Name: Métodos para la detección de amiloides siguiente infección de pulmonar endotelial células citotóxicas por Pseudomonas aeruginosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Aprende métodos simples para detectar amiloides citotóxicos tras la infección del endotelio pulmonar por Pseudomonas aeruginosa. Esta técnica fiable permite generar datos reproducibles en modelos in vitro e in vivo.

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Esta investigación fue financiada en parte por subvenciones de NIH HL66299 y TS, RB, SL, HL60024 a TS y HL136869 a MF.

Todos los procedimientos animales fueron revisados y aprobados por el Comité de cuidado del Animal de la Universidad de Alabama del sur e institucional y se realizaron conforme a las regulaciones federales, estatales y locales. Cultivos primarios de células endoteliales microvasculares pulmonar rata (PMVECs) se obtuvieron del fondo para el núcleo de la célula cultura en el centro de la Universidad de Alabama del sur para la biología del pulmón. Las células fueron preparadas usando procedimientos previamente descritos16.
1. generación de sobrenadantes citotóxicos
Nota: Aquí, utilizamos dos cepas diferentes de p. aeruginosa: PA103, que cuenta con un sistema de secreción de tipo intacto III capaces de transferir las exoenzimas ExoU y ExoT a células diana durante la infección y ∆PcrV, que carece de un tipo de sistema de secreción III y es incapaz de transferir exoenzimas a células de destino después de la inoculación.
<ol><li>Bacterias en de placas de agar de Vogel-Bonner (VB)17 la raya y crecer durante la noche a 37 ° C.<ol>
<li>Para preparar platos, hacer la siguiente solución (sales de Vogel-Bonner, stock de x 10): medir 2 g de MgSO4, 20 g ácido cítrico (ácido libre), 100 g de K2PO4y 35 g NaH2PO4. Añadir ddH2O a 1 L y autoclave durante 15 min con escape lento.</li>
		<li>Coloque el agar 7,5 g en 450 mL ddH2O y autoclave como el anterior.</li>
		<li>Después de autoclavar, coloque ambas soluciones en un baño de agua de 50 ° C para enfriar.</li>
		<li>Añadir 50 mL de la solución de sal común de 10 x VB en el agar.</li>
		<li>Añadir carbenicilina a 400 μg/mL (para las cepas de p. aeruginosa se utiliza) y mezclar bien agitando el frasco.</li>
		<li>Lugar 5 mL de la solución de agar VB en platos de cultivo estériles individuales, permitir que el agar solidifique y luego almacenar a 4 ° C hasta el día de la siembra bacteriana.</li>
		<li>En el día de la siembra bacteriana, caliente previamente las placas a 37 ° C y luego la raya las bacterias en la placa con un asa estéril. Coloque el plato en una incubadora de 37 ° C durante la noche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verificar la pureza PMVEC por la coloración positiva con fluorescente Griffonia simplicifolia lectinas y tinción negativa con fluorescentes lectina de Helix pomatia (un marcador de células endoteliales arteriales). Células de alícuotas y congelación en nitrógeno líquido.</li>
	<li>Para los experimentos, mantener las células en el medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal 10% y crecen las células en una incubadora de 37 ° C con 5% CO2. Utilizar células en pasajes 5-15.<ol>
<li>Para la generación de sobrenadantes citotóxicos, placa de 2 x 106 células en platos individuales de 150 cm y crecer durante 3-4 días hasta alcanza la confluencia. Utilice dos placas por experimento (véase abajo).</li>
		<li>Para el análisis de sobrenadantes citotóxicos, placa de 1 x 105 células en pocillos individuales de un pozo de 6 plato y creciendo durante cuatro días hasta alcanza la confluencia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para producir el sobrenadante, lavar uno de los platos de dos de 150 cm de PMVECs de paso 1.3.1 con solución salina con tampón fosfato, trypsinize y luego contar las células (utiliza un contador de células automatizado y seguir el protocolo del fabricante; véase Tabla de materiales). Lavar el otro plato de PMVECs con de Hank equilibrada solución de sal (HBSS) y luego infectar con cualquier cepa de p. aeruginosa en una multiplicidad de infección (MOI) de 20:1. Esto se logra como sigue:<ol>
<li>Para p. aeruginosa, OD540 0.25 = 2 x 108 UFC/mL. Para preparar esta disolución, añadir 1 mL HBSS a una cubeta desechable de 1 mL. Raspar las suficientes bacterias de la placa que se preparó en el paso 1.1 hasta un OD540 de 0,25 se obtiene cuando se mide con un espectrofotómetro. El siguiente paso le proporcionará un cálculo de cuánto se necesitará las bacterias.</li>
		<li>Una vez que se determina el número de PMVECs en la placa de cultivo (paso 1.4 anterior), determinar el número apropiado de bacterias en el plato de segunda, no tripsinizaron cultura que contiene las PMVECs. Por ejemplo, si se determina que el plato de cultura de PMVECs contiene 1.3 x 107 células, entonces preparar 1.3 x 107 células x 20 bacterias/celular x 1 mL/de 2 x 108 UFC = bacterias 1,3 mL.</li>
		<li>Diluir el 1,3 mL de bacterias en HBSS hasta un volumen final de 20 mL, para que toda la superficie de un plato de 150 cm puede ser cubierto con el líquido, luego añadir las bacterias diluidas a la placa de PMVECs.</li>
		<li>Incubar los PMVECs inoculados con la bacteria a 37 ° C en un incubador 5% CO2 para 4-5 h, hasta que las lagunas se observan formando en la monocapa de células cuando la placa se observa microscópicamente (ver figura 1 para el nivel adecuado de formación del boquete).</li>
		<li>Recoger el sobrenadante y luego centrifugar por 10 min a 2.000 x g en una centrífuga de mesa para eliminar los desechos celulares. Nota: Cualquier centrífuga de mesa capaz de generar g suficiente fuerza para que sedimenten las células unlysed y células grandes fragmentos se pueden utilizar para este paso.</li>
		<li>Vierta el sobrenadante en una jeringa que tiene un filtro de 0.2 μm unido a su extremo, entonces pasar el sobrenadante a través del filtro para eliminar las bacterias.</li>
		<li>Utilizar una alícuota del sobrenadante estéril a prueba de citotoxicidad (ver 2.1) y congelar el resto del sobrenadante a-80 ° C para su uso futuro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Análisis de sobrenadantes citotóxicos
<ol><li>Ensayo de citotoxicidad<ol>
<li>Crecer PMVECs en pozo 6 platos hasta confluencia. Pozos de lavado una vez con HBSS, luego añadir 1,5 mL de sobrenadante esterilizado por filtro (recogido de cualquier células inoculadas PA103 o ∆PcrV) a pocillos individuales. Añadir HBSS estéril a otro así como control negativo.</li>
		<li>Coloque la placa en la incubadora de CO2 por 21-24 h, y luego observar para matar/citotoxicidad celular (ver siguiente paso). Utilice sobrenadantes que exhiben citotoxicidad para más experimentación y descartar aquellos que no muestran la muerte de la célula.</li>
		<li>Cuantificación de la matanza de la célula<ol>
<li>Liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) medida de las células muertas utilizando comercialmente disponibles Kits de análisis de LDH y de fabricante procedimientos recomendados.</li>
			<li>Por otra parte, cuantificar muerte celular microscópico utilizando el software ImageJ. Para esto, grabar imágenes microscópicas y las áreas de la placa de cultivo que contiene las células intactas, luego cuantificar las regiones que carecen de células (indicativas de muerte celular en una monocapa) utilizando una macro personalizada de ImageJ (institutos nacionales de salud) (véase archivos de codificación complementarios ). Si lo desea, realizar los pasos de la macro manualmente como sigue:<ol>
<li>Entrada de imágenes (en formato RGB o Tiff) en la macro y ajustar el contraste de los píxeles 15% saturado. Duplicar imágenes ajustar contraste y realizar el comando "quitar fondo" para obtener una imagen de alto contraste de célula y espacio dentro del campo de visión.</li>
				<li>Reste esta imagen de la imagen original y la imagen resultante con la imagen original utilizando la calculadora de imagen "Y" la función se combinan. Convertir la imagen resultante a negro (gaps) y máscara blanca (células) con la función de umbral (mínimo 0, máximo 5) y utilizar la función "binario erosionar" para eliminar el ruido de la imagen.</li>
				<li>Medir la relación del negro al blanco píxeles de la imagen resultante utilizando la medida de "fracción de área". Parcela y expresar áreas fraccionarias para cada punto de tiempo de tratamiento como por ciento del área de separación máxima.</li>
				<li>Medios de calcular y comparar utilizando unidireccional ANOVA con prueba post-hoc de Tukey, con valores de p menor de 0,05 considerado significativo.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilice el análisis de immunoblot para establecer la presencia de amiloide, tau oligomérica y Aß en sobrenadantes de cultivo. Realizar el análisis de immunoblot usando procedimientos estándar10,11,12, excepto para concentración de sobrenadantes de cultivo por lo menos 10 veces antes de la electroforesis.<ol>
<li>Para concentrar el sobrenadante, coloque 1-2 mL de sobrenadante en una unidad de filtro de centrifugación cuya membrana tiene un corte de peso molecular de 10 kDa. Luego, coloque la unidad de filtro en una centrífuga de mesa y centrifugar a 2.000 x g hasta el grado necesario de concentración es logra (normalmente 45-60 min).</li>
			<li>Determinar la cantidad de proteína en el sobrenadante concentrado11 y cargar cantidades iguales de muestras en los pocillos del gel.</li>
			<li>Correr los geles, las proteínas de transferencia a nitrocelulosa, luego probe borrones con A11 del anticuerpo anti-amiloide, anticuerpos de anti-oligomeric tau T22 o anticuerpo de anti-Aß MOAB2 seguida de anticuerpos secundarios apropiados. Desarrollar el Blot usando procedimientos estándar de la quimioluminescencia.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para hacer un thioflavin T ensayo, usar fluorescencia de tioflavina T (ThT) para cuantificar amiloides en sobrenadantes. Para estas mediciones, utilizar sobrenadante esterilizado por filtro.<ol>
<li>Prepare una solución (x 50) de tioflavina T suspendiendo tioflavina T (ThT) de 8 mg en solución salina 10 mL tamponada fosfato (PBS). Después de mezclar, filtrar la solución a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar partículas.</li>
			<li>Para las medidas, añadir 20 μl del stock de ThT a 1 mL de PBS en una cubeta del espectrofotómetro 1 mL. Coloque la muestra diluida en un espectrofluorímetro.</li>
			<li>Medir la emisión de fluorescencia basal utilizando excitación nm 425 y exploración de la emisión de fluorescencia de 450-575 nm en 2 incrementos de nm.</li>
			<li>Realizar un time-lapse análisis mediante excitación nm 425 y 482 emisión nm, con los datos adquiridos cada 0.2 s 60 s.</li>
			<li>La inicial 20 s del time-lapse análisis medidas de fluorescencia en la cubeta en blanco. A los 20 s, pausar el análisis y añadir 10 μl del sobrenadante esterilizado por filtro a la cubeta. La cubeta la mezcla por inversión y luego vuelva a colocar el espectrofluorímetro.</li>
			<li>Reanudar el análisis basado en el tiempo, adquirir el final 40 s de datos.</li>
			<li>Al finalizar el scan Time-lapse, realizar un análisis de espectro de emisión de fluorescencia final con ajustes idénticos, como se detalla en 2.1.5.3.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+pneumonia+really+the+old+man%27s+friend%3F+Two-year+prognosis+after+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia.</a> Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).</li>
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<li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y-mediated+tau+hyperphosphorylation+impairs+microtubule+assembly+in+pulmonary+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells.</a> PLoS One. 8, e74343(2013).</li>
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<li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+infection+liberates+transmissible%2C+cytotoxic+prion+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids.</a> FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).</li>
<li>Stevens, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pseudomonas+aeruginosa+exoenzyme+Y+impairs+endothelial+cell+proliferation+and+vascular+repair+following+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Molec+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).</li>
<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creutzfeldt-Jakob+disease+and+scrapie+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer+Dis+Assoc+Disord%22%5BJournal%5D)">Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions.</a> Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).</li>
<li>Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrapie%3A+Uncertainties%2C+biology%2C+and+molecular+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches.</a> Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).</li>
<li>King, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+characteristics+of+lung+macro-+and+microvascular+endothelial+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes.</a> Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).</li>
<li>Marmont, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomeric+lipoprotein+PelC+guides+Pel+polysaccharide+export+across+the+outer+membrane+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).</li>
</ol>

Ninguno para el informe.

Aquí, simple en vitro métodos están descritos que permiten la demostración de la generación de amiloides citotóxicos durante la infección con una pulmonía que organismo. Estos métodos incluyen ensayos de citotoxicidad en cultivo celular, immunoblotting, cuantificación de célula matar utilizando un novedoso método microscópico y enlace de ThT. Análisis de los agentes citotóxicos han demostrado que son amiloide en la naturaleza (figura 2 y figur...

Los pacientes que sobreviven la neumonía han elevado las tasas de mortalidad en los meses siguientes hospital descarga1,2,3,4,5,6. En la mayoría de los casos, la muerte se produce por algún tipo de insuficiencia de órgano, incluyendo renal, pulmonar, cardiaca, o hígados eventos como la carrera5,6. Nunca se ha establecido la razón de la elevada tasa de mortalidad en esta población de pacientes.
La neumonía se clasifica como siendo ya sea adquirida en la comunidad o adquirida en el hospital (nosocomial) y los agentes causantes de neumonía incluyen bacterias, virus, hongos y productos químicos. Una de las principales causas de neumonía nosocomial es la bacteria Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa es un organismo Gram-negativo que utiliza un sistema de secreción tipo III para transferir varias moléculas efectoras, como exoenzimas, directamente en el citoplasma de las células de destino7,8. Durante la infección de células endoteliales pulmonares, las exoenzimas objetivo diversas proteínas intracelulares, incluyendo una forma endotelial de la proteína asociada a microtúbulos tau9,10,11,12 , conduce a la ruptura de la barrera endotelial dando lugar a edema pulmonar severo, disminución de la función pulmonar y, a menudo, la muerte.
Como se indicó anteriormente, los pacientes que sobreviven la neumonía inicial han elevado las tasas de mortalidad en los primeros 12 meses después del alta hospitalaria. Un mecanismo potencial para explicar este fenómeno es que se genera algún tipo de toxina duradera durante la infección inicial que conduce a pobres resultados a largo plazo. Dos observaciones apoyan esta posibilidad. En primer lugar, cultivadas pulmonar las células endoteliales que son tratadas inicialmente con p. aeruginosa no proliferan por hasta una semana después de que las bacterias se destruyen con antibióticos13. Priones en segundo lugar, larga vida y agentes con las características del prión se han demostrado en varias enfermedades humanas y animales, particularmente las enfermedades asociadas con el sistema nervioso14,15.
Nunca se han descrito métodos para examinar el potencial de producción de agentes citotóxicos duraderos durante la infección pulmonar. Aquí se describen una serie de ensayos simples en vitro que puede utilizarse para investigar producción de citotoxina y actividad después de la infección con un agente que causa común de neumonía, p. aeruginosa. Estos ensayos deben ser fácilmente adaptables para investigar la inducción de la citotoxina posible después de la infección con otros agentes causantes de neumonía, y los sobrenadantes que se generan también deberían ser útiles para investigar efectos de citotoxinas en todo órganos o animales. Por último, los ensayos que se describen aquí es muy probable que será adaptables a prueba de fluidos biológicos humanos y animales para la producción de citotoxinas en neumonía.

<table><tbody><tr><td>Conejo anti beta amiloide</td><td>Thermo</td><td>71-5800</td><td></td></tr><tr><td>A11 anticuerpo oligómero amiloide</td><td>StressMarq</td><td>SPC-506D</td><td></td></tr><tr><td>T22 anti-oligómero tau</td><td>EMD Millipore</td><td>ABN454</td><td></td></tr><tr><td>Tioflavina T</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de jeringa de 0,22 micras</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>HRP Cabra anticonejo IgG</td><td>Abcam</td><td>ab6721-1</td><td></td></tr><tr><td>Cepas PA103 y &Delta; PcrV</td><td></td><td></td><td>Estas cepas de P. aeruginosa se obtuvieron de la Dra. Dara Frank, Facultad de Medicina de la Universidad de Wisconsin, Milwaukee, WI</td></tr><tr><td>FITC Griffonia lectina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9381</td><td></td></tr><tr><td>TRITC Helix pomatia lectina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1261</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>0,22 micras nitrocelulosa</td><td>BioRad</td><td>162-0112</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo 2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Hyclone</td><td>SH30898.03IH</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin Sal disódica</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C1389</td><td></td></tr><tr><td>Concentradores de microcetrifugación- 10.000 MW de corte</td><td>Millipore</td><td>UFC801008</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio dibásico</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>795496-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de magnesio heptahidratado</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP021914221</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>G Biosciences</td><td>50-103-5801</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico heptahidratado</td><td>Sigma</td><td>S9506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Countess Contador de células automatizado</td><td>Invitrogen</td><td>C10277</td><td></td></tr></tbody></table>

métodos para la detección de amiloides siguiente infección de pulmonar endotelial células citotóxicas por pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Los pacientes que sobreviven la neumonía han elevado las tasas de mortalidad en los meses después del alta hospitalaria. Se ha presumido que la infección del tejido pulmonar durante la neumonía los resultados en la producción de citotoxinas larga vida que puede llevar a insuficiencia del órgano de extremo posterior. Hemos desarrollado en vitro ensayos para probar la hipótesis que citotoxinas son producidos durante la infección pulmonar. Las células endoteliales pulmonares aislado de rata y la bacteria Pseudomonas aeruginosa se utilizan como sistemas modelo, y la producción de cytoxins después de la infección de las células endoteliales por la bacteria se demuestra mediante cultivo celular seguido por cuantificación directa mediante los análisis de lactato deshidrogenasa y un novedoso método microscópico utilizando tecnología de ImageJ. La naturaleza amiloide de estas citotoxinas fue demostrada por thioflavin T enlace ensayos y por immunoblotting y immunodepletion usando anticuerpo anti-amiloide de A11. Posteriores análisis mediante immunoblotting demostraron que los tau y Aβ se producida y liberada por las células endoteliales después de la infección por p. aeruginosa. Estos métodos deben ser fácilmente adaptables a los análisis de muestras clínicas humanas.

Un análisis simple en vitro ha sido desarrollado para analizar la presencia de citotoxinas en sobrenadantes de células infectadas con la bacteria p. aeruginosa. Básicamente, medio de cultivo de las células infectadas se recogen 4 h después de la adición de bacteria, las bacterias se eliminan por la esterilización del filtro de la cultura sobrenadante y luego se añade el sobrenadante estéril a una nueva población de células. Las células luego se observan 21-24 h después d...

Se describen métodos sencillos para la demostración de la producción de amiloides citotóxicos después de la infección del endotelio pulmonar por Pseudomonas aeruginosa.

Métodos para la detección de amiloides siguiente infección de pulmonar endotelial células citotóxicas por Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la atención pulmonar, como ¿por qué los pacientes que sobreviven a la neumonía adquirida en el hospital tienen resultados tan malos a largo plazo? La ventaja de este método es que es sencillo y fiable, lo que significa que cualquier persona que venga al laboratorio puede aprenderlo y al día siguiente está generando datos útiles y repetibles. Aunque estos métodos analíticos se pueden aplicar para proporcionar información sobre la infección de células cultivadas in vitro, también se pueden aplicar a modelos animales y pacientes humanos.Para producir un sobrenadante citotóxico, lave un plato de 150 centímetros de células endoteliales con HBSS y diluya una colonia de P. aeruginosa a una absorbancia de 0,25 a 540 nanómetros. Diluir aún más las células bacterianas para permitir una multiplicidad de infección de 20 a uno en 20 mililitros de HBSS y sembrar las bacterias en la placa de células endoteliales. A continuación, coloque las células infectadas en una incubadora a 37 grados centígrados y con un 5% de CO2 durante cuatro o cinco horas.Es esencial que la incubación de las bacterias y de las células endoteliales se produzca durante un período de tiempo adecuado. Si la incubación es demasiado corta, los amiloides no se liberarán en el sobrenadante. Si la incubación es demasiado larga, las células se lisarán y liberarán todo su contenido en el sobrenadante.El indicador que utilizamos para una duración adecuada de la incubación es la formación de huecos en la monocapa endotelial. Cuando se pueden observar espacios en la monocapa celular mediante microscopía óptica, recoja el sobrenadante para la centrifugación para eliminar cualquier residuo celular. Decantar el sobrenadante en una jeringa que esté equipada con un filtro de 0,2 micras y pasar el sobrenadante a través del filtro para eliminar cualquier bacteria contaminante.A continuación, reserve 1,5 mililitros de sobrenadante estéril para las pruebas de citotoxicidad y congele el resto de la muestra a menos 80 grados centígrados. Para evaluar la citotoxicidad del sobrenadante recolectado, se añada la alícuota de 1,5 mililitros de sobrenadante esterilizado por filtro a un solo pocillo de una placa de seis pocillos que contenga un cultivo de células endoteliales microvasculares pulmonares confluentes. Coloque la placa en una incubadora de CO2 durante 21 a 24 horas.A continuación, se obtienen imágenes de las regiones de los cultivos tratados y de control. Importe las imágenes en una macro imagej personalizada y ajuste el contraste a 15% de píxeles saturados. Duplique las imágenes ajustadas al contraste y utilice restar el fondo para obtener imágenes de alto contraste tanto de las celdas intactas como del área de espacio dentro del campo de visión.Reste esta imagen de alto contraste de la imagen original y utilice la calculadora de imágenes y la función para combinar la imagen resultante con la imagen original. Utilice la función de umbral para convertir la imagen combinada en una máscara con los espacios en negro y las celdas intactas en blanco. Y use la función de erosión binaria para eliminar cualquier ruido de la imagen.A continuación, utilice la fracción de área para medir la proporción de píxeles blancos y negros dentro de la imagen resultante. Y trace y exprese las áreas fraccionarias para cada punto de tiempo de tratamiento, como el porcentaje del área de separación máxima. Para cuantificar los amiloides dentro del sobrenadante, agregue 20 microlitros de solución madre de tioflavina T 50X recién preparada y filtrada a un mililitro de PBS en una cubeta de espectrofotómetro de un mililitro y cargue la muestra diluida en un espectrofluorómetro.Mida la emisión de fluorescencia de referencia utilizando una excitación de 425 nanómetros. Escaneo de la emisión de fluorescencia de 450 a 575 nanómetros en incrementos de dos nanómetros. A continuación, configure el instrumento para que realice un escaneo de lapso de tiempo utilizando una excitación de 425 nanómetros y una emisión de 482 nanómetros con adquisición de datos cada 0,2 segundos durante 60 segundos.Pausa la exploración después de 20 segundos y 10 microlitros de sobrenadante esterilizado con filtro en la cubeta. Después de mezclar por inversión, vuelva a cargar la cubeta en el espectrofluorómetro y reanude el escaneo basado en el tiempo durante los últimos 40 segundos. Una vez finalizado el lapso de tiempo, realice un escaneo final del espectro de emisiones de fluorescencia utilizando la configuración de escaneo original.La adición de P. aeruginosa a las capas confluentes de células endoteliales microvasculares pulmonares induce la formación de espacios entre las células. Utilizando imagej para evaluar la citotoxicidad del sobrenadante como se demostró durante las primeras 12 horas de tratamiento, las monocapas de células confluentes aún sanas se pueden visualizar como todas las regiones blancas dentro del campo microscópico. Sin embargo, a las 18 horas después de la adición del sobrenadante recogido de los cultivos infectados con PA 103, se pueden detectar huecos en la monocapa y aumentar linealmente el área de la placa de cultivo desprovista de células hasta las 36 horas de tratamiento, momento en el que casi no se pueden observar células intactas.Se pueden obtener resultados similares utilizando la liberación de lactato deshidrogenasa como marcador de citotoxicidad. Con lactato deshidrogenasa detectada por primera vez a las 18 horas después de la adición del sobrenadante citotóxico y aumentando de forma lineal hasta que se mide la muerte celular máxima a las 36 horas. Los sobrenadantes también pueden evaluarse mediante análisis de inmunotransferencia o midiendo el cambio en la intensidad de la fluorescencia de la tioflavina T debido a cambios de confirmación inducidos por la unión de amiloide para determinar la presencia de amiloides citotóxicos en los sobrenadantes.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar sobrenadantes citotóxicos después de la infección de células endoteliales con citomonsis aeruginosa. Además, debe estar bien versado en los tipos de ensayos necesarios para caracterizar y analizar las citotoxinas que están presentes en esos sobrenadantes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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Cuantificación de amiloides inducidos por infecciones bacterianas mediante fluorescencia de tioflavina T

Fuente: Balczon, R., et al. Métodos para detectar amiloides citotóxicos después de la infección de células endoteliales pulmonares por Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)Este video demuestra el procedimiento para generar sobrenadante citotóxico a partir de células endoteliales pulmonares después de la infección por Pseudomonas aeruginosa. Describe cómo las proteínas efectoras bacterianas alteran la estructura de la célula huésped e inducen la liberación de oligómeros amiloides...

Obtención de amiloides citotóxicos después de la infección bacteriana de las células endoteliales pulmonares de rata

Source: Dubois, V., et al. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the procedure of co-culturing amoebae with mutant bacterial strains to evaluate their intracellular survival and identify virulence markers through differences in colony counts.

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Preparación y<em&gt; En Vivo</em&gt; El uso de una sonda basada en la actividad de<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Ácido amidasa

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Métodos para la detección de amiloides siguiente infección de pulmonar endotelial células citotóxicas por Pseudomonas aeruginosa (Video) | JoVE Journal

Métodos para la detección de amiloides siguiente infección de pulmonar endotelial células citotóxicas por Pseudomonas aeruginosa

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