Uso de ovocitos de ratón para evaluar la función humana del Gene durante la Meiosis I

El objetivo general de esta serie de ensayos es investigar la función de los genes humanos durante la meiosis I utilizando ovocitos de ratón. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la reproducción humana, como si existe una predisposición genética a la aneuploidía materna. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza ovocitos de ratón como modelo para la meiosis de mamíferos, lo cual es útil dada la inaccesibilidad de los óvulos humanos para los estudios de la función génica.

La idea de este método fue cuando secuenciamos los exomas de mujeres que se habían sometido a tratamientos de fecundación in vitro y cuyas tasas de aneuploidía embrionaria no podían explicarse por su edad materna. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de análisis de imágenes son difíciles de aprender y la definición de parámetros de análisis estrictos es clave para el rigor y la reproducibilidad. Utilizando una estrategia de clonación validada, inserte la secuencia codificante completa del gen de interés en la región de clonación múltiple del vector de transcripción in vitro.

Mutagenizar el ADN si genera polimorfismos de un solo nucleótido o inserciones y deleciones, como se describe en el protocolo de texto. A continuación, transforma el ADN mutagenizado en un huésped bacteriano. Utilice un kit para aislar y purificar el plásmido, siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, linealice los productos finales utilizando la digestión enzimática de restricción simple del ADN purificado. Purifique el producto digerido utilizando un protocolo de limpieza de ADN validado o un kit. Y eluir en 30 microlitros de agua libre de RNasa/DNasa.

Transcribir el ADN in vitro utilizando la polimerasa T7 siguiendo el protocolo del fabricante. Por último, purifique y eluya el ARN en 30 microlitros de agua libre de ARNasa/DNasa utilizando un kit de purificación de ácidos nucleicos basado en columna de centrifugación en matriz de sílice siguiendo el protocolo del fabricante. Divida los ovocitos en grupos iguales para la microinyección.

Microinyecte un grupo con ARNm experimental y el otro grupo con los NPB de control de tipo salvaje o ARNm GFP. Utilizando un aparato de pipeteo manual o bucal en el que la abertura de la pipeta de vidrio sea ligeramente mayor que el diámetro de un ovocito, transfiera los ovocitos a una gota de 100 microlitros de medio de cultivo sin milrinona en una placa de Petri cubierta con aceite mineral de calidad embrionaria. A continuación, incubar los ovocitos durante siete horas a 37 grados centígrados con un 5% de CO2 para permitir una maduración suficiente hasta la metafase de la meiosis I. Después de la incubación, utilice el mismo aparato de pipeta para transferir los ovocitos a una placa de cultivo de órganos con pocillo central que contenga 700 microlitros de medio de recogida de MEM preenfriado en el pocillo central y 500 microlitros de agua en el anillo exterior.

Coloque el plato en hielo durante siete minutos. Fije los ovocitos transfiriéndolos a un pocillo de una placa puntual de vidrio transparente que contenga 400 microlitros de paraformaldehído al 2% en 1x PBS. Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Después de la inmunotinción, como se describe en el protocolo de texto, se tomen imágenes de los ovocitos con un objetivo de 40 a 63x en un microscopio confocal. Capture pequeños pasos en el plano Z optimizado para el objetivo de trabajo e imagine toda la región del husillo de metafase. Para identificar el estado de la conexión de microtúbulos de cinetocoro, primero abra la imagen arrastrando el archivo a la barra de herramientas de ImageJ.

En la serie Z abierta, navegue hasta el menú desplegable de la imagen y, en la subpestaña Color, haga clic en Fusionar canales para que todos los canales sean visibles. Es fundamental que el analista esté familiarizado con el tipo de uniones a los cinetocoros que son posibles en los ovocitos de ratón. La calidad de la imagen influirá en gran medida en su capacidad para analizar adecuadamente estos datos.

Usando el interruptor en la parte inferior de la imagen, desplácese a través de cada corte Z y determine la unión del microtúbulo del cinetocoro. Utilizando el mismo aparato de pipeta, transfiera los ovocitos a una gota de 100 microlitros de medio de cultivo sin milrinona bajo aceite. Incubar los ovocitos durante siete horas para permitir una maduración suficiente hasta la metafase de la Meiosis I como antes.

A continuación, transfiera los ovocitos a una placa de cultivo de órganos con pocillo central que contenga 700 microlitros de medio de cultivo que contenga monastrol en el pocillo central y 400 microlitros de agua en el anillo circundante. Incubar a 37 grados centígrados durante dos horas. Enjuague el monastrol transfiriendo los ovocitos a través de tres gotas de 100 microlitros de medio de cultivo CZB.

A continuación, transfiera los ovocitos a una nueva placa de cultivo de órganos con pocillo central que contenga 700 microlitros de medio de cultivo más un inhibidor del proteasoma en el anillo central. Agregue 400 microlitros de agua al anillo exterior e incube durante tres horas. A continuación, fije los ovocitos transfiriéndolos a un pocillo de una placa puntual de vidrio transparente que contenga 400 microlitros de paraformaldehído al 2% en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Tome imágenes de los ovocitos utilizando un objetivo de 40 a 63x en un microscopio confocal, capturando pasos de menos de una micra en el plano Z y asegurándose de obtener imágenes de toda la región del huso de la metafase. Para identificar el estado de alineación de los cromosomas, abra los archivos de imagen con un software de imágenes. A continuación, arrastre la imagen al panel de control de ImageJ.

En la serie Z abierta, use la herramienta de punta para marcar puntos al final de cada poste del husillo en su respectiva corte Z colocando la herramienta sobre el poste del husillo en la imagen y haciendo clic en la imagen. Agregue estos puntos al Administrador de ROI presionando simultáneamente el botón de comando y el botón T en el teclado. Determine las coordenadas específicas para cada una de las posiciones establecidas resaltando el punto específico en el Administrador de ROI y haciendo clic en el botón Medir.

Esto proporcionará una tabla de resultados que contiene las coordenadas X e Y para cada punto, que son los puntos X1, Y1 y X1, Y2, respectivamente. A continuación, determine la verdadera coordenada Z. Esto se hace multiplicando el número de corte del corte Z específico en la pila Z en la que se identificó el polo del husillo por el grosor de la pila.

Estos serán los puntos Z1 y Z2, respectivamente. Determine la longitud del huso utilizando la ecuación del teorema de Pitágoras con las coordenadas X, Y y Z previamente definidas. A continuación, determine la zona media del husillo.

Esto se calcula como 1/2 de la longitud del husillo. Haga clic en el icono de línea de la barra de herramientas de ImageJ y dibuje una línea que vaya desde un polo del husillo hasta la zona media del husillo. La longitud se mostrará en la barra de herramientas de ImageJ.

La definición de parámetros estrictos de alineación cromosómica permite un análisis cuantitativo sólido, importante en la reproducibilidad de los datos. Determine el estado de alineación cromosómica evaluando la distancia cromosómica desde la zona media del huso utilizando la herramienta de medición de líneas. Haga clic en el icono de línea de la barra de herramientas de ImageJ y dibuje una línea desde la zona media del huso hasta el cromosoma.

La longitud se mostrará en la barra de herramientas de ImageJ. Los cromosomas mayores de cuatro micras de la zona media del huso se consideran no alineados. Una vez que los ovocitos se han sometido a inmunotinción e imagen, se pueden evaluar las uniones correctas del cinetocoro de los microtúbulos.

En una unión normal, cada par de cinetocoros hermanos del bivalente se une a los microtúbulos del huso desde polos opuestos. Se pueden observar hasta tres tipos diferentes de uniones anormales. Un ejemplo ocurre cuando no hay microtúbulos en contacto con el cinetocoro.

Alternativamente, los microtúbulos pueden unirse incorrectamente, produciendo uniones sintélicas o merotélicas. Las uniones sintélicas se forman con ambos pares de cinetocoros hermanos unidos a microtúbulos que emanan de un solo polo. Los aditamentos merotélicos se producen cuando los cinetocoros hermanos de un par están unidos a polos opuestos.

Después de que los ovocitos se recuperan de la desalineación inducida, la capacidad de los cromosomas para realinearse se evalúa mediante imágenes. En este ejemplo, un cromosoma bivalente se considera desalineado ya que se encuentra a más de cuatro micras de la zona media del huso. A la hora de elegir qué ensayo es el adecuado para evaluar la función de las variantes genéticas, es importante recordar que las variantes genéticas humanas en estudio se están sobreexpresando y que es posible que los homólogos endógenos de ratón deban agotarse al mismo tiempo.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como CRISPR-Cas9 para crear cepas de ratones humanizadas para responder preguntas adicionales, como comprender cómo la variante genética influye en la calidad de los óvulos y embriones y si afecta la salud reproductiva del individuo. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la genética reproductiva exploraran otros factores causantes de la aneuploidía materna en humanos. La identificación de genes podría proporcionar diagnósticos poderosos y una base para estudios para corregir aneuploidías.

Gracias por mirar. Buena suerte con tus experimentos.