Cuantificación espacial de fármacos en lesiones de Tuberculosis pulmonar por Laser Capture Microdissection líquido cromatografía espectrometría de masas (LCM-LC/MS)

El objetivo general de esta técnica analítica es cuantificar el fármaco antituberculoso etambutol dentro de los compartimentos tisulares de las lesiones pulmonares tuberculosas para determinar si se están alcanzando las concentraciones del fármaco bactericida. Este método puede responder a preguntas en el campo del descubrimiento y desarrollo de fármacos contra la tuberculosis al determinar si los fármacos administrados están llegando a las poblaciones bacterianas en concentraciones esterilizantes dentro de todos los compartimentos de tejido del granuloma. La principal ventaja de esta técnica es que permite la cuantificación completa de las concentraciones de fármacos con gran detalle espacial dentro de estructuras de tejidos y poblaciones celulares específicas.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de corte y montaje del tejido son difíciles de aprender debido al potencial de contaminación del tejido y la naturaleza frágil de los portaobjetos de la membrana. Comience este procedimiento con la recolección de tejido como se describe en el protocolo de texto. Para realizar el corte de tejido, primero ajuste el criostato a la temperatura de corte deseada.

Transfiera la biopsia de pulmón irradiada con rayos gamma del almacenamiento a menos 80 grados Celsius al criostato y déjela actuar durante 30 minutos para equilibrar la temperatura del tejido. Con unas pinzas, fije la biopsia al mandril de criostato con una pequeña cantidad de adhesivo para la temperatura óptima de corte para adherir la base del tejido al mandril. Oriente el tejido de modo que la superficie plana sea la superficie expuesta para cortar.

Asegúrese de que la OCT no contamine la superficie del tejido, ya que esto puede interferir con el análisis de espectrometría de masas posterior. Corte tres secciones de tejido de 25 micras de grosor y móntelas en portaobjetos de membrana de PET. Toque suavemente la membrana con la sección de tejido y retire la sección.

Si se aplica demasiada presión, la membrana delgada puede romperse. Evite la manipulación excesiva del portaobjetos antes del montaje para no cargar la membrana de PET y disminuir la adherencia de la sección de tejido. Mantenga el portaobjetos de la membrana a temperatura ambiente para permitir el montaje en descongelación y la adhesión exitosa del tejido a la membrana.

Retire el portaobjetos del criostato y deje que el portaobjetos se seque al aire durante tres minutos. Si LCM-LC-MS/MS no se va a realizar inmediatamente, selle el portaobjetos en una pequeña bolsa hermética con cierre hermético y transfiéralo al almacenamiento de menos 80 grados Celsius hasta que sea necesario para la disección. Corte una sección adyacente de 10 a 12 micras y descongele el montaje en un portaobjetos de vidrio estándar para la tinción con hematoxilina y eosina.

Se pueden cortar secciones adicionales en este momento para otras tinciones histoquímicas deseadas. Retire la bolsa sellada que contiene el portaobjetos del almacenamiento a menos 80 grados centígrados y deje que alcance la temperatura ambiente durante cinco minutos. Si el portaobjetos frío se expone inmediatamente a la atmósfera del laboratorio, el tejido se cubrirá de condensación y la integridad espacial del fármaco puede verse comprometida.

Encienda el microscopio y el láser. El láser requiere de cinco a 10 minutos para calentarse antes de que pueda comenzar el corte. Cargue tubos de PCR de tapa plana de 0,20 mililitros en el soporte.

Después de retirar el portaobjetos de la bolsa, tome una imagen óptica de la sección de tejido en el portaobjetos PET utilizando un escáner plano. Coloque el portaobjetos en el portaobjetos, con el pañuelo hacia abajo. Asigne tubos de recolección separados a regiones específicas de granuloma de interés utilizando el software del microscopio.

Por lo general, estos serán pulmón no comprometido, granuloma celular y caseum, pero pueden variar según la patología específica de la biopsia de granuloma. Concéntrese en el tejido utilizando el objetivo de microscopio 5X. Este aumento debe proporcionar una buena visión general del tejido que contiene áreas de granuloma celular y necrótico.

En el software, seleccione el tubo designado caseum para moverlo a su posición debajo del tejido. Introduzca los parámetros de disección deseados. Los ajustes típicos para una sección pulmonar de 25 micras de grosor son potencia láser 30, velocidad 15 y apertura 35.

Sin embargo, estos diferirán según el microscopio utilizado y la posible disminución de la potencia debido a la antigüedad del láser. Seleccione la herramienta Dibujo libre y, con un ratón o un lápiz con pantalla táctil, delinee la región deseada para la disección. El área de superficie de la región se mostrará en el software.

Mantenga las regiones seleccionadas por debajo de 500.000 micras cuadradas para facilitar la disección. Repita la disección hasta que se hayan recogido tres millones de micras cuadradas en total en la tapa del tubo. En ocasiones, la región disecada puede permanecer adherida a la membrana circundante y no caer en la tapa de recolección.

Elimine estas regiones del área de superficie total acumulada seleccionándolas y eliminándolas manualmente dentro del software. A continuación, seleccione la tapa para la lesión celular y recoja tres millones de micras cuadradas de tejido utilizando el mismo proceso. Seleccione la tapa para el pulmón no comprometido y recoja tres millones de micras cuadradas de tejido utilizando el mismo proceso.

Tenga en cuenta que el tejido pulmonar no comprometido contiene muchos bronquiolos y espacios alveolares. Preste mucha atención para excluirlos de las regiones de tejido definidas para la disección. Retire el soporte de la tapa y desenganche, selle y etiquete con cuidado cada tubo.

Proteja los tejidos disecados de las perturbaciones del aire circundante. Analice los tejidos disecados inmediatamente, o almacene a menos 80 grados Celsius y descongele antes del procesamiento y el análisis de LC/MS. Suponiendo una densidad de tejido de un gramo por mililitro, prepare el stock homogeneizado pesando 50 miligramos de tejido de control y añadiendo tampón PBS para diluir.

Homogeneizar el tejido batiendo el tejido pulmonar y el tampón PBS durante cinco minutos a 1750 rpm en un homogeneizador de perlas. A continuación, diluya un miligramo por mililitro de existencias de fármaco en acetonitrilo/agua uno a uno para crear soluciones estándar de aumento de curvas. Determine las concentraciones estándar de picos en función del volumen de la espícula y el volumen del tejido objetivo.

El ejemplo ilustrado es para un estándar de 100 nanogramos por mililitro utilizando un volumen de pico de 10 microlitros. Retire los tubos que contienen el tejido microdisecado del almacenamiento a menos 80 grados centígrados y déjelos alcanzar la temperatura ambiente durante cinco minutos. Agregue 10 microlitros de solución de acetonitrilo/agua uno a uno y dos microlitros de tampón PBS a los tubos que contienen el tejido microdisecado.

Para tubos de control de calidad y curva estándar, agregue 10 microlitros de solución de aumento a dos microlitros de homogeneizado pulmonar de control. Agregue 50 microlitros de solución de extracción a cada tubo. Agite cada tubo durante cinco minutos.

Luego, sónicalos durante cinco minutos. A continuación, centrifuga los tubos a 5.000 rpm durante cinco minutos para formar una bolita de película y tejido en cada tubo. Después de la centrifugación, transfiera 50 microlitros de sobrenadante a una placa de pocillo profundo de 96 pocillos y diluya con 50 microlitros adicionales de agua desionizada en cada pocillo.

Por último, realice el análisis LC-MS/MS y la validación del método como se describe en el protocolo de texto. El método LCM-LC/MS se validó por primera vez mediante el análisis de regiones microdiseccionadas con láser a partir de un homogeneizado de tejido con etambutol. Como se muestra aquí, el método fue altamente reproducible y demostró una excelente recuperación del fármaco.

Las concentraciones de etambutol medidas por LCM-LC/MS en múltiples tejidos pulmonares se validaron aún más mediante comparación directa con las concentraciones determinadas por un enfoque de LC/MS establecido. Ambas técnicas detectaron concentraciones equivalentes. Las concentraciones absolutas de etambutol en el parénquima pulmonar no comprometido, el borde de la lesión celular y el caseum necrótico se determinaron mediante LCM-LC/MS.

Se alcanzaron niveles de esterilización por Mycobacterium tuberculosis en todos los compartimentos de las lesiones. Se indican las concentraciones mínimas necesarias para matar el 99% de los bacilos replicantes extracelulares y el 99% de los bacilos intracelulares en los macrófagos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo microdiseccionar tejidos y cuantificar los niveles de fármaco dentro de estructuras definidas de granuloma pulmonar.

Esta técnica permite a los investigadores en el campo de la investigación de fármacos antimicrobianos evaluar de forma precisa y cuantitativa si los fármacos administrados están llegando a las poblaciones de patógenos objetivo en concentraciones esterilizantes. Este enfoque tiene una amplia aplicabilidad a muchos tejidos y estados de enfermedad diferentes.