Neovascularization del diafragma como un modelo de ratón de iridis del rubeosis inducida por la punción
8 de marzo de 2018
Neovascularization del diafragma, una complicación común de la enfermedad de retina isquémica, puede llevar a glaucoma neovascular avistar-que amenaza. Aquí, describimos un protocolo murino para inducir neovascularización de iris experimental que puede utilizarse para la evaluación no invasiva de las sustancias de modulación de angiogénesis.
El objetivo general de este procedimiento es inducir la vasculatura del iris, lo que permite la visualización directa in vivo de los procesos angiogénicos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la oftalmología, particularmente en enfermedades neovasculares. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza ratones albinos para permitir la visualización directa en vivo de los vasos sanguíneos.
A través de este método se puede dar una idea de la enfermedad neovascular ocular. También se puede aplicar como modelo general de angiogénesis, como pruebas para nuevas terapias angiogénicas. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la disección del iris es un desafío debido al pequeño tamaño del ojo del ratón.
Con la práctica, sin embargo, se puede dominar. Después de anestesiar un ratón P12.5 y prepararlo para el procedimiento, colóquelo en la posición de decúbito lateral debajo de un estereoscopio y confirme que la máscara esté bien colocada. El ojo debe llenar el campo de visión.
Es imperativo un enfoque claro del ojo. A continuación, utilizando pequeñas pinzas de atado en la mano no dominante, protruya cuidadosamente el ojo aplicando presión hacia abajo en los párpados, dorsal y ventral al ojo. Mantener un agarre firme en el párpado ayuda.
Antes de continuar, documente fotográficamente la vasculatura a 40X. A continuación, utilice el estereoscopio para localizar el limbo corneal. El limbo de los ratones albinos BALB/c se puede identificar fácilmente como el plexo vascular circular posterior a la córnea.
Ahora, en la mano dominante, sostenga una aguja biselada de calibre 30 y utilícela para realizar una pequeña punción uveal cerca del límite limbal posterior de la úvea entre el cuerpo ciliar y la ora serrata. Realice la punción usando solo la punta de la aguja y no más de la mitad del bisel. Evite romper la lente.
La punción debe ser autosellante, pero aún así permitir la inyección intraocular de sustancias de estudio a través de la herida. A continuación, realice una segunda punción uveal en el sitio opuesto del ojo. Optimizar los pinchazos para que estén en las posiciones más dorsal y más ventral.
Repetir las punciones uveales en las mismas dos posiciones cada cuatro días hasta P24.5. Y antes de repetir la punción, compruebe siempre si hay cataratas traumáticas. Después de enuclear el ojo y fijarlo como se describe en el protocolo de texto, retire la solución fijadora y enjuague el ojo tres veces con PBS fresco.
Luego, coloque el ojo sobre una superficie lisa y seca con la cámara anterior hacia arriba. A continuación, inserte una aguja biselada de calibre 30 posterior al limbo para hacer un punto de entrada. Luego, asegure el segmento anterior con pequeñas pinzas de atado y use las tijeras rectas Clayman-Vannas para cortar alrededor del limbo mientras gira el ojo.
El uso de cortes parciales puede facilitar el proceso. Una vez completado, el segmento posterior del ojo debe liberarse. A continuación, coloque el segmento anterior hacia abajo para exponer la lente.
Retire la lente con cuidado agarrándola con pinzas pequeñas y tirando hacia arriba. Ahora, coloque el segmento anterior con la córnea hacia abajo y con el corte perpendicular al campo de visión. Luego, agarre suavemente el tejido posterior al cuerpo ciliar con pequeñas pinzas de atado en la mano no dominante.
Tijeras rectas Clayman-Vannas para recortar justo antes del cuerpo ciliar con el objetivo de eliminar la malla trabecular y aislar el iris. Luego, el iris debe moverse dentro de la córnea. A continuación, utilice unas pequeñas pinzas de atado para sujetar la córnea y transfiera con cuidado la copa anterior del ojo a una placa de 96 pocillos que contenga 200 microlitros de PBS.
Mantenga el agarre de la córnea y continúe diseccionando el iris enjuagando el tejido con PBS. Si es necesario, se puede usar una aguja de calibre 30 para ayudar a desplazar el iris. Ahora, retire la córnea con las pinzas de atación pequeñas.
El iris aislado se puede almacenar en PBS a cuatro grados centígrados temporalmente hasta que se experimente con él. Los ratones albinos BALB/c a P12.5 fueron sometidos a punciones uveales repetidas cada cuatro días hasta P24.5, como se describe. Debido a la transparencia de la córnea y a la deficiencia de melanina de los ratones BALB/c, la vasculatura del iris es fácilmente visible en las crías de P16.5 y se intensifica a lo largo de la duración del protocolo.
En P27.5, los ratones fueron sacrificados y sus iris fueron cuidadosamente diseccionados. Las punciones indujeron una respuesta vascular del iris al activar el sistema de cicatrización de la herida. Se realizó inmunohistoquímica frente a PECAM1.
La tinción resultante mostró un aumento de la vasculatura general en los iris de los ojos perforados en comparación con los controles. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir la angiogénesis del iris y aislar con éxito el iris del ratón. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el QBCR para responder a preguntas moleculares y celulares adicionales, como probar la eficacia de sustancias proangiogénicas o antiangiogénicas.
Tras su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores exploren las enfermedades neovasculares mediante métodos in vivo y no invasivos utilizando pequeños roedores como modelo.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo murino para inducir neovascularización del iris, una afección asociada a enfermedades retinianas isquémicas y glaucoma neovascular. El método permite la evaluación no invasiva de sustancias que modulan la angiogénesis mediante la visualización directa in vivo de la vasculatura del iris.
Componentes Clave del Estudio
Área de Ciencia
- Oftalmología
- Angiogénesis
- Enfermedades neovasculares
Antecedentes
- La neovascularización del iris puede amenazar la visión.
- Comprender la angiogénesis es fundamental para desarrollar terapias.
- El uso de ratones albinos facilita la visualización de los vasos sanguíneos.
- Existen dificultades en la disección del iris debido al pequeño tamaño del ojo del ratón.
Objetivo del estudio
- Inducir la vasculatura del iris para estudios in vivo.
- Proporcionar información sobre enfermedades oculares neovasculares.
- Evaluar nuevas terapias angiogénicas.
Métodos Utilizados
- Inducción de neovascularización del iris en ratones albinos.
- Técnicas de visualización in vivo.
- Evaluación experimental de sustancias moduladoras de la angiogénesis.
- Demostración de técnicas de disección del iris.
Resultados principales
- Inducción exitosa de la neovascularización del iris.
- Visualización efectiva de los procesos angiogénicos.
- Conocimientos obtenidos sobre los mecanismos de las enfermedades neovasculares.
- Aplicaciones potenciales para probar nuevas terapias.
Conclusiones
- El método proporciona una herramienta valiosa para estudiar la neovascularización del iris.
- Mejora la comprensión de las enfermedades oculares neovasculares.
- Las investigaciones futuras pueden utilizar este modelo para pruebas terapéuticas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este modelo permite la evaluación no invasiva y longitudinal de los procesos angiogénicos en el iris, lo que apoya la validación temprana de dianas para terapias antiangiogénicas. Al aprovechar la transparencia de los ojos de ratones albinos, proporciona una plataforma escalable para evaluar moduladores angiogénicos en un contexto ocular relevante para la enfermedad. El enfoque reduce la dependencia de la histología de punto final y mejora la confianza predictiva en el cribado preclínico de angiogénesis.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de las vías angiogénicas mediante la neovascularización inducible del iris impulsada por sistemas inflamatorios y activadores del plasminógeno.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de objetivos mediante punciones uveales repetibles y autorreparables que desencadenan una respuesta vascular medible.
- Valor predictivo: Facilita la reducción mecanicista de riesgos al permitir la visualización directa in vivo de la modulación de la angiogénesis a lo largo del tiempo.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Proporciona una lectura angiogénica cuantificable mediante inmunohistoquímica para PECAM1 e imagenología no invasiva in vivo a través de la córnea transparente.
- Valor operativo: Permite una inducción vascular estandarizada y repetible cada cuatro días desde P12.5 hasta P24.5, favoreciendo la reproducibilidad del ensayo.
- Valor de escalabilidad: Compatible con la preparación en montaje plano de iris semitransparentes de BALB/c para análisis inmunohistoquímico de alta resolución con bajo fondo.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor traslacional: Modela la patogénesis del glaucoma neovascular, una complicación amenazante para la vista en la retinopatía diabética, lo que aumenta la relevancia de la enfermedad.
- Continuidad preclínica: Permite la evaluación de sustancias proangiogénicas o antiangiogénicas in vivo, conectando el descubrimiento con la evaluación terapéutica.
- Avance ajustado al riesgo: Permite el monitoreo longitudinal de la respuesta vascular, apoyando decisiones de continuidad o interrupción según la eficacia angiogénica.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento de la angiogénesis, desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la validación preclínica de la eficacia de moduladores, particularmente en programas de enfermedades neovasculares oculares.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la aclaración de vías al inducir angiogénesis mediante la cicatrización de heridas y factores inflamatorios en el iris.
- Selección: Proporciona resultados vasculares cuantitativos y reproducibles, adecuados para la selección de sustancias angiogénicas en un contexto de tejido vivo.
- Análisis: Permite el análisis de la densidad y morfología vascular mediante tinción con PECAM1 y obtención de imágenes in vivo, facilitando la evaluación comparativa entre condiciones.
- Investigación Traducional: Modela los mecanismos de la glaucoma neovascular humano, apoyando la validación preclínica alineada con biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable de inducción vascular aplicable en múltiples proyectos centrados en angiogénesis.
Impacto Operacional y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en el objetivo al modelar la neovascularización del iris similar a la humana, impulsada por vías angiogénicas conservadas.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante la estandarización del momento de la punción, la selección del sitio y el monitoreo posoperatorio en el caso de catarata traumática.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir lecturas de eficacia tempranas y no invasivas que reducen el riesgo de fracaso en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de candidatos angiogénicos basándose en la respuesta vascular del iris in vivo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de microcirugía, incluyendo punción uveal y aislamiento del iris con guía estereoscópica.
- Depende de instrumentación como agujas biseladas de calibre 30, pinzas de anudado y tijeras de Clayman-Vannas para una manipulación precisa de los tejidos.
- Necesita protocolos estandarizados para el momento de la punción (cada 4 días desde P12.5 hasta P24.5) y para el monitoreo postoperatorio, a fin de garantizar la consistencia del modelo.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen variaciones en la pigmentación de la cepa de ratón y en la transparencia corneal, que afectan la calidad de la visualización vascular.
- Las limitaciones prácticas incluyen la dificultad técnica del disección del iris debido al pequeño tamaño del ojo, lo que requiere entrenamiento para lograr un aislamiento confiable del tejido.
