Métodos para la detección de amiloides siguiente infección de pulmonar endotelial células citotóxicas por Pseudomonas aeruginosa

Se describen métodos sencillos para la demostración de la producción de amiloides citotóxicos después de la infección del endotelio pulmonar por Pseudomonas aeruginosa.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la atención pulmonar, como ¿por qué los pacientes que sobreviven a la neumonía adquirida en el hospital tienen resultados tan malos a largo plazo? La ventaja de este método es que es sencillo y fiable, lo que significa que cualquier persona que venga al laboratorio puede aprenderlo y al día siguiente está generando datos útiles y repetibles. Aunque estos métodos analíticos se pueden aplicar para proporcionar información sobre la infección de células cultivadas in vitro, también se pueden aplicar a modelos animales y pacientes humanos.

Para producir un sobrenadante citotóxico, lave un plato de 150 centímetros de células endoteliales con HBSS y diluya una colonia de P. aeruginosa a una absorbancia de 0,25 a 540 nanómetros. Diluir aún más las células bacterianas para permitir una multiplicidad de infección de 20 a uno en 20 mililitros de HBSS y sembrar las bacterias en la placa de células endoteliales. A continuación, coloque las células infectadas en una incubadora a 37 grados centígrados y con un 5% de CO2 durante cuatro o cinco horas.

Es esencial que la incubación de las bacterias y de las células endoteliales se produzca durante un período de tiempo adecuado. Si la incubación es demasiado corta, los amiloides no se liberarán en el sobrenadante. Si la incubación es demasiado larga, las células se lisarán y liberarán todo su contenido en el sobrenadante.

El indicador que utilizamos para una duración adecuada de la incubación es la formación de huecos en la monocapa endotelial. Cuando se pueden observar espacios en la monocapa celular mediante microscopía óptica, recoja el sobrenadante para la centrifugación para eliminar cualquier residuo celular. Decantar el sobrenadante en una jeringa que esté equipada con un filtro de 0,2 micras y pasar el sobrenadante a través del filtro para eliminar cualquier bacteria contaminante.

A continuación, reserve 1,5 mililitros de sobrenadante estéril para las pruebas de citotoxicidad y congele el resto de la muestra a menos 80 grados centígrados. Para evaluar la citotoxicidad del sobrenadante recolectado, se añada la alícuota de 1,5 mililitros de sobrenadante esterilizado por filtro a un solo pocillo de una placa de seis pocillos que contenga un cultivo de células endoteliales microvasculares pulmonares confluentes. Coloque la placa en una incubadora de CO2 durante 21 a 24 horas.

A continuación, se obtienen imágenes de las regiones de los cultivos tratados y de control. Importe las imágenes en una macro imagej personalizada y ajuste el contraste a 15% de píxeles saturados. Duplique las imágenes ajustadas al contraste y utilice restar el fondo para obtener imágenes de alto contraste tanto de las celdas intactas como del área de espacio dentro del campo de visión.

Reste esta imagen de alto contraste de la imagen original y utilice la calculadora de imágenes y la función para combinar la imagen resultante con la imagen original. Utilice la función de umbral para convertir la imagen combinada en una máscara con los espacios en negro y las celdas intactas en blanco. Y use la función de erosión binaria para eliminar cualquier ruido de la imagen.

A continuación, utilice la fracción de área para medir la proporción de píxeles blancos y negros dentro de la imagen resultante. Y trace y exprese las áreas fraccionarias para cada punto de tiempo de tratamiento, como el porcentaje del área de separación máxima. Para cuantificar los amiloides dentro del sobrenadante, agregue 20 microlitros de solución madre de tioflavina T 50X recién preparada y filtrada a un mililitro de PBS en una cubeta de espectrofotómetro de un mililitro y cargue la muestra diluida en un espectrofluorómetro.

Mida la emisión de fluorescencia de referencia utilizando una excitación de 425 nanómetros. Escaneo de la emisión de fluorescencia de 450 a 575 nanómetros en incrementos de dos nanómetros. A continuación, configure el instrumento para que realice un escaneo de lapso de tiempo utilizando una excitación de 425 nanómetros y una emisión de 482 nanómetros con adquisición de datos cada 0,2 segundos durante 60 segundos.

Pausa la exploración después de 20 segundos y 10 microlitros de sobrenadante esterilizado con filtro en la cubeta. Después de mezclar por inversión, vuelva a cargar la cubeta en el espectrofluorómetro y reanude el escaneo basado en el tiempo durante los últimos 40 segundos. Una vez finalizado el lapso de tiempo, realice un escaneo final del espectro de emisiones de fluorescencia utilizando la configuración de escaneo original.

La adición de P. aeruginosa a las capas confluentes de células endoteliales microvasculares pulmonares induce la formación de espacios entre las células. Utilizando imagej para evaluar la citotoxicidad del sobrenadante como se demostró durante las primeras 12 horas de tratamiento, las monocapas de células confluentes aún sanas se pueden visualizar como todas las regiones blancas dentro del campo microscópico. Sin embargo, a las 18 horas después de la adición del sobrenadante recogido de los cultivos infectados con PA 103, se pueden detectar huecos en la monocapa y aumentar linealmente el área de la placa de cultivo desprovista de células hasta las 36 horas de tratamiento, momento en el que casi no se pueden observar células intactas.

Se pueden obtener resultados similares utilizando la liberación de lactato deshidrogenasa como marcador de citotoxicidad. Con lactato deshidrogenasa detectada por primera vez a las 18 horas después de la adición del sobrenadante citotóxico y aumentando de forma lineal hasta que se mide la muerte celular máxima a las 36 horas. Los sobrenadantes también pueden evaluarse mediante análisis de inmunotransferencia o midiendo el cambio en la intensidad de la fluorescencia de la tioflavina T debido a cambios de confirmación inducidos por la unión de amiloide para determinar la presencia de amiloides citotóxicos en los sobrenadantes.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar sobrenadantes citotóxicos después de la infección de células endoteliales con citomonsis aeruginosa. Además, debe estar bien versado en los tipos de ensayos necesarios para caracterizar y analizar las citotoxinas que están presentes en esos sobrenadantes.