Célula activada por el magnético clasificación estrategias para aislar y purificar sinovial líquido mesenquimales células madre derivadas de un modelo de conejo

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el protocolo de clasificación en el campo de las células madre al proporcionar un procedimiento para purificar las células madre mesenquimales directamente del líquido sinovial. La principal ventaja de esta técnica es que hemos establecido un protocolo sencillo y económico para el aislamiento y la purificación de MACS a partir de líquido sinovial de conejo. Generalmente en la investigación, debido a este método, hacemos grandes esfuerzos, porque la pluación de la población celular depende de la producción de una sola suspensión celular.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de que solo el método de clasificación de células activadas magnéticamente está aprobado por la FDA para aplicaciones clínicas. Comience este procedimiento con anestesia animal como se describe en el protocolo de texto. Para realizar la recolección de líquido sinovial articular de la rodilla del conejo, seleccione un área de aproximadamente cinco por cinco centímetros de tamaño alrededor de la rodilla.

Afeita el pelo de conejo alrededor de esta área con una afeitadora eléctrica de seguridad. Alternativamente, desinfecte el sitio del procedimiento con una solución de yodo de povidona y etanol al 75% tres veces. Luego, aplique cortinas estériles después de que el área se haya secado completamente.

Utilice una jeringa hipodérmica estéril para inyectar uno o dos mililitros de solución salina isotónica en la cavidad de la articulación de la rodilla desde el espacio articular lateral. Mueva la rodilla tres o cuatro veces y luego aspire todo el líquido sinovial a temperatura ambiente. Filtre el líquido sinovial a través de un colador de células de nailon de 40 micras para eliminar cualquier residuo, dentro de las cuatro horas.

Para cultivar las SF-MSC de conejo, recoja el fluido filtrado en tubos de centrífuga de 50 mililitros y centrifugue a 1.500 rpm durante diez minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante después de la centrifugación y lave el pellet con PBS. Después de volver a suspender el pellet con el medio de cultivo completo, coloque el medio en platos de 100 mililitros.

Incubar los platos a 37 grados centígrados en una atmósfera humidificada que contenga un 5% de dióxido de carbono. Después de 48 horas, reponga los platos con medio fresco para eliminar las células no adheridas. Reemplace el medio dos veces por semana durante dos semanas como paso cero.

Después de 14 días después de la siembra inicial, deberían haberse formado muchas colonias en las placas de cultivo. Seleccione las colonias de más de dos milímetros de diámetro. Marque dónde se encuentran las colonias seleccionadas, trazando su circunferencia en el fondo del plato.

Deseche las colonias de menos de dos milímetros de ancho con raspadores de celdas. Digiera las colonias seleccionadas con unos cinco microlitros de tripsina al 0,25% utilizando un cilindro de clonación y transfiera las colonias a un nuevo plato para pasarlas. Cuando las células alcancen aproximadamente el 80% de confluencia, aspire el medio.

A continuación, añade uno o dos mililitros de EDTA al 0,25% de tripsina a cada plato. Incube los platos durante dos o tres minutos para permitir el desprendimiento de las células. Una vez que las células se hayan desprendido, agregue una cantidad igual del medio de cultivo para inactivar la tripsina.

Pase la suspensión celular a través de un filtro celular de 40 micras y recoja el filtrado en un tubo de 15 mililitros. A continuación, gire las células a 600 veces G durante diez minutos a temperatura ambiente. Vuelva a suspender el pellet de celda en MACS Running Buffer.

Para realizar el marcaje magnético, determine el número de células con un hemocitómetro. Centrifugar la suspensión celular a 300 veces G durante diez minutos a cuatro grados centígrados. Después de aspirar completamente el sobrenadante, agregue 80 microlitros de tampón de resuspensión por cada diez millones de células totales.

Para un total de diez millones de células, agregue 20 microlitros de microperlas conjugadas con un anticuerpo monoclonal anti-conejo CD90. Mezcle las perlas magnéticas y las células de manera uniforme en los tubos. Luego incubarlos a cuatro grados centígrados durante 15 minutos en la oscuridad.

Agregue un mililitro de tampón por cada diez millones de células al tubo, y luego centrifugue a 300 veces G durante diez minutos a cuatro grados Celsius, para lavar las células. Deseche el sobrenadante después de la centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón por cada diez millones de células.

Coloque la columna, con las alas de la columna al frente, en el campo magnético del separador magnético. Enjuague la columna del separador magnético con 500 microlitros del tampón por cada diez millones de celdas. Transfiera la suspensión de una sola celda a la columna.

Deje que las células negativas pasen a través del campo magnético para descartar estas células no marcadas. Lave la columna una o dos veces con 500 microlitros de tampón por cada diez millones de celdas y deseche el flujo. Transfiera la columna a un tubo de centrífuga de 15 mililitros.

Agregue un mililitro del tampón por cada diez millones de celdas a la columna. A continuación, empuje inmediatamente el émbolo en la columna para expulsar las células marcadas magnéticamente. Repita el procedimiento mencionado anteriormente con una segunda columna separadora magnética, para aumentar la pureza de las células CD90 positivas, que pueden enriquecer la fracción eluida.

Después de centrifugar la suspensión celular a 300 veces G durante diez minutos, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con el medio de cultivo. Inocular las células en platos de 100 mililitros después de la clasificación de células activadas magnéticamente. Incubar las placas a 37 grados centígrados en una incubadora de celdas humidificada con un 5% de dióxido de carbono.

Cuando se logre una confluencia del 80 al 90% del cultivo primario, aproximadamente a los siete a diez días, digiera las células adherentes con EDTA de tripsina al 0,25% y páselas en una dilución de uno a dos para hacer el paso dos. Utilice el mismo método para pasar las células al pasaje tres, que se puede utilizar para los ensayos in vitro. Aquí se muestra la morfología de las SF-MSC de conejo cultivadas monocapa antes y después de MACS, bajo un microscopio invertido.

Antes de la clasificación, las poblaciones de células adherentes al líquido sinovial del conejo muestran heterogeneidad. Contienen diversos tipos y tamaños de células, como la morfología ovalada, de huso largo, de huso corto y estrellada. La morfología principal del pasaje dos y del pasaje seis, es una morfología de huso.

Después de MACS con CD90, las poblaciones celulares exhiben una morfología homogénea. Con el subcultivo, el número de células aumenta. El análisis de citometría de flujo demostró que las células SF-MSC de conejo eran positivas para los marcadores MSC CD44 y CD105.

Mientras que son negativos para el marcador de células endoteliales CD34 y para el marcador de células hematopoyéticas CD45. Los resultados mostraron que antes de MACS, la población de conejos SF-MSC estaba compuesta por aproximadamente un 40% de células MSC. Después de MACS, la población enriquecida contenía más del 99% de células MSC.

Aquí se muestra el análisis de citometría de flujo del marcador CD90 positivo antes y después de la clasificación MAC. La tinción con rojo de alizarina demostró que los nódulos mineralizados se formaron bajo inducción osteogénica durante tres semanas. Después de tres semanas de inducción adipogénica, se detectó la acumulación de vacuolas ricas en lípidos mediante tinción intracelular con Oil Red O.

Después de semanas de inducción condrogénica, el pellet celular se analizó histológicamente con tinción con azul de toluidina. El proteoglicano ácido positivo caracterizó las células similares a los condrocitos. Después de tres semanas de inducción, se detectó la expresión relativa de ARNm del marcador osteoblástico, el marcador adipogénico y el marcador condrogénico.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos a cuatro horas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión del aislamiento directo y la purificación de las células madre mesenquimales del líquido sinovial del conejo blanco de Nueva Zelanda. Al intentar este procedimiento, es importante recordar seleccionar aquellas colonias de más de dos mililitros de diámetro.

También produce una suspensión de una sola célula antes de la clasificación inmunomagnética, ya que las células no deseadas unidas a una célula marcada permanecerán en la perla magnética. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la clasificación de células activadas por fluorescencia, para responder a preguntas adicionales sobre la seguridad y eficacia de la purificación de las células madre mesenquimales. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la regeneración del cartílago articular exploraran las células CD ideales en la reparación del cartílago articular.

No olvide que las operaciones se realizaron en un banco de enfriamiento de arco, y siempre se deben tomar precauciones como los guantes al realizar este procedimiento. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la lesión del cartílago articular, ya que los MASC derivados del líquido sinovial son candidatos prometedores para la regeneración del cartílago articular.