Resección guiada por la imagen de Glioblastoma e implantación intracraneal de andamios sembrado células madre terapéuticas

El objetivo general de este procedimiento es resecar quirúrgicamente el cáncer cerebral en ratones e implantar un andamio sembrado con células madre terapéuticas que se dirigen al tumor en la cavidad de resección postoperatoria. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la terapia celular y la neurooncología, como cómo la resección quirúrgica afecta la implantación de células en la cavidad quirúrgica, qué tan efectivos son los nuevos agentes terapéuticos en el cáncer cerebral posquirúrgico y cómo los sistemas de administración basados en andamios influyen en los resultados terapéuticos. La principal ventaja de esta técnica es que las intervenciones contra el cáncer cerebral se pueden estudiar en ratones de una manera que imita de cerca el estándar clínico de atención en pacientes humanos.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la terapia con células madre administrada en andamios, también se puede aplicar a otras intervenciones, como nanopartículas, moléculas pequeñas, virus oncolíticos u otras terapias emergentes. Prepare los andamios 48 horas antes de la implantación en ratones cortando primero los andamios de PLA en piezas del tamaño de una cavidad de resección de aproximadamente dos por dos milímetros. Esterilice los andamios sumergiéndolos en etanol al 70% durante 15 minutos.

Después de 15 minutos, sumerja los andamios en PBS. A continuación, coloque andamios en el medio Eagle modificado de Dulbecco que contenga un 10% de suero fetal bovino y un 1% de penicilina-estreptomicina mientras se preparan las células para la siembra. Para preparar las células, primero levante las MSC cultivadas con tripsina al 0,05%.

Incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Después de la incubación, asegúrese de que las células se hayan levantado. A continuación, añada DMEM al matraz para inactivar la tripsina.

A continuación, transfiera el contenido del matraz a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Cuente las células con un hemocitómetro. A continuación, granule cinco veces 10 a la quinta MSC para cada andamio mediante centrifugación a 100 veces g durante cinco minutos.

Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las MSC en cinco microlitros de DMEM por cinco veces 10 a la quinta celda. A continuación, retire un andamio de la inmersión DMEM con pinzas y colóquelo en la tapa de la placa de seis pocillos. Levante el andamio de la tapa, dejando una gota de exceso de DMEM.

Vuelva a colocar el andamio en la tapa en un lugar nuevo y seco. Repita de tres a cinco veces. Luego, coloque el andamio parcialmente seco en una nueva placa de seis pocillos para sembrar.

Un andamio parcialmente seco proporciona resultados óptimos de siembra de células. Si el andamio está demasiado húmedo, las células se deslizarán fuera del andamio y se adherirán a la placa de abajo. Si el andamio está demasiado seco, la gota no se extenderá por todo el andamio, lo que dará como resultado una mala distribución inicial de las células.

Con una pipeta, mezcle suavemente el tubo de MSC para homogeneizar la suspensión, ya que algunas células pueden haberse asentado en el fondo. Pipetee lentamente 2,5 microlitros de suspensión MSC recién mezclada directamente sobre el andamio, creando una pequeña gota sobre la parte superior del andamio. Agregue 300 microlitros de DMEM a los bordes de cada pocillo para evitar la evaporación rápida de la gota de celda.

Incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos, permitiendo que las células se adhieran al andamio. Después de la incubación, use pinzas para voltear suavemente los andamios en la placa del pocillo. Siembre 2,5 microlitros de suspensión de MSC recién mezclada para dar un total de cinco veces 10 a la quinta celda sembrada por andamio.

Después de una incubación de 30 minutos para permitir que las células se adhieran al andamio, cubra los andamios con DMEM agregando dos mililitros a cada pocillo de la placa de seis pocillos. Levante suavemente los andamios para permitir que los medios fluyan por debajo de ellos. Incubar a 37 grados centígrados en este estado durante 48 horas antes de la cirugía de implantación.

Comience colocando el marco estereotáxico en la platina de un microscopio estereoscópico de disección de fluorescencia. A continuación, fije el ratón anestesiado en el marco estereotáxico con un suministro continuo de anestesia inhalada a través de un adaptador de cono nasal de isoflurano. Mantenga la temperatura corporal con una almohadilla térmica.

Aplique ungüento oftálmico en los ojos para evitar que la córnea se seque. A continuación, esterilice el lugar de la incisión del cuero cabelludo con una serie de tres toallitas con alcohol y tres toallitas Betadine. Realice la prueba del reflejo de pinzamiento del dedo del pie en cada extremidad y confirme la respuesta negativa para garantizar una anestesia adecuada.

Con pinzas, pellizque y levante suavemente el cuero cabelludo. Después de hacer una incisión rostral-caudal lineal en la línea media con tijeras quirúrgicas, irrigar el sitio de la incisión con PBS y eliminar la grasa subdérmica con un aplicador de punta de algodón con un movimiento de cepillado circular. Organice la piel de manera que la ventana craneal previamente establecida sea completamente visible.

Use una aguja de calibre 18 para perforar suavemente la duramadre justo en el interior hasta los bordes de la ventana craneal. Repita hasta que la incisión trace completamente el interior de la ventana. Extirpa la duramadre despegándola con pinzas finas, revelando el parénquima y el tumor subyacentes.

A continuación, atenúe las luces de la habitación y active el modo de fluorescencia del microscopio estereoscópico. Localice el tumor que expresa luciferasa U87 mCherry y luciferasa de luciérnaga. Cargue una punta de pipeta de 200 microlitros en el extremo del tubo de una bomba de vacío.

A continuación, encienda la bomba de vacío. Resecar el tumor aspirando suavemente el tejido fluorescente hasta que no quede ninguna señal. Para controlar el sangrado, irrigar con PBS frío y aplicar una presión constante con un aplicador de punta de algodón.

Use una combinación de solución salina, presión constante con un aplicador de punta de algodón y/o un agente hemostático, como SURGICEL, para detener el sangrado antes de implantar el andamio. Si no se controla adecuadamente, se puede formar un hematoma potencialmente peligroso. Después de la resección, apague la bomba de vacío y deseche la punta de la pipeta.

Apague la fluorescencia y la habitación volverá a iluminarse. Inmediatamente antes de la implantación, sumerja lentamente un andamio de PLA sembrado por MSC en PBS para eliminar los medios no deseados y los componentes asociados. Implante el andamio en la cavidad de resección.

Si es necesario, agregue un microlitro de fibrinógeno seguido de un microlitro de trombina para asegurar el andamio en su lugar. Una vez extraída la duramadre y el colgajo óseo de la ventana craneal ya descartado, selle la herida cerrando la piel y aplicando pegamento quirúrgico. Retire al animal del anestésico inhalado y permita que se recupere sobre una superficie caliente.

Estas imágenes de contraste de fase, fluorescentes y combinadas muestran células cancerosas U87 modificadas con construcciones lentivirales para expresar marcadores de luciferasa mCherry y luciérnaga de luciérnaga. Estas imágenes de contraste de fase, fluorescentes y combinadas muestran las imágenes correspondientes de células madre modificadas para expresar la gliferasa GFP-Renilla diagnóstica o la GFP-TRAIL terapéutica sembrada en el material del andamiaje PLA. Esta imagen de campo claro y superposición fluorescente muestra la ubicación del tumor.

Aquí se observa la cavidad de resección postquirúrgica con focos tumorales remanentes. Esta imagen muestra el andamio PLA implantado sembrado con MSC-TRAIL. Aquí, se ve tejido cerebral postmortem con el andamio superpuesto.

Esta superposición fluorescente resalta las células GFP-TRAIL. Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en menos de 30 minutos para cada ratón, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que habrá una variabilidad intrínseca en el grado de resección lograda de un ratón a otro, similar a lo que se ve en las clínicas.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar una resección quirúrgica de un tumor cerebral y evaluar su impacto en las intervenciones terapéuticas que incluyen la terapia con células madre basada en andamios.