Cinta-cáscara de estomas: Un método mejorado para la preparación de la muestra de protector de la célula
July 15th, 2018
Este protocolo describe un método de preparación enriquecida de las células de guardia estomáticos que es útil para estudios fisiológicos y otros biológicos.
El objetivo general de este experimento es preparar células protectoras de estomas enriquecidas de alta calidad para análisis fisiológicos, bioquímicos y moleculares, como transcriptómica, proteómica y metabolómica. Hola, mi nombre es Sheldon Lawrence. Soy estudiante de posgrado en el laboratorio del Dr. Chen en el Departamento de Biología de la Universidad de Florida.
Hoy voy a mostrarte cómo aislar células protectoras del tejido de las hojas de las plantas que son material útil para estudiar tanto la fisiología como la biología de los estomas. Este método se considera un método novedoso para aislar las células protectoras. Permite específicamente el enriquecimiento de células protectoras intactas y proporciona muestras fiables para el estudio de los procesos de señalización de las células estomáticas.
La aplicación de este método puede extenderse a las plantas de Brassicaceae y otras especies de plantas con solo una pequeña modificación en el protocolo. La demostración es importante, ya que el paso principal para enriquecer las celdas de guardia puede resultar un desafío. Para comenzar, seleccione plantas maduras de Arabidopsis de cinco semanas de edad.
Retire con cuidado una hoja con un bisturí, cortando la hoja en la base. Tome dos pedazos de cinta adhesiva y coloque la hoja extirpada entre ellos. Aplique presión suavemente en ambos lados mientras se asegura de que el extremo de las piezas de cinta no se adhiera.
Esto se puede hacer insertando un dedo entre ellos. Retire suavemente los dos trozos de cinta adhesiva entre sí e inmediatamente haga flotar la cáscara tomada del lado abaxial de la hoja en el tampón de apertura de los estomas. Una vez que se hayan recogido todas las cáscaras, colóquelas bajo la luz.
Déjalos allí durante dos horas. Tome varias cáscaras y colóquelas en portaobjetos de microscopio. Con un microscopio óptico, ajuste las lentes para ver las células protectoras y asegúrese de que estén abiertas.
Coloque las cáscaras en 50 ml de la solución enzimática de digestión de la pared celular. Flotar e incubarlos a 26 grados centígrados. Después de 20 minutos, retire las cáscaras de la solución enzimática y enjuague brevemente dos veces con agua desionizada, y colóquelas en un tampón de apertura de estomas fresco.
Triturar las cáscaras en un mortero con nitrógeno líquido, con un mortero. A continuación, realice la extracción de fenol como se describe en el texto. Después de moler las cáscaras en un mortero con un mortero, transfiera el extracto, junto con las cáscaras a un tubo de centrífuga Oak Ridge, y agite en una coctelera durante una hora a cuatro grados centígrados.
Precipitar las proteínas extraídas con fenol añadiendo cinco volúmenes de acetato de amonio de 0,1 mol helado en metanol al 100%. Después de precipitar la proteína durante la noche a 20 grados centígrados, coseche la proteína por centrifugación y realice lavados de pellets como se describe en el texto. Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de acetona fría y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros.
Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante de acetona y seque el pellet durante diez minutos. Disuelva la muestra de proteína en un tampón de disolución. Después del vórtice y la centrifugación, recoja el sobrenadante y mida la concentración de proteínas.
Ejecute un gel SDS-PAGE. Visualice las bandas de proteínas separadas y observe la calidad relativa de las proteínas. Esta es una imagen representativa de las células protectoras de Arabidopsis antes y después de la digestión enzimática del mesófilo y las células epidérmicas.
La viabilidad de las células protectoras antes y después de la extirpación de las células mesófilas y epidérmicas se puede observar utilizando diacetato de fluoresceína, que mide la actividad enzimática y la integridad de la membrana celular. Como puede ver, las células protectoras siguen siendo viables después del peeling y la digestión enzimática. Este ejemplo ilustra el movimiento de los estomas de Arabidopsis en respuesta al tratamiento con ABA.
Las células protectoras responden al tratamiento y la apertura de los estomas disminuye más del 50% después de 30 minutos de tratamiento con ABA. Aquí hay un curso de tiempo del movimiento de los estomas. Además, se muestra una imagen representativa de la apertura de los estomas en cada punto de tiempo.
La detección, separación y abundancia relativa de proteínas es observada por SDS-PAGE. Las bandas son claras y distintas. Se incluyen cuatro réplicas biológicas para enfatizar la reproducibilidad de la extracción de proteínas a partir de este método.
La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando intentamos correlacionar los cambios moleculares de las células protectoras en tiempo real con el movimiento de los estomas. Una vez dominada, se puede preparar una muestra de proteína de las células protectoras de los estomas en unas pocas horas y se puede utilizar en múltiples experimentos. Es importante recordar que no debe infligir una gran cantidad de daño a las celdas protectoras mientras se pelan y manipulan.
Siguiendo este método, se pueden aplicar otras técnicas para investigar la señalización de las células protectoras, como el marcaje isobárico para estudiar la respuesta redux de las proteínas en las plantas en condiciones normales y de estrés. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y enriquecer células protectoras intactas y viables, así como extraer proteínas de alta calidad apropiadas para estudios posteriores.
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Visión general
Este protocolo describe un método novedoso para aislar y enriquecer células de guardia estomáticas intactas del tejido de hojas de plantas. Estas células de guardia enriquecidas son valiosas para análisis fisiológicos, bioquímicos y moleculares, incluyendo estudios sobre los procesos de señalización celular estomática.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Fisiología vegetal
- Biología celular
- Análisis bioquímico
Fundamentos
- Las células de guardia desempeñan un papel crucial en la regulación del intercambio de gases en las plantas.
- Entender la función de las células de guardia es esencial para estudiar las respuestas de las plantas a los cambios ambientales.
- Los métodos actuales para aislar células de guardia pueden no producir muestras de alta calidad.
- Este protocolo tiene como objetivo mejorar el proceso de aislamiento para obtener mejores resultados de investigación.
Propósito del estudio
- Preparar células de guardia estomáticas enriquecidas de alta calidad.
- Facilitar estudios fisiológicos y bioquímicos de los estomas.
- Proporcionar muestras confiables para varios análisis biológicos.
Métodos utilizados
- Aislamiento de células de guardia del tejido de hojas de plantas.
- Enriquecimiento de células de guardia intactas para análisis.
- Aplicación de técnicas novedosas para mejorar la calidad de las muestras.
- Preparación para estudios transcriptómicos, proteómicos y metabolómicos.
Principales resultados
- Aislamiento exitoso de células de guardia de alta calidad.
- Mayor fiabilidad de las muestras para estudios fisiológicos.
- Mejora en la comprensión de los procesos de señalización estomática.
- Potencial para aplicaciones más amplias en la investigación de la biología vegetal.
Conclusiones
- Este método proporciona un avance significativo en el aislamiento de células de guardia.
- Las células de guardia enriquecidas pueden conducir a nuevas perspectivas en la fisiología vegetal.
- Estudios futuros pueden aprovechar este protocolo para varios análisis biológicos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This method addresses the challenge of isolating intact plant guard cells for molecular analysis, enabling reliable protein extraction and viability assessment. It supports mechanistic de-risking in target validation by providing enriched samples for studying signaling pathways linked to stomatal movement. The approach improves predictive confidence in preclinical models by yielding reproducible biochemical data from physiologically relevant plant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of guard cell signaling mechanisms through enriched protein samples.
- Operational Value: Provides reliable isolation of intact guard cells using accessible materials like Scotch tape.
- Scientific Value: Supports functional validation of targets involved in stomatal response to abscisic acid (ABA).
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative protein outputs via SDS-PAGE for comparative analysis across conditions.
- Operational Value: Ensures sample reproducibility with four biological replicates demonstrated in the protocol.
- Scientific Value: Facilitates assay standardization through consistent guard cell enrichment and viability measurement using fluorescein diacetate (FDA).
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects molecular changes in guard cells to phenotypic stomatal movement outcomes under ABA treatment.
- Operational Value: Enables time-course analysis of stomatal aperture reduction (>50% after 30 minutes ABA) for kinetic profiling.
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by linking cellular signaling to physiological responses in Arabidopsis.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting target validation through biochemical analysis of enriched guard cells prior to lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of guard cell signaling pathways via protein extraction and viability assays.
- Screening: Delivers reproducible protein samples suitable for downstream proteomic applications like isobaric labeling.
- Analytics: Enables quantitative measurement of protein abundance and separation clarity via SDS-PAGE gel visualization.
- Translational Research: Connects molecular data to stomatal movement phenotypes, advancing preclinical continuity in plant stress response models.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, low-cost technique for repeated guard cell enrichment across experiments.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in guard cell signaling studies.
- Operational Value: Improves standardization and reproducibility through simple tape-peel and enzyme digestion steps.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decisions in target validation by providing reliable biochemical readouts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional guard cell responses to stimuli like ABA.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant tissue handling and microscopic visualization of guard cells.
- Needs standard laboratory equipment including centrifuge, mortar and pestle, and SDS-PAGE apparatus.
- Demands cross-team consistency in peel collection timing and enzyme incubation conditions.
- Involves adaptation considerations for different plant species beyond Arabidopsis, as noted for Brassicaceae.
- Includes practical limitations such as avoiding excessive damage during peeling to maintain cell integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:02
Title
1:19
Preparation of Enriched Stomata
3:14
Protein Extraction and SDS-PAGE Separation
6:14
Results: Stomata Tape-Peel Allows for the Preparation of High Quality Enriched Stomata Suitable for Conducting Physiological, Biochemical and Molecular Assays
7:38
Conclusion
