min, 95 ° C por 15 s y 60 ° C por 15 s.</li>
	<li>Determinar los estándares de qPCR: utilizar la dilución seriada del cDNA preparado a partir de ARN total aislado de un animal normal como un estándar de referencia para la cuantificación.</li>
	<li>Utilice BMSB 18s RNA como estándar interno para corregir las diferencias en la recuperación del RNA de tejidos32.</li>
</ol>5. vapor foliar aplicación en grandes árboles cítricos en maceta y plantas de semillero
Nota: Las plantas del cultivar cítricos citrange 'Carrizo' (Citrus sinensis XPoncirus trifoliata, Rutaceae), fueron mantenidas en un invernadero bajo luz natural y temperatura, cultivados en contenedores de 1,2 L. Las plantas fueron podadas constantemente para promover el crecimiento de nuevos brotes foliares, llamado 'ras'. ACP se prefiere para alimentación y oviposición en el nuevo crecimiento de cítricos64.
<ol><li>Seleccione plantas o plántulas y no regarla durante 2-3 días antes de utilizar dejar que el suelo seque a húmedo pero no completamente seca.</li>
	<li>Usando un rociador de bomba de mano Aplique 200 mL de solución de dsRNA (0.5 mg/mL) en el dosel inferior (Figura 4A). Nota: Preparar las mencionadas soluciones de dsARN en agua libre de DNasa/Rnasa.</li>
	<li>La aplicación del aerosol, deje que la solución de dsRNA aplicada totalmente absorbido por las hojas. Nota: Árboles absorben el dsRNA aplicada, y luego se extrajeron hojas de cualquier nuevo crecimiento o de ramas que se cubrieron antes de la aplicación, el dsARN fue detectable usando qPCR y movimiento sistémico en las hojas del dosel superior de árbol en 3-4 h44,45,46.</li>
	<li>Muestra el nuevo crecimiento de los árboles anteriormente rematadas después de 25-40 días recogiendo aproximadamente 10 hojas desde las puntas de cuatro ramas. Extraer el RNA total y analizar por transcripción reversa PCR (RT-PCR) y qPCR para la presencia del gatillo de dsARN aplicada utilizando los iniciadores figuran en la tabla 1 y descrito métodos46. Nota: La recogida de la muestra total aislamiento de RNA, RT-PCR y qPCR se realizan como se describió anteriormente46.</li>
	<li>Del mismo modo, tópico spray 10 mL dsARN a la región inferior de una planta de semillero o follaje pequeño árbol en maceta. Nota: Hemipteran insectos (ACP y GWSS) recibieron alimentación acceso normalmente a las 24 h, post tratamientos en nuevo crecimiento (hojas) que no había sido directamente rociado, o que crecieron semanas más tarde, o plantas enteras. Esto produjo que positivo probado para el dsRNA en 3, 6 y 10 días, post alimentación de insectos.</li>
</ol>6. suelo/raíz aspersión aplicación en grandes o pequeñas en maceta las plantas de semillero y árboles de cítricos
<ol><li>Seleccione plantas o plántulas y no regarla durante 2-3 días antes de utilizar dejar que el suelo seque a la humedad pero no completamente seco (esto crea espacio de aire para mantener el líquido a aplicar).</li>
	<li>1 L de solución de dsRNA (0,2 mg/mL) a la tierra de macetas grandes (aproximadamente 2,5 m) y añadir 1 L de agua (chaser) después de 1 h.</li>
	<li>Aplicar los árboles de 100 mL de solución de dsRNA (1,33 mg/mL) al suelo de 1 m de altura en maceta en suelos parcialmente secos.</li>
	<li>Para las pequeñas plántulas, aplicar 10 mL de solución de dsRNA (1 mg/mL) al suelo en los conos o a las raíces desnudas (Figura 4B, C).</li>
	<li>Permitir que las plantas que reciben la solución de dsRNA que se aplicó como un alto flujo de suelo en remojo durante 30 minutos. Luego aplicar un tratamiento sólo agua para ayudar a la absorción por las raíces (20 mL para plantas en contenedores amarillos) o 100 mL si macetas más grandes son > 1 galón. Nota: DsRNA tópico aplicado al follaje resultó en la detección de extremidades distales en la mayoría de sucursales dentro de los tratamientos post 3-6 h, mostrando movimiento sistémico a través de árboles. Nuevas ramas de crecimiento dieron positivo de dsARN en 60-90 días post tratamiento. Esquejes se proporcionan a los insectos (ACP y GWSS) en un dsRNA alimentación prueba44.</li>
</ol>7. aplicación de grifo (inyección de tronco de árbol) en grandes árboles cítricos en maceta y plantas de semillero del eje
<ol><li>Seleccione plántulas de citrus, nuevo, o aproximadamente 3,5 años viejas plantas para inyectar el dsRNA utilizando el vástago toque método (inyecciones de tronco).</li>
	<li>Perfore agujeros en las plantas cítricos usando un taladro y una broca de 10 mm, teniendo cuidado de no para exceder de 2 cm o aproximadamente la mitad del diámetro del tallo.</li>
	<li>Envuelva la punta de cobre de cada inyector 4 - 6 veces con una franja de ancho de 0,6 cm (1/4 pulgada) de la película para prevenir la pérdida de cerca de la punta.</li>
	<li>Llene los inyectores de tronco de árbol con 6 mL (1,7 mg/mL) de solución de dsRNA diluida en agua libre de DNasa/Rnasa (denotada aquí como solución coloreada).</li>
	<li>Inyectar la solución en el tronco del árbol y deje el inyector en el tronco para 6-10 h permitir la absorción de la solución de dsRNA. Permita que los insectos se alimentan de los detritos de los árboles tratados en 3, 10 y 30 días post tratamiento. Nota: El dsRNA inyectado utilizando el método de inyección de tronco persistió en los árboles durante un período de 30-60 días41,42,44. Validación de RNAi fue realizada por qPCR utilizando los iniciadores figuran en la tabla 1.</li>
</ol>8. dsARN gránulos de arcilla tratada para su entrega a los insectos a través de suelo
<ol><li>Derramar la arcilla absorbente en un tubo cónico de 50 mL hasta la marca 35 mL (aproximadamente 30 g de arcilla absorbente) en el tubo.</li>
	<li>Vierta 20 mL de solución de dsRNA diluido en agua libre de DNasa/Rnasa (100 μg/mL) en el tubo para mojar todo el absorbente. Cerrar el tubo cónico punta del tubo para ayudar a eliminar el aire y cerrar el tubo.</li>
	<li>Colocar el tubo en posición vertical y dejar reposar 1-2 min para las partículas de arcilla absorber la solución.</li>
	<li>Añadir suficiente arcilla dsARN empapado en la mezcla de suelo para llenar un recipiente de 1 galón.</li>
	<li>Mezclar y dar vuelta al suelo con la mano para mezclar bien la arcilla empapada de dsARN en el suelo.</li>
	<li>Utilice este suelo para replantar las plántulas seleccionadas para el tratamiento de dsRNA.</li>
	<li>Agua del suelo con 200 mL de agua pura sin dsRNA. Después de 30 min a 1 h, sigue con 100 mL de agua. Después de 24 h, poner la planta en un plan de riego normal.</li>
	<li>Prueba 4-6 hojas de las plantas en macetas tratadas con absorbentes de arcilla y dsRNA cada tratamiento de post mes de dsARN recogiendo las hojas más apicales de nuevo crecimiento de las plantas. Nota: Las plantas o esquejes de estas plantas tratadas se alimentan a insectos cualquier momento después de 24 h después del tratamiento y han sido capaces de RNAi para entrega hasta un año a los insectos (datos no publicados).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Arni ha demostrado para ser una herramienta importante para explorar la función biológica de genes y regulación, con gran potencial para ser utilizados para el manejo de plagas19,68,69,70, 71. el diseño y selección de un apropiado genes para silenciamiento de una determinada especie de insecto y el método de la entrega de la correspondiente dsRNA(s) al insect...

Hemipteran insectos incluyen algunas de las plagas económicamente más importantes del agriculturebecause de su capacidad para lograr un crecimiento elevado de la población y enfermedades en plantas. BMSB, H. halys Stål, es una plaga invasora que accidentalmente se introdujo en el hemisferio occidental en Allentown, Pennsylvania de Asia (China, Taiwán, Corea y Japón) con el primer avistamiento reportado en 19961. Desde su introducción, BMSB se ha detectado en 43 Estados, con las poblaciones más altas en el mediados de-Atlántico (DE, MD, PA, NJ, Virginia y WV), así como en Canadá y Europa y representa una amenaza potencial para la agricultura2. Como una plaga polífaga, BMSB puede propiciar daños a aproximadamente 300 anfitriones de la planta identificada como cultivos de alto valor tales como manzanas, uvas, plantas ornamentales, cultivos de semillas, soja y maíz. Daño es causado principalmente por el modo de alimentación conocido como lacerar y al ras cuando el animal atraviesa el cultivo del anfitrión con su estilete de la aguja para acceder a los nutrientes de los tejidos vasculares de2,3. BMSB es también una plaga interior como puede encontrar la residencia en áreas de la vida tales como escuelas y casas durante otoño invierno2. Productos químicos y aeroalérgenos lanzados por BMSB reportaron reacción alérgica ilícita en trabajadores de cultivos de frutas. BMSB también pueden contribuir a enfermedad alérgica a dermatitis por contacto, conjuntivitis y rinitis en personas sensibles4,5. Otro insecto hemipteran, la ACP, D. citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), es una grave plaga de cítricos y transmite la bacteria de la líber-limited (Candidatus Liberibacter asiaticus) causante de Huanglongbing (HLB), mejor conocido como el enverdecimiento de los cítricos la enfermedad6,7. HLB primero fue divulgado del sur de China y se ha extendido a 40 diferentes Asia, África, Oceanía, sur y América del norte países7. Enverdecimiento de los cítricos es un problema mundial con amenaza de pérdidas económicas y financieras debido a la pérdida de la fruta cítrica; por lo tanto, gestión de la ACP se considera de suma importancia para la prevención y control de HLB.
Medidas para el efectivo control de estas plagas de insectos requiere, generalmente, vivió de la aplicación de pesticidas químicos que son relativamente cortos. Estrategias de control insecticida químico a menudo carecen de estrategias de gestión ambiental segura o han disminuido la susceptibilidad debido a la resistencia a plaguicidas en las poblaciones de plagas8,9. Por lo tanto, el control biológico de plagas con bioplaguicidas molecular es una alternativa posible, pero su uso a nivel mundial sigue siendo modesto y varias especies de parasitoides (p. ej., Trisolcus japonicus) también pueden ser eficaces como natural biológica controles. RNAi es un potencial emergente tecnología para la gestión de plagas de insectos invasores con bioplaguicidas molecular10. RNAi es un mecanismo regulador del gen descrito bien que facilita el silenciamiento del gen postranscripcional eficaz de endógeno así como invadir dsRNAs de manera específica de secuencia, que finalmente lleva a la regulación de la expresión génica en el mRNA nivel11,12. Brevemente, cuando dsRNA exógeno es interiorizado en una celda que se procesa en siRNAs por un miembro de la superfamilia Rnasa III de nucleasa bidentados, llamada Dicer, que evolutivamente se conserva en gusanos, moscas, plantas, hongos y mamíferos13, 14 , 15. estos dúplex de 21-25 nucleótidos siRNA es desenrollado e integrado en el complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC) como guía RNAs. Este complejo RISC-RNA permite el emparejamiento de Watson-Crick base para el complementario objetivo mRNA; Esto conduce eventual a escote por el Argonaute proteína, un multi dominio que contiene un Rnasa H-como dominio, que degrada el ARNm correspondientes y reduce la traducción de la proteína, lo lleva a16 el silenciamiento postranscripcional del gen , 17 , 18.
ARNi para manejo de plagas requiere la introducción de dsARN en vivo para silenciar el gen de interés, activando la vía de siRNA. Diversos métodos que se han utilizado para la entrega de dsRNA a insectos y células de los insectos para inducir RNAi sistémica incluyen alimentación10,19, remojo de20,21, microinyección22, portadores tales como liposomas 23y otras técnicas24. RNAi era primer demostrado en Caenorhabditis elegans para silenciar la expresión del gen unc-22 por incendio y Mello25, seguido por la caída en la expresión de los genes encrespados en Drosophila melanogaster26. Estudios funcionales iniciales utilizan microinyección para ofrecer dsARN en insectos, como Apis mellifera22,27, Acyrthosiphon pisum28, Blattella germanica29, Halys H.30y los insectos lepidópteros (revisados por Terenius et al. 31). microinyección es ventajoso para entregar una dosis exacta y precisa en el sitio de interés en el insecto. Aunque tales pinchazos sépticos pueden provocar expresión de genes relacionados inmunes debido a trauma32, por lo tanto, descartando su practicidad en el desarrollo agrícola biopesticidas.
Otro método de entrega de dsARN en vivo es por inmersión, que consiste en la ingestión o absorción de dsARN por suspensión de células o animales generalmente en el medio extracelular que contiene dsARN. Remojo se ha utilizado eficientemente inducir RNAi en células de cultivo de tejidos de Drosophila S2 para inhibir Downstream de Raf1 (DSOR1) mitógeno-activada proteína kinasa kinasa (MAPKK)20, así como en C. elegans para silenciar a la POS-1 gen33. Sin embargo, es menos eficiente para inducir RNAi en comparación con microinyección20dsARN entregado mediante remojo. RNAi mediado silenciar en un insecto masticación era primer demostrado en el rootworm occidental del maíz (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera) por infundir el dsRNA en un agar artificial dieta10. Informes anteriores han resumido métodos para entregar dsARN infundido en dietas naturales específicas de artrópodos34. Estos métodos de entrega fueron determinados más eficaz comparable a medios artificiales de la entrega; como en el caso de la mosca tsetsé (Glossina morsitans morsitans), donde observó caída igual de un gen relacionado con inmune cuando dsARN fue entregado a través de la harina de sangre o microinyectados35. Del mismo modo, entrega de dsRNA a través de gotitas de luz marrón manzana polilla (postvittana de Epiphyas)36, larvas de polilla del diamondback (xylostella de Plutella)37, así como las abejas de miel38,39 inducida por ARNi eficiente. Más eficaces experimentos de RNAi en hemipteran han utilizado la inyección de dsRNA40 porque entrega oral de dsARN en insectos hemipteran es ardua ya que deben ser entregado a través de los tejidos vasculares de la planta huésped. Arni eficaz también fue observado en ACP y saltahojas de la Chicharrita de alas cristalinas (GWSS), Homalodisca vitripennis: dsARN fue entregado a través de cítricos y vides que habían absorbido dsARN en los tejidos vasculares a través de la raíz para lavar los ojos, foliar aerosoles, las inyecciones de tronco o absorción por cortes41,42,43,44,45,46. Esto también dio lugar a la primera patente de dsRNA contra el ACP (2016, nos 20170211082 A1). Entrega de siRNA y dsRNA utilizando portadores tales como nanopartículas y liposomas imparte estabilidad y aumentos en la eficacia de dsARN entregados están surgiendo rápidamente23,47,48,49 ,50. Una nueva clase de vehículos de entrega basados en nanopartículas para los ácidos nucleicos para in vitro y en vivo que fue específicamente para aplicaciones terapéuticas pueden impartir inmenso potencial como vectores de entrega adecuado51. Nanopartículas como un vehículo de entrega para el dsRNA pueden tener desventajas incluyendo solubilidad, hidrofobicidad o bioacumulación limitada52, pero una entrega ayudar a polímero adecuado puede compensar estas desventajas. Desarrollo y uso de la entrega de nucleótidos están surgiendo también llamados 'oligonucleótidos antisentidos', que son solo trenzados RNA/DNA dúplex46.
Vitelogénesis en los artrópodos es un proceso de control de reproducción y regulada por la hormona juvenil (JH) o ecdisona, que son los principales inductores de Vg síntesis de la grasa corporal; el Vg se toma finalmente por el ovocito en desarrollo via Vg de endocitosis mediada por receptores53. VG es un grupo de polipéptidos sintetizados extraovarially, que es esencial para el desarrollo de la proteína de yema de huevo grandes, vitelino54,55, y por lo tanto, es importante en la reproducción y envejecimiento56. VG ha sido silenciado con éxito en nematodos57 , así como en miel de abeja (Apis mellifera) donde RNAi mediado agotamiento de Vg se observa en adultos y huevos22. Arni silenciamiento génico postranscripcional mediada del Vg fue probado porque se pensaba que su disminución provocaría un efecto fenotípico observable tales como reduce la fertilidad y la fecundidad, para potencialmente ayudar en el control de BMSB. El gen JHAMT que codifica la S-adenosil-L-metionina (SAM)-dependiente JH ácido O-metiltransferasa, cataliza el paso final de la JH biosíntesis camino58. En esta vía farnesil pirofosfato (FPP) se transforma secuencialmente de farnesol, farnesoic ácido seguido por la conversión de farnesoate metílico a JH por JHAMT. Esta vía se conserva en insectos y artrópodos específicamente para metamorfosis, un proceso de desarrollo está regulado por hormonas59,60,61. De B. mori, expresión de genes JHAMT y la actividad biosintética de JH en la Corpora allata sugieren que la supresión transcripcional del gen JHAMT es crucial para la terminación de JH biosíntesis58. Por lo tanto, los genes JHAMT y Vg se seleccionaron para agotamiento objetivo utilizando RNAi. RNAi también se probó en cítricos para el control de la ACP y GWSS. Árboles de cítricos fueron tratados con el dsRNA mediante aspersión de raíz, tallo tap (las inyecciones de tronco), así como aplicaciones foliares con dsRNAs contra insectos específicos arginina quinasa (AK) transcripciones42,44. La aplicación tópica de dsARN se detectó en las copas de los árboles, indicando una entrega eficiente a través de los tejidos vasculares de las plantas y resultó en aumento de la mortalidad en el ACP y GWSS41,42, 45.
En el estudio actual, hemos identificado un método de entrega de dieta natural para tratamientos como el dsRNA. Esta técnica recién desarrollada fue utilizada posteriormente para silenciar la JHAMT y Vg mRNA usando dsARNs específicos gene en ninfas BMSB como demostrado anterior62. Estos nuevos protocolos de entrega demostrados aquí reemplazan RNA entrega los sistemas convencionales que utilizan aerosoles tópicos o microinyecciones. Verduras y frutas, madre grifo, tierra mojada y absorbentes de la arcilla en pueden utilizarse para la administración de dsRNA, que es fundamental para el desarrollo de la gestión de plagas y patógenos de bioplaguicida.

<table><tbody><tr><td>BMSB (H. halys) insectos&nbsp;</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACP (D. citri) insectos&nbsp;</td>Judías verdes orgánicas <td>del USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plantas de cítricos</td> Solución de hipoclorito de sodio <td>del USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>J.T. Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>colorante alimentario verde&nbsp;</td><td>McCormick & Co., Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámaras Thermo Forma&nbsp;</td><td>Recipiente Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magenta (Cultura)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primers&nbsp;</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SensiMix SYBR</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qPCR ABI 7500</td><td>Biosystems aplicados&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Botella</td><td>de spray N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>American Can Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

double-stranded rna oral entrega métodos para inducir la interferencia de arn en floema e insectos hemipteran alimentación planta de sap

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Floema y planta sap alimentación insectos invaden la integridad de los cultivos y frutas para recuperar nutrientes, en el proceso de daños en los cultivos de alimentos. Hemipteran insectos representan un número de plagas económicamente importantes de plantas que causan daños a las cosechas al alimentarse de la savia del floema. El marrón apestosa chinche (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae) y el psílido asiático de los cítricos (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) son insectos hemipteran introducidos en América del norte, donde se son una plaga invasiva agrícola de alto valor especiales, fila y cultivos básicos y cítricos, así como una plaga de molestia cuando agregan en el interior. Resistencia a los insecticidas en muchas especies ha llevado al desarrollo de métodos alternativos de estrategias de manejo de plagas. Double-stranded RNA (dsRNA)-mediada por ARN de interferencia (ARNi) es un mecanismo para estudios de genómica funcional que tiene aplicaciones potenciales como una herramienta para la gestión de plagas de insectos el silenciamiento del gen. DsRNA exógeno sintetizada o ARN interferente pequeño (siRNA) puede desencadenar silenciamiento altamente eficiente a través de la degradación de ARN endógeno, que es homólogo al que se presentó. Uso eficaz y ambiental de RNAi como molecular bioplaguicidas para control biológico de insectos hemipteran requiere la entrega en vivo de dsRNAs mediante la alimentación. Aquí demostramos métodos para entrega de dsRNA a insectos: carga de dsARN en judías verdes por inmersión y absorción de dsRNA gene-específico con administración oral a través de la ingestión. También hemos esbozado enfoques de entrega de planta no transgénica mediante aplicaciones foliares, alto flujo de raíz, las inyecciones de tronco, así como gránulos de arcilla, que puede ser esencial para la liberación sostenida de dsRNA. Entrega eficiente de dsARN oral injerida se confirmó como una dosis efectiva para inducir una disminución significativa en la expresión de genes específicos, como la hormona juvenil el ácido O-metiltransferasa (JHAMT) y vitelogenina (Vg). Estos métodos innovadores representan estrategias para la administración de dsRNA a utilizar en la protección de cultivos y superar retos ambientales para el manejo de plagas.

Entrega de verduras dsARN mediada a través de la alimentación en ninfas de instar BMSB 4th fue probada para el desarrollo de bioplaguicidas molecular utilizando RNAi para plagas invasoras. Alimentación de BMSBs con sus estiletes de aguja por un mecanismo conocido como lacerar y enjuague, que causa daños considerables a los cultivos. Ejotes orgánicos delgados, p. vulgaris L., se utilizaron para probar si nutrientes o dsRNA podría ser entregado en vivo en BMSB a...

Este artículo muestra nuevas técnicas desarrolladas para la entrega oral de ARN bicatenario (dsRNA) a través de los tejidos vasculares de las plantas para ARN de interferencia (ARNi) en la savia del floema insectos.

Double-stranded RNA Oral entrega métodos para inducir la interferencia de ARN en floema e insectos Hemipteran alimentación planta de sap

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

El objetivo general de estos procedimientos es demostrar un método de administración oral natural. En el caso de los dsRNAs específicos de genes, para inducir interferencias de ARN in vivo y plagas de insectos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo administrar biomoléculas dentro de los insectos, para dilucidar el efecto de los biopesticidas moleculares basados en ARNi y para controlar los insectos en el medio ambiente.La principal ventaja de esta técnica es que esta entrega a través del silenciamiento génico mediado por ácidos nucleicos se puede aplicar a la alimentación de la savia de las plantas, así como a los insectos masticadores. Aunque los métodos aquí demuestran la entrega de ARN bicatenario a plagas de hemípteros, como la chinche apestosa marrón marmórea, la chinche arlequín y el psílido asiático de los cítricos. Se pueden aplicar a otros insectos.Para comenzar el protocolo, seleccione una chinche apestosa marrón marmórea de 4º estadio temprano, o ninfas BMSB, eclosionadas de la masa de huevos, y matándolas de hambre durante 24 horas antes de la alimentación con dsRNA. A continuación, seleccione judías verdes delgadas y orgánicas certificadas y lávelas con una solución de hipoclorito de sodio al 0,2% durante cinco minutos. Siga con tres lavados de H2O de doble destilación y deje que los granos se sequen al aire.Una vez que estén secas, recorte las judías verdes desde el extremo del cáliz hasta una longitud total de 7,5 centímetros con una cuchilla de afeitar limpia. Sumerja las judías verdes lavadas y recortadas en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros sin tapa que contenga 300 microlitros de solución de control. Realice diluciones de los lac Z, JHAMT o VGDSRNA sintetizados in vitro, diluyendo 5 microgramos, o 20 microgramos, y 300 microlitros de ARN, agua libre de ADN para obtener concentraciones finales de 0,017 microgramos por microlitro, o 0,067 microgramos por microlitro respectivamente.Sumerja las judías verdes lavadas y recortadas en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros sin tapa, que contenga 300 microlitros de solución de dsRNA. Envuelva y selle los bordes de los tubos de microcentrífuga, encerrando los frijoles sumergidos para evitar la evaporación de la solución de dsRNA y para evitar que los animales ingresen al tubo de microcentrífuga. Coloque los tubos en posición vertical a temperatura ambiente durante tres horas, para permitir que la solución de dsRNA se cargue en todo el frijol verde por acción capilar.Coloque los tubos en recipientes de cultivo limpios de polipropileno y coloque 3 ninfas hambrientas de 4th Instar BMSB en los recipientes de cultivo. Trate tres insectos por recipiente de cultivo. Cada uno contiene tres judías verdes con colorante alimentario verde o solución de dsRNA.Mantener los insectos a 25 grados centígrados y 72% de humedad relativa, bajo un régimen de 16L, 8D fotoperiodo en una incubadora. Permita que los insectos se alimenten de las judías verdes sumergidas y absorbidas en dsRNA durante cinco días, y repóngalas con dietas frescas de judías verdes tratadas con dsRNA después de tres días. Seleccione plantas o plántulas, y no las riegue durante dos o tres días antes de usarlas, para dejar que la tierra se seque hasta la humedad, pero no completamente seca.Con una botella rociadora bombeada a mano, aplique 200 mililitros de solución de dsRNA en el dosel inferior. Muestree el nuevo crecimiento de los árboles previamente desmochados después de 25 a 40 días, recolectando aproximadamente 10 hojas de las puntas de cuatro ramas. Extraiga el ARN total y analícelo por RT-PCR y qPCR para detectar la presencia del desencadenante de dsRNA aplicado.Del mismo modo, rocíe tópicamente 10 mililitros de dsRNA en la región inferior de una plántula o follaje de un árbol en maceta pequeña. Seleccione plantas o plántulas, y no las riegue durante dos o tres días antes de usarlas, para dejar que la tierra se seque, se humedezca, pero no se seque completamente. A continuación, agregue un litro de solución de dsRNA al suelo de las plantas en macetas grandes.Agrega un litro de agua después de una hora. Aplique 100 mililitros de solución de dsRNA al suelo de árboles en macetas de un metro de altura en suelos parcialmente secos. Deje que las plantas reciban la solución de dsRNA como un empapado de tierra, para remojar durante 30 minutos.A continuación, aplique un tratamiento de solo agua para ayudar a la absorción por parte de las raíces. Seleccione plántulas de cítricos, plantas nuevas o de aproximadamente 3,5 años para inyectar dsRNA utilizando el grifo del tallo, también conocido como el método de inyecciones en el tronco. Envuelva la punta de cobre de cada inyector de cuatro a seis veces con una tira de película para techo de 0,6 centímetros de ancho para evitar fugas cerca de la punta.A continuación, llene los inyectores de tronco de árbol con seis mililitros de solución de dsRNA diluida con ADN, agua libre de ARN. Perfore agujeros en las plantas de cítricos con una broca de 10 mililitros y tenga cuidado de no exceder los dos centímetros, o aproximadamente la mitad del diámetro del tallo. Luego, inyecte la solución en el tronco del árbol y deje el inyector en el tronco durante seis a 10 horas para permitir la absorción de la solución de dsRNA.Deje que los insectos se alimenten de los esquejes de los árboles tratados a los 3, 10 y 30 días después del tratamiento. Vierta 30 gramos del absorbente de arcilla en un tubo cónico de 50 mililitros hasta la marca de 35 mililitros. Vierta 20 mililitros de solución de dsRNA diluida en ADN, agua libre de ARN en el tubo para humedecer todo el absorbente.Tape el tubo cónico, incline el tubo para ayudar a eliminar el aire, coloque el tubo en posición vertical y déjelo reposar durante uno o dos minutos mientras las partículas de arcilla absorben la solución. Agregue suficiente arcilla empapada en dsRNA a la mezcla de tierra para llenar una maceta de un galón. Mezcle y voltee la tierra a mano para mezclar completamente la arcilla empapada en dsRNA en el suelo.Utilice la tierra para trasplantar las plántulas seleccionadas para el tratamiento con dsRNA. Riegue el suelo con 200 mililitros de agua corriente, sin dsRNA, después de 30 minutos a una hora. Siga con 100 mililitros de agua corriente.Después de 24 horas, ponga la planta en un horario de riego normal. Pruebe de cuatro a seis hojas de las plantas en macetas tratadas con absorbentes de arcilla y dsRNA cada mes, después del tratamiento para dsRNA, recolectando las hojas más apicales del crecimiento de nuevas plantas. La QPCR de segmentos de judías verdes inmersos en dsRNA sintetizado in vitro, específico para la chinche apestosa marrón marmórea, o ARNm de BMSB, indicó la inducción exitosa de ARNi ya que la expresión de los objetivos JHAMT y Vg se redujo significativamente in vivo.Este método de administración también es efectivo en otra plaga de hemípteros, el insecto arlequín. Como lo indican sus excrementos de color verde. Después de ver estas demostraciones visuales, debe tener una buena comprensión de cómo administrar ARN bicatenario a los insectos a través de la ingestión oral para inducir insectos ARNi in vivo.Los avances que se están realizando en la tecnología de nucelótidos de ARNi continúan ampliando las capacidades de los investigadores para modular el ARN, la expresión génica y los niveles de proteínas en una amplia gama de organismos vivos. Esto va desde las plantas, hasta los insectos y los microorganismos más difíciles. Por lo tanto, mientras el costo de producción de ARN de doble cadena continúa disminuyendo, y los métodos de administración y estabilidad continúan mejorando, el futuro de las tecnologías de ARNi continuará utilizándose para resolver problemas complejos emergentes.

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Interferencia de ARN en el parasitoide del huevo, Trichogramma dendrolimi Matsumura

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Double-stranded RNA Oral entrega métodos para inducir la interferencia de ARN en floema e insectos Hemipteran alimentación planta de sap (Video) | JoVE Journal

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