Name: Uso de ovocitos de ratón para evaluar la función humana del Gene durante la Meiosis I (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprenda a evaluar la función de genes humanos durante la Meiosis I utilizando ovocitos de ratón como modelo. Este protocolo permite estudiar predisposiciones genéticas a la aneuploidía materna en reproducción.

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Este trabajo fue financiado por una beca de investigación de la sociedad americana de medicina reproductiva y de la Charles y Johanna Busch Memorial Fund en Rutgers, Universidad Estatal de NJ a K.S. A.L.N. fue apoyado por una subvención de la I.N.S. (F31 HD0989597).

1. molecular clonación
<ol><li>Obtener completa secuencia de codificación del gen de interés y el plásmido en vitro transcripción (pIVT) vector11. Nota: Clones de cDNA de larga duración están comercialmente disponibles de distintos proveedores o pueden generarse mediante reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR). El Centro Nacional de recursos en línea de información de biotecnología (NCBI) proporciona secuencias de genes de transcripción de los nucleótidos y expresó secuencia etiquetada bases de datos (EST). Para facilitar la proteína visualización y análisis de niveles de expresión, fusión a la proteína verde fluorescente (Gfp) u otra etiqueta fluorescente adecuado se pueden desear en la estrategia de clonación.</li>
	<li>Utilizando una estrategia de clonación validada, inserte la secuencia de codificación del gene de interés de la región de clonación múltiple de pIVT. Una descripción detallada de la clonación molecular y los pasos requeridos han sido previamente descritas 12. Nota: Si un producto de gene-fusion es que se generen, asegúrese de que la clonación es en el marco de lectura apropiado.</li>
	<li>La secuencia de la construcción usando las cartillas de la globina para asegurar la inserción génica correcta fusión en el marco adecuada y que no fueron creadas polimerasa inducida por las mutaciones de punto. Nota: Si no hay equipo de secuenciación del ADN Sanger, muchas empresas ofrecen bajo costo opciones de secuenciación de ADN.</li>
	<li>Mutagenize ADN si generar polimorfismos de nucleótido único (SNPs) o inserciones/deleciones (INDELS). Mutagénesis de DNA se describe en pasos 1.5-1.7 a continuación. Para construcciones de tipo salvaje, continúe con el paso de linearización 1.7.</li>
	<li>Diseño de cartillas de mutagénesis y completar la reacción de PCR de mutagénesis para generar mutante construir según el protocolo del fabricante. PCR mediada mutagénesis sitio-dirigida ha sido previamente descrito 13. Además, muchas empresas ofrecen kits de mutagénesis sitio-dirigida que incluyen protocolos.</li>
	<li>Transformar ADN mutagenized anfitrión bacteriano. Aislar y purificar plásmidos. Nota: Muchas compañías hacen kits que pueden utilizarse para aislar y purificar DNA plasmídico fácilmente. Seguir protocolo de fabricantes en consecuencia. Si se utiliza una cepa bacteriana gram-negativa como e. coli, se recomienda utilizar un kit que elimina las endotoxinas.</li>
	<li>La secuencia de la DNA aislada de transformantes bacterianos usando estándar secuenciación del ADN Sanger para confirmar la introducción de los SNP o INDEL deseados.</li>
	<li>Alinear los productos finales con una enzima de la restricción digestión de la DNA purificada. Nota: El vector pIVT contiene múltiples enzimas solo corte sitios listados en el mapa del plásmido Addgene 14.</li>
	<li>Asegúrese de que el producto es lineal a través de electroforesis en gel de agarosa. La metodología de electroforesis en gel de agarosa ha sido previamente definido 14. Nota: Para todos los pasos restantes, utilizar puntas de pipeta de barrera (filtro) y materiales libres de Rnasa para asegurar producción estable, de alta calidad RNA.</li>
	<li>Purificar el producto digerido utilizando un protocolo de limpieza de ADN o kit validado y eluir en 30 μl de agua libre de DNasa/Rnasa. Nota: Vuelta de matriz de sílice se recomiendan kits de columna de alta calidad, purificado de ADN. Seguir protocolo de fabricantes en consecuencia.</li>
	<li>
In vitro transcribir DNA utilizando T7 polimerasa siguiendo el protocolo del fabricante.</li>
	<li>Purificar y eluir el RNA en 30 μl de agua libre de DNasa/Rnasa utilizando un kit de purificación de ácidos nucleicos basada en la columna de giro matriz de sílice siguiendo el protocolo del fabricante.</li>
	<li>Realizar la desnaturalización electroforesis del gel de agarosa usando formaldehído para confirmar el tamaño de producto final de RNA. Ver siguientes pasos 1.13 1.22 14. (Figura 1).</li>
	<li>Preparar gel calentando 1 g agarosa en 72 mL de agua hasta que se disuelva, luego enfriar a 60 ° C.</li>
	<li>Preparar 10 X MOPS funcionamiento tampón añadiendo 0,4 M MOPS (pH 7.0), acetato de sodio de 0.1 M y EDTA de 0.01 M.</li>
	<li>Añadir 10 mL de 10 X MOPS funcionamiento tampón y 18 mL de formaldehído al 37% (12,3 M) a la solución de agarosa refrescado.</li>
	<li>Casta el gel vertiendo la solución de agarosa en un recipiente de formación de gel. Utilice un peine grande para dar cabida a 10 μl. Después de gel ha establecido y es firme al tacto, retire suavemente el peine.</li>
	<li>Montar el gel en la Cuba de electroforesis, y añadir suficiente buffer corriente 1 X MOPS asegurando el gel está completamente cubierto.</li>
	<li>Preparar la muestra de RNA mediante la adición de 1 μg de ARN de 0,5 volúmenes de X de tinte de carga que contiene formaldehído.</li>
	<li>Añadir bromuro de etidio a la solución de RNA en una concentración de 10 μg/mL.</li>
	<li>Desnaturalizar la solución de la muestra de RNA a 70 ° C durante 5 minutos.</li>
	<li>Con estéril, extremidades de filtro de 10 μl, 5 μl del marcador de peso molecular de la carga y 5 μl de ARN de muestras en pocillos separados del gel y electrophorese a 5 V/cm hasta que el tinte ha migrado por lo menos dos tercios de la longitud del gel.</li>
	<li>Visualizar el ARN en el gel un iluminador de trans UV. Asegúrese de que el ARN es la talla correcta por comparación con el marcador de peso molecular.</li>
	<li>Para medir la concentración y la pureza del ARN, transferencia de 1,2 μl de ARN purificado utilizando estéril 10 μl puntas de filtro en un espectrofotómetro UV. Nota que el RNA de alta calidad debe tener proporciones de absorbancia de A260/280 (1.8-2.2) y 260/230 (> 1,7) respectivamente.</li>
	<li>Usando 10 μl puntas de filtro, alícuotas del RNA purificado restantes en estéril 0,5 μl los tubos de centrífuga (3-5 μl/tubo). Almacenar los tubos a-80 ° C hasta que esté listo para la microinyección. Nota: Una concentración de final de la inyección de 500 ng/μl es un óptimo punto de partida. Se recomienda diluir RNA 1:2 en Rnasa free H20 antes de la microinyección para reducir la viscosidad de RNA en pipeta de microinyección.</li>
</ol>2. cinetocoro-microtúbulo accesorio ensayo
<ol><li>Ovocitos se dividen en grupos iguales para la microinyección. Nota: Recolección de ovocitos, transferencia, microinyección y maduración meiótica se ha descrito en detalle en JoVE previamente 15.</li>
	<li>Microinject un grupo con el mRNA experimental y el otro tipo con el control de peso y PBS o Gfp mRNA. Nota: 500 ng/μl es la concentración de inyección recomendado comenzar con 10. Un picoinjector puede utilizarse para controlar la cantidad de inyección. Se recomienda un volumen de inyección de 5-10 pL 15.</li>
	<li>Con una mano o boca operado el aparato pipeteo donde el vidrio pipeta apertura es ligeramente más grande que el diámetro de un oocito (100-150 μm), con transferencia de ovocitos en una gota de 100 μl de medio de cultivo libre de milrinona en una placa Petri cubierto en aceite mineral calidad de embrión e incubar ovocitos de 7 h a 37 ° C en 5% C02 para permitir la suficiente maduración metafase de la meiosis I (se reunieron) 15.</li>
	<li>Después de la incubación, usando el mismo aparato de pipeta como la anterior, transferencia de ovocitos en una placa de cultivo de órgano del centro de pozo que contiene 700 μl de medio de colección previamente enfriada medio esencial mínimo (MEM) en el centro bien y 500 μl de H20 en el anillo exterior y Coloque el plato en hielo durante 7 minutos. Nota: Se recomienda enfriado previamente medios MEM y centro bien platos de cultura órgano a-20 ° C durante al menos 20 minutos antes del tratamiento de los ovocitos.</li>
	<li>Fijar los ovocitos mediante la transferencia utilizando el aparato de la pipeta en un pozo de una placa de punto de cristal que contiene 400 μL de 2% paraformaldehído en 1 X PBS por 20 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Usando la misma pipeta aparato, transfiera los ovocitos en otro pozo en una placa de punto conteniendo 400 μL solución bloqueo (PBS + 0.3% BSA + 0.01% Tween-20 + 0.02% NaN3) y tienda a 4 ° C hasta que esté listo para proceso de inmunotinción. Nota: para el almacenamiento de ovocitos a 4 º C, vidrio de cubierta placa punto con parafilm para evitar la evaporación.</li>
	<li>Utilizando el mismo aparato de pipetas, ovocitos transferencia a un nuevo pozo en un lugar que contenga solución de permeabilización 400 μL (PBS BSA 0,3% 0,1% TritonX-100 + 0.02% NaN3) de la placa e incuban a temperatura ambiente durante 20 minutos ovocitos transferencia rápida a través de tres gotas de 400 μL solución para quitar cualquier detergente residual de bloqueo. Nota: Una placa de vidrio claro 9-bien spot funciona bien para mover grupos a través de múltiples tratamientos en un mismo plato (pasos de 2.4-2.5).</li>
	<li>Realizar los procedimientos de inmunocitoquímica restantes en una cámara humidificada, protegidos de la luz a temperatura ambiente. Uso un recipiente de plástico de tamaño mediano forrado con toallas de papel húmedo y cubra con papel de aluminio.</li>
	<li>Usando el aparato de la pipeta, transfiera los ovocitos a 30 μL bloqueando la solución en la tapa de una placa de 96 pocillos y un lugar dentro de la cámara humidificada durante 10 minutos. Nota: Las gotas se colocan en la sangría circular sobre la placa.</li>
	<li>Etiqueta de centrómeros y huso, usando el aparato de la pipeta, transfiera los ovocitos a 30 μL solución que contienen el antígeno anti-centromérico (ACA, cresta) de bloqueo (1:30) y tubulina acetilada anti (1: 1000) e incubar durante al menos 1 h.</li>
	<li>Enjuague los ovocitos mediante la transferencia a través de gotas tres 30 μl de bloquear la solución durante 10 minutos.</li>
	<li>Usando el aparato de la pipeta, transferencia de ovocitos a 30 μl de la gota de solución de bloqueo con anticuerpos secundarios gratuitos a los anticuerpos utilizados anteriormente (anti-human IgG 1: 200, anti-mouse IgG 1: 200) e incubar durante 1 h.</li>
	<li>Repita los pasos de enjuague 10 minutos 3, en 30 μL solución de bloqueo como se describe en el paso 2.11.</li>
	<li>Transfiera los ovocitos, usando el aparato de la pipeta, en 3-5 μl de DAPI que contiene medio de montaje (5,9 μg/μl) sobre un portaobjetos de vidrio.</li>
	<li>Coloque 4 gotas pequeñas (tamaño de una cabeza de alfiler) de vaselina en las esquinas del cubreobjetos para evitar la trituración de los ovocitos.</li>
	<li>Suavemente Coloque el lado de jalea de petróleo cubre-objetos hacia abajo en la diapositiva.</li>
	<li>Sello de cubreobjetos los bordes con clara esmalte de uñas y dejar para secar durante 5 minutos.</li>
	<li>Almacenar diapositivas a 4 ° C, protegido de la luz, hasta el procesamiento mediante microscopía confocal. Nota: Asegúrese que el índice de refracción del medio de montaje y cubreobjetos, partidos los objetivos del microscopio utilizados. Montaje recomendado materiales han sido previamente descritas 15.</li>
	<li>Ovocitos con un objetivo de x 40-63 en un microscopio confocal, capturando pequeños pasos de la imagen (≤ 1 μm) en el plano z, optimizado para la objetivo de trabajo y la imagen toda la región del huso en metafase. Nota: Asegúrese de que a la imagen de los 3 canales basados en anticuerpos secundarios utilizados en el paso 2.11. Imagen promedio de ≥ 4 y un zoom de 3 es ideal para la resolución adecuada. Un tamaño de paso de 1 μm proporciona la visualización clara de los microtúbulos y los cinetocoros en ovocitos de ratón. El procedimiento para la captura de la imagen variará de un microscopio para microscopio. Por favor consulte la guía de usuario confocal de fabricantes para pasos específicos sobre cómo configurar opciones de microscopio.</li>
	<li>Identificar el estado del accesorio de cinetocoro-microtúbulo usando proyección de imagen software siguiendo pasos 2.21-2.23 abajo. Nota: Los pasos siguientes describen este procedimiento utilizando el software descargable gratis imagen J (NIH), sin embargo, puede utilizarse software de tratamiento de imágenes alternativo. Estado de conexión tipos previamente han sido definido 16 .</li>
	<li>Abre la imagen arrastrando el archivo en la barra de herramientas imagen J.</li>
	<li>En la serie de z-abierta, hacer todos los canales visible (ADN, cinetocoro y huso) haciendo clic en "combinar canales", disponible en el menú "imagen", en la pestaña "color" del sub.</li>
	<li>Usando la palanca en la parte inferior de la imagen, pasar cada rodaja z y determinar accesorio de microtúbulos del cinetocoro. Accesorio detallada descripciones han sido previamente descrito 16
</li>
</ol>3. cromosoma alineación desafío ensayo
<ol><li>Usando el aparato de pipeta como se describe en el paso 2.3, transferencia de ovocitos en una gota de 100 μl de medio de cultivo libre de milrinona en aceite e incubar ovocitos de 7 h permitir la suficiente maduración metafase de la meiosis I (se reunieron) como se describió anteriormente en el paso 2.3 17 . Nota: Los procedimientos de colección, la microinyección y la maduración de ovocitos se perfilaron previamente 15. Consulte el Protocolo adjunto en pasos 2.1-2.2 para controles y concentraciones de microinyección de RNA.</li>
	<li>Utilizando el mismo aparato de pipetas, transferencia de ovocitos a una cultura de centro bien órgano plato que contenga medio de cultivo 700 μl que contiene monastrol [100 μm] en el centro bien y 400 μL H20 en el anillo circundante e incuban a 37 ° C durante 2 h.</li>
	<li>Enjuague monastrol por transferencia de ovocitos, usando el aparato de pipeta como anteriormente, a través de tres gotas de 100 μl de medio de cultivo CZB y entonces transfiera los ovocitos a una placa de cultivo de órgano centro-pozo nuevo con 700 μl de medio de cultivo + MG132 [5 μm] 3 h en el centro anillo. Añadir 400 μL de H20 en el anillo exterior.</li>
	<li>Fijar los ovocitos mediante la transferencia, usando el aparato de la pipeta, en un pozo de una placa de punto de cristal que contiene 400 μL 2% paraformaldehído en PBS durante 20 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Después de la fijación, transfiera los ovocitos, usando el aparato de la pipeta, en un nuevo pozo de una placa de punto de cristal que contiene 400 μL solución de bloqueo y almacenar a 4 ° C hasta procesan para la inmunotinción. Nota: para el almacenamiento de ovocitos a 4 º C, vidrio de cubierta placa punto con parafilm para evitar la evaporación.</li>
	<li>Permeabilizar y ovocitos mediante inmunocitoquímica la etiqueta como se describe en pasos 2.6-2.16.</li>
	<li>Ovocitos con un objetivo de x 40-63 en un microscopio confocal, capturando la imagen < pasos de 1 μm en el plano z para toda la región del huso en la metafase de la imagen.</li>
	<li>Para identificar la alineación del cromosoma estado abrir archivos de imagen utilizando el software de imágenes. Nota: Los pasos siguientes describen este procedimiento utilizando el software descargable gratis imagen J (NIH), sin embargo, puede utilizarse software de tratamiento de imágenes alternativo.</li>
	<li>Arrastre la imagen en panel de control de imagen J.</li>
	<li>En la serie de z-abierta, use la herramienta de punto (disponible haciendo clic en el icono de punto en la barra de control de imagen J) para marcar puntos al final de cada polo del huso en sus respectivas divisiones z Coloque la herramienta sobre el polo del huso en la imagen y haciendo clic en la imagen. Pulsar Comando + t en el teclado para agregar estos puntos a la región de manager de interés (ROI).</li>
	<li>Determinar las coordenadas específicas para cada una de las posiciones que se encuentra en paso 3.10 resaltando el punto específico en el administrador de ROI y clic en el botón de la medida. Esto le proporcionará resultados de una tabla que contiene x y y coordenadas de cada punto. Estos serán los puntos de X1, Y1 y X1, Y2, respectivamente.</li>
	<li>A continuación, determinar la coordenada verdadera Z. Esto se hace multiplicando el número de corte de la rodaja z específico en la z-pila en que fue identificado el polo del huso (es decir, segmento #2 de 6) que cada punto individual está en el espesor de la pila (es decir, 1 μm) (ejemplo: corte 2 x 1 μm = 2). Estos serán los puntos Z1 y Z2 respectivamente.</li>
	<li>Determinar la longitud del huso usando la ecuación del teorema de Pitágoras (a2 + b2 = c2) usando previamente definida x, y, z coordenadas de pasos 3.11-3.13. Para cada huso es igual a la longitud final: √((x1-x2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2)</li>
	<li>Determinar el midzone del huso. Esto se calcula como la mitad de la longitud del huso. Con la herramienta de línea de J de la imagen, haciendo clic en el icono de la línea en la barra de herramientas imagen J, trace una línea que es de un polo del huso el midzone del huso. La longitud se mostrará en la barra de herramientas imagen J.</li>
	<li>Determinar estado de alineación del cromosoma cromosoma distancia el midzone del huso usando la herramienta de medición de la línea de evaluación. Con la herramienta de línea disponible haciendo clic en el icono de la línea en la barra de herramientas imagen J, trazar una línea desde el midzone del huso a los cromosomas. La longitud se mostrará en la barra de herramientas imagen J. Superior a 4 μm del midzone del huso de los cromosomas se consideran no alineados 18.</li>
</ol>

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<li>Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+spindle+assembly+mechanisms+with+monastrol%2C+a+small+molecule+inhibitor+of+the+mitotic+kinesin%2C+Eg5%5BTitle%5D)+AND+%22Eg5.+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5.</a> Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).</li>
<li>Jones, K. T., Lane, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+causes+of+aneuploidy+in+mammalian+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs.</a> Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).</li>
<li>Fellmeth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+characterization+of+three+Aurora+kinase+C+splice+variants+found+in+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes.</a> Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).</li>
<li>Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+cold-stable+kinetochore+fiber+in+metaphase+PtK1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells.</a> Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).</li>
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<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Debido a la rápida y creciente identificación de variantes genéticas humanas asociadas con la enfermedad, es esencial que se establezcan sistemas para evaluar su significado biológico. Comprender la función de la proteína en meiosis humana plantea desafíos particulares porque son preciosos ovocitos humanos y espermatozoides humanos y raros no son susceptibles de manipulación genética. Ovocitos de ratón son un sistema mamífero modelo valioso para la evaluación de genes humanos meiótica función 10<s...

La infertilidad es una condición que afecta a 10-15% de la población humana de la edad reproductiva 1, de los cuales casi la mitad busca tratamiento médico 2. Aunque la etiología de la infertilidad es diversa y en muchos casos multifactoriales, la anormalidad genética más común en los seres humanos es aneuploidía embrionaria 3. Aneuploidía se define como la desviación (ganancia o pérdida) del número correcto de cromosomas en una célula. El fenómeno de la aneuploidía de los embriones humanos es común y aumenta con la edad maternal avanzada 4,5. Cuatro ensayos controlados aleatorios han destacado el beneficio de seleccionar embriones sólo cromosómicamente normales (euploides) para la transferencia uterina porque esta estrategia dio lugar a la creciente implantación de tarifas, tasas de aborto espontáneo y un tiempo más corto para lograr embarazo 6,7,8,9. Por lo tanto, entender la etiología de la aneuploidía humana puede tener implicaciones importantes en la reproducción asistida.
Aunque las pruebas genéticas preimplantacional de aneuploidías están beneficiosa en tratamientos de la infertilidad, todavía carece de una comprensión profunda de cómo originan aneuploidías. Es ampliamente aceptado que existe una correlación positiva de aneuploidías meióticas (originados durante la producción de gametos) y la edad materna, sin embargo, algunas tasas de aneuploidía embrionaria presente las mujeres que se desvían de la tasa media para su edad determinada 4. Estos casos sugieren que la edad sola no siempre es predictivo del riesgo de generar un embrión aneuploide. Otros factores pueden jugar un papel en el aumento del riesgo de aneuploidía embrionaria, como variantes genéticas.
Un aspecto clave de investigar la posible contribución de una variante del gen a aneuploidía durante la meiosis del ovocito es diseñar un sistema para evaluar rápidamente la función del gen meiótica. Debido a las limitaciones éticas y acceso limitado, no es práctico para llevar a cabo estos experimentos con óvulos humanos. Estas cuestiones pueden eludirse mediante el uso de ovocitos de ratón, y aquí una serie de ensayos para evaluar la función humana del gene durante la meiosis se describen. Por microinjecting el ARN mensajero (ARNm) que codifica para la variante del gen de interés, la localización de la proteína humana en el óvulo de ratón puede ser visualizada y utilizada para determinar si los resultados de la expresión ectópica de la proteína humana de tipo salvaje y mutada en cualquier alteraciones fenotípicas que podrían conducir a aneuploide. Estos fenotipos incluyen el aumento de microtúbulos que se adhieren a la incorrecta a hermana cinetocoro y la incapacidad para apoyar la alineación del cromosoma en metafase de la meiosis I. importante, este protocolo puede utilizarse para investigar tanto ganancia como pérdida de la función variantes genéticas mediante el establecimiento de condiciones experimentales específicas a eventos clave en la meiosis del ovocito como eje de alineación de edificio y el cromosoma 10.

<table><tbody><tr><td>0,2 mL Tubo de PCR SEAL-RITE</td><td>EE. UU. Scientific</td><td>1602-4300</td><td></td></tr><tr><td>1 kb Escalera de ADN</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0313</td><td></td></tr><tr><td>100 bp Escalera de ADN</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0243</td><td></td></tr><tr><td>6X Tinte de carga de ADN Thermo</td><td>Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Placa puntual de vidrio de 9 pocillos</td><td>Thomas Scientific</td><td>7812G17</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de suero bovino&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-fluor-568 conjugada anti-ratón IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21050</td><td>dilución 1:200</td></tr><tr><td>Alexa-fluor-633 conjugada anti-humana</td><td>IgG Thermo Scientific</td><td>A21091</td><td>dilución 1:200</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>VWR</td><td>AA0356</td><td></td></tr><tr><td>Mesa antivibratoria</td><td>Technical Manufacturing Corp</td><td></td><td>cualquier modelo estándar</td></tr><tr><td>Tubulina antiacetilada anticuerpo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7451</td><td>diution 1:100</td></tr><tr><td>anticuerpo anticentromérico (CREST)</td><td>Anticuerpos incorporados</td><td>15-234</td><td>dilución 1:30&nbsp;</td></tr><tr><td>Barrera (filtro) Puntas de pipeta</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM12635</td><td>Asegúrese de que sean compatibles con su marca de pipetas. Son compatibles con las pipetas de la marca Eppendorf.</td></tr><tr><td>BD Difco Medios de cultivo deshidratados: LB Agar, Miller (Luria Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0445-07-6</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Medios de cultivo deshidratados: LB Broth, Miller (Luria Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Tubo capilar</td><td>Sutter</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Center Well plato de cultivo de órganos</td><td>VWR</td><td>25381-141</td><td></td></tr><tr><td>Tanque</td><td></td> de CO2<td></td><td>Para incubadora</td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td>cualquier modelo estándar</td></tr><tr><td>Centrífuga (con capacidad de enfriamiento)</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>cualquier modelo estándar&nbsp;</td></tr><tr><td>Cubreobjetos 11 x 22 mm</td><td>Thomas Scientific</td><td>6663F10</td><td></td></tr><tr><td>El grosor de los cubreobjetos</td><td>Thomas Scientific</td><td>6663-F10</td><td>variará para determinados microscopios</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DEPC H20</td><td>Life Technologies</td><td>AM9922</td><td></td></tr><tr><td>Digital Dry Bath</td><td>Thermo Scientific</td><td>888700001</td><td></td></tr><tr><td>Easy A high enzima de clonación de fidelidad</td><td>Agilent</td><td>600400</td><td>para la clonación de ADN&nbsp;</td></tr><tr>Se pueden utilizar <td>enzimas para linealizar pIVT,</td><td>New England Biolabs</td><td></td>, <td>NdeI o KasI:</td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td>, <td>Thermo Scientific</td><td></td> 155585011 <td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Se puede utilizar cualquier microscopio fluorescente</td></tr><tr><td>Formaldehído (37%)</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>9311</td><td></td></tr><tr><td>Colorante de carga de ARN de formaldehído</td><td>Ambion</td><td>8552</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio esmerilados (sin carga) 25X75 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr>Clones <td></td><td></td> de<td>ADNc de longitud completa</td><td>Se pueden obtener de cualquier proveedor que suministre lectura abierta clones de marco Aparato</td></tr><tr>de<td>electroforesis en gel</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>cualquier modelo estándar</td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>Globin Forward Primer para pIVT Construct</td><td></td><td></td><td>5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'.&nbsp; Se puede comprar a cualquier empresa que genere oligonucelotides personalizados</td></tr><tr><td>Globin Reverse Primer para pIVT Construct</td><td></td><td></td><td>5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Se puede comprar a cualquier empresa que genere oligonucelotides personalizados</td></tr><tr><td>Pipetas de retención</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td>Vacutip</td></tr><tr><td>Cámara humidificada Tupperware</td><td></td><td></td><td>se puede utilizar</td></tr><tr><td>Illustra Ready-To-Go Perlas RT-PCR</td> GE <td>Life Sciences</td><td>27925901</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td><td>cualquier modelo estándar con CO2 y tecnología de camisa</td></tr><tr><td>de agua Microscopio invertido</td><td>Instrumentos</td><td></td> Nikon <td>Cualquier modelo estándar</td></tr><tr><td>Software Image J (NIH)</td><td>Software de análisis de imágenes</td><td>NIH</td><td></td></tr><tr><td>Tapa de placa de 96 pocillos</td><td>Nalgene Nunc International 263339</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 0,5 mL de baja adherencia</td><td>USA Scientific</td><td>1405-2600</td><td></td></tr><tr><td>MacVector&nbsp;</td><td>MacVector</td><td></td><td>Software de análisis de secuencias</td></tr><tr><td>MG132</td><td>Selleckchem</td><td>S2619</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marcadores de ARN del milenio-formaldehído&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4659</td><td>Resuspender en DMSO a 2.5mM</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>Solo usado con embriones probado, filtrado estérilmente</td></tr><tr><td>Monastrol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8515</td><td>Resuspender en DMSO a 100</td></tr><tr><td>mM Boquilla</td><td>Biodiseno</td><td>MP-001-Y</td><td></td></tr><tr><td>N2 tanque</td><td></td><td></td><td>para mesa antivibratoria</td></tr><tr><td>Esmalte de uñas; Transparente</td><td></td><td></td><td>Se puede utilizar cualquier esmalte de uñas transparente</td></tr><tr><td>NanoDrop Microvolumen Espectrofotómetro UV-Vis</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>cualquier modelo estándar</td></tr><tr><td>NorthernMax 10X Tampón de gel desnaturalizante</td><td>Life Technologies</td><td>AM8676</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax 10X Tampón de funcionamiento</td><td>Life Technologies</td><td>AM8671</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Tampón de funcionamiento</td><td>Thermo Scnentific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Plato de cultivo de órganos 60x15mm</td><td>Life Technologies</td><td>08-772-12</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Polysciences, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>577773</tr><tr><td>Termociclador PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484075</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 139 mm</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>501V</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 35 mm</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>121V</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 60 mm</td><td>Falcon BD</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Picoinyector Microinyector</td><td></td><td>digital XenoWorks</td><td>cualquier modelo estándar</td></tr><tr><td>Extractor de pipetas</td><td>Flaming-Brown Extractor de micropipetas Modelo</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>pIVT plásmido</td><td>AddGene</td><td>32374</td><td>Vector vacío apto para la expresión de ovocitos.</td></tr><tr><td>Suero de yegua embarazada Gonadotropina</td><td>Lee BioSolutions</td><td>493-10</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>purificación de hasta 20 uL de ADN plasmídico</td></tr><tr><td>QIAquick kit de purificación de PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Quikchange II kit de mutagénesis dirigida al sitio</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>200523</td><td>kit de mutagénesis para inserciones y deleciones</td></tr><tr><td>Quikchange lightning kit de mutagénesis dirigida multisitio</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>210512</td><td>Kit de mutagénesis para cambios en un solo sitio</td></tr><tr><td>Tijeras (punta fina)</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras (punta media)</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>WP114225</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga Seal-Rite de 1,5 ml Calentador</td><td></td><td></td> de deslizamiento USA Scientific 1615-5500 <td></td></tr><tr><td>cualquier</td><td>modelo estándar</td>Espectrofotómetro (Nanodrop)<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microscopio</td> estereoscópico <td></td> Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W <td></td></tr><tr><td></td><td>cualquier modelo estándar</td>Eficiencia de subclonación Células competentes DH5a Jeringa 18265017 Thermo Fisher Scientifc BD Bioscienes 309623 1 ml, 27G(1/2)T4 ADN ligasa New England Biolabs M0202L T7 mMessage Máquina de alto rendimiento <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> kit de transcripción de ARN tapado</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>x-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td> Pinza de <td>274348</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>(Punta fina- Tamaño 5)</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>SN.743.12.1</td><td></td></tr><tr><td>Agua destilada ultrapura sin dnasa/arnasa</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de etidio ultrapuro 10 mg / mL</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>UVP UV / White lite transiluminador</td><td>Fisher Scientific</td><td>UV95041501</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Medio de montaje</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

uso de ovocitos de ratón para evaluar la función humana del gene durante la meiosis i

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Aneuploidía embrionaria es la principal causa genética de la infertilidad en los seres humanos. La mayoría de estos eventos se origina durante la meiosis femenina, y aunque se correlacionó positivamente con la edad materna, edad sola no siempre es predictivo del riesgo de generar un embrión aneuploide. Por lo tanto, variantes genéticas podrían explicar la segregación incorrecta de cromosomas durante la ovogénesis. Dado que el acceso a ovocitos humanos es limitado para fines de investigación, se desarrollaron una serie de ensayos para estudiar la función del gen humano durante meiosis utilizando ovocitos de ratón. En primer lugar, el ARN mensajero (ARNm) del gen y la variante del gen de interés son microinyectados en ovocitos de ratón arresté a profase. Después de permitir tiempo para la expresión, ovocitos son liberados sincrónicamente en maduración meiótica para completar la meiosis I. Por marcado el ARNm con una secuencia de un reportero fluorescente, como la proteína verde fluorescente (Gfp), la localización de la proteína humana puede ser evaluada además de las alteraciones fenotípicas. Por ejemplo, ganancia o pérdida de función puede investigarse mediante el establecimiento de las condiciones experimentales que el producto génico para corregir errores meiotic. Aunque este sistema es ventajoso en la investigación de la función de la proteína humana durante la Oogénesis, adecuada interpretación de los resultados debe realizarse teniendo en cuenta que no es expresión de la proteína en los niveles endógenos y, a menos que controla (es decir, golpeado hacia fuera o hacia abajo), murinos homólogos también están presentes en el sistema.

Después en vitro transcripción RNA de alta calidad tendrá una relación A260/A280 de (1.8-2.2) y un ≥1.7 de relación A260/A230 medido usando un espectrofotómetro. La imagen en la figura 1 muestra la migración de in vitro-produce el RNA en un gel de agarosa desnaturalización después de electroforesis. Una banda que es manchada en patrón o muestra que tiene múltiples bandas de tamaño puede indicar contaminación o degradación de la muestra. Alte...

Como las variantes genéticas asociadas con enfermedades humanas empiezan a ser descubierto, se está convirtiendo en cada vez más importante para el desarrollo de sistemas con los que evaluar rápidamente la importancia biológica de las variantes identificadas. Este protocolo describe los métodos para evaluar la función del gen humano durante la meiosis femenina utilizando ovocitos de ratón.

Uso de ovocitos de ratón para evaluar la función humana del Gene durante la Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

El objetivo general de esta serie de ensayos es investigar la función de los genes humanos durante la meiosis I utilizando ovocitos de ratón. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la reproducción humana, como si existe una predisposición genética a la aneuploidía materna. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza ovocitos de ratón como modelo para la meiosis de mamíferos, lo cual es útil dada la inaccesibilidad de los óvulos humanos para los estudios de la función génica.La idea de este método fue cuando secuenciamos los exomas de mujeres que se habían sometido a tratamientos de fecundación in vitro y cuyas tasas de aneuploidía embrionaria no podían explicarse por su edad materna. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de análisis de imágenes son difíciles de aprender y la definición de parámetros de análisis estrictos es clave para el rigor y la reproducibilidad. Utilizando una estrategia de clonación validada, inserte la secuencia codificante completa del gen de interés en la región de clonación múltiple del vector de transcripción in vitro.Mutagenizar el ADN si genera polimorfismos de un solo nucleótido o

using-mouse-oocytes-to-assess-human-gene-function-during-meiosis-i

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este protocolo se muestra la técnica para la extracción de los ovocitos o embriones en estadio temprano fertilizados del oviducto de los ratones. La capacidad de identificar la infindibulum e insertar una aguja de punta roma en que es esencial para la correcta realización del procedimiento.

Recuperación de los ovocitos de ratón

Los ovocitos son propensos a la aneuploidía debido a errores en la segregación cromosómica durante la maduración meiótica. Huevos aneuploides puede causar infertilidad, abortos involuntarios o trastornos del desarrollo como el síndrome de Down. Aquí se describen los métodos para introducir los materiales de elección en los ovocitos y los métodos para estudiar la maduración meiótica y evaluar la ploidía.

La microinyección de ovocitos de ratón, Maduración y Evaluación de ploidía

A continuación, presentamos un protocolo para el agotamiento de ARNm siRNA mediada específico seguido por análisis de inmunofluorescencia para evaluar ensamblaje del huso meiótico y la organización de los ovocitos de ratón. Este protocolo es adecuado para el agotamiento de las transcripciones in vitro y la evaluación funcional de los diferentes husillo y / o factores MTOC asociada en ovocitos.

Evaluación del huso meiótico en ovocitos de ratón por silenciamiento siRNA mediada

Presentamos protocolos para la recolección, preparación e imagen de ovocitos maduros de Drosophila. Estos métodos permiten la visualización del comportamiento de los cromosomas y el ensamblaje y la función del huso durante la meiosis.

Técnicas de Imagen y Prometafase metafase de la meiosis I en fijo<em&gt; Drosophila</emLos ovocitos&gt;

Ovogénesis en mamíferos es conocido por ser errores, particularmente debido a protooncogenes del cromosoma. Este manuscrito describe métodos de preparación de cromatina extensión de profase de ratón, metafase I y II etapas ovocitos. Estas técnicas fundamentales permiten el estudio de las proteínas de la cromatina-limite y morfología cromosómicas en mamíferos Oogénesis.

Cromatina difundir preparados para el análisis de progresión de ovocitos de ratón de profase a metafase II

Se presenta un protocolo optimizado que permite el agotamiento de los centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos en ovocitos de ratón durante la metafase I utilizando un láser de femtosegundo de infrarrojo cercano.

Ablación con láser multifotón de centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos en ovocitos de ratón

El error en la segregación cromosómica es una característica común en los ovocitos. Por lo tanto, estudiar el punto de control de ensamblaje del husillo da pistas importantes sobre los mecanismos necesarios para producir óvulos sanos. El presente protocolo describe tres ensayos complementarios para evaluar la integridad del punto de control del ensamblaje del huso en ovocitos de ratón.

Evaluación de la integridad del punto de control del ensamblaje del husillo en ovocitos de ratón

Mantener la integridad del genoma del ovocito es necesario para asegurar la fidelidad genética en el embrión resultante. Aquí, presentamos un protocolo preciso para detectar roturas de doble cadena de ADN en células germinales femeninas de mamíferos.

Detección de roturas de ADN bicatenario en ovocitos de ratón

Este protocolo proporciona un marco experimental para documentar el impacto físico del citoesqueleto en la forma nuclear y los orgánulos internos sin membrana en el sistema de ovocitos de ratón. El marco se puede adaptar para su uso en otros tipos de células y contextos.

Captura de la agitación basada en el citoesqueleto del núcleo del ovocito de ratón a través de escalas espaciales

Los errores meióticos en las sinapsis y la recombinación son comunes en los ovocitos de mamíferos. El análisis riguroso de las proteínas involucradas en estos procesos es esencial para comprender cómo y por qué la ovogénesis a menudo sale mal. Las técnicas aquí presentadas permiten un seguimiento exhaustivo de la recombinación y las sinapsis para evaluar la calidad de los ovocitos en ratones.

Preparación de distribuciones de cromosomas meióticos de ovocitos de ratón para la evaluación de la sinapsis y la recombinación

Aprenda a evaluar la función de genes humanos durante la Meiosis I utilizando ovocitos de ratón como modelo. Este protocolo permite estudiar predisposiciones genéticas a la aneuploidía materna en reproducción.

Uso de ovocitos de ratón para evaluar la función humana del Gene durante la Meiosis I

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