Name: Célula activada por el magnético clasificación estrategias para aislar y purificar sinovial líquido mesenquimales células madre derivadas de un modelo de conejo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Aprende a aislar y purificar células madre mesenquimales de líquido sinovial de conejo mediante clasificación celular activada por magnetismo. Este protocolo simple y económico facilita la investigación en medicina regenerativa.

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Este estudio fue apoyado financieramente por las siguientes becas: la Fundación de Ciencias naturales de China (no. 81572198; Nº 81772394); el fondo para la construcción de alto nivel disciplina médica de la Universidad de Shenzhen (Nº 2016031638); la Fundación de investigación médica de la provincia de Guangdong, China (no. A2016314); Shenzhen Ciencia y tecnología proyectos (no. JCYJ20170306092215436; No. JCYJ20170412150609690; No. JCYJ20170413161800287; No. SGLH20161209105517753; No. JCYJ20160301111338144).

Todos los experimentos con animales se realizaron conforme a las directrices regionales del Comité de ética, y todos los procedimientos animales fueron aprobados por las institucional Animal Care y uso Comité de Shenzhen segundo pueblo de Hospital, Universidad de Shenzhen.
1. aislar y cultura rbSF-MSCs
<ol><li>
Preparaciones para el procedimiento de animales
	<ol>
<li>Preparar esqueléticamente maduros mujer Nueva Zelanda conejos blancos para la colección de rbSF-MSCs. realizar un examen clínico de los conejos, un día antes del procedimiento anestesia y artrocentesis. Nota: debe incluir exámenes físicos peso (2.0-2.5 kg), género (mujer) y temperatura corporal, frecuencia respiratoria y frecuencia cardíaca. Parámetro intervalos para conejos clínicamente sanos son 30-50 min para tarifa de respiración, 220-280 min de ritmo cardíaco y 38-39 º C de temperatura corporal.</li>
		<li>Rápidamente los animales de 6 h antes de la anestesia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación y procedimiento de la anestesia animal
	<ol>
<li>Refrenar el conejo con una jaula (véase Tabla de materiales) y luego inyectar 3% pentobarbital sódico en la vena marginal de la oreja en una dosis de 1 mL/kg para anestesia general.</li>
		<li>Coloque el conejo en una posición dorsal reclinada cómoda.</li>
		<li>Vigilar la frecuencia respiratoria, frecuencia cardíaca y temperatura corporal del conejo durante la anestesia.</li>
		<li>Utilice pomada oftalmológica en sus ojos para evitar la sequedad durante la anestesia.</li>
		<li>Evaluar la profundidad de la anestesia después clasificación14 de Guedel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación para el cultivo y aislamiento de MSCs
	<ol>
<li>Para cultivar rbSF MSCs, preparar 500 mL de medio de cultivo comercial (véase Tabla de materiales) suplementado con 10% comercial suplemento (véase Tabla de materiales), 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% penicilina-estreptomicina.</li>
		<li>Incubar el medio de cultivo a 37 ° C en un baño de agua.</li>
		<li>Preparar 500 mL de solución salina buffer fosfato (PBS) para aislamiento de células y lavado de células.</li>
		<li>Preparar 100 mL de solución salina isotónica para el procedimiento de artrocentesis de rodilla cavidad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Colección de uid to sinovial intra-articular de la rodilla del conejo
	<ol>
<li>Seleccione un área de 5 x 5 cm de tamaño alrededor de la rodilla y afeitar el pelo del conejo de esta zona usando una máquina de afeitar eléctrica de seguridad.</li>
		<li>Alternativamente, desinfectar el sitio del procedimiento 3 x con povidona yodo solución y 75% etanol. Luego, aplicar cortinas estériles cuando la zona se haya secado completamente.</li>
		<li>Inyectar 1-2 mL de solución salina isotónica, con una jeringa hipodérmica estéril (2 mL), en la cavidad articular de la rodilla desde el espacio articular lateral, movimiento de la rodilla 3-4 x y luego aspirar hacia fuera todo el líquido sinovial a temperatura ambiente.</li>
		<li>Filtro de la ﬂuid sinovial a través de un colador de celular de nylon 40 μm para remover cualquier suciedad dentro de 4 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultura de las MSCs rbSF
	<ol>
<li>Recoger el filtrado ﬂuid en tubos de centrífuga de 50 mL y centrifugar a 1.500 rpm por 10 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Desechar el sobrenadante después de la centrifugación, lavar el sedimento con PBS, Resuspender el precipitado con el medio de cultivo completo y entonces el medio en platos de 100 mm de la placa.</li>
		<li>Incubar las placas a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% CO2.</li>
		<li>Después de 48 h, reponer los platos con medio fresco para eliminar cualquier célula no adherente. Reemplazar el medio dos veces a la semana durante 2 semanas como paso 0 (P0). Nota: Debe haber cerca de 1 x 104 células adherentes. Células viable/ml en SF son aproximadamente 2 x 102/ml.</li>
		<li>Después de 14 días después de la chapa inicial, muchas colonias deben han formado en los platos de la cultura. Seleccione las colonias mayores de 2 mm de diámetro. Marque donde se encuentran las colonias seleccionadas por trazar su circunferencia en la parte inferior del plato.</li>
		<li>Deseche las colonias < 2 mm de ancho, utilizando raspadores de células. Digerir las colonias seleccionadas con 5 μl de tripsina 0.25%, utilizando un cilindro de clonación y transferir las colonias a una nueva placa como paso 1 (P1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cuidado postoperatorio de los animales
	<ol>
<li>Siga los procedimientos estándar de operación institucionales para el seguimiento postoperatorio y recuperación de la anestesia.</li>
		<li>Monitorear los signos vitales del conejo cada 10 minutos hasta que ha recuperado la conciencia. Finalmente, transferir el animal consciente a la jaula. No devuelva un conejo que ha experimentado la cirugía para la compañía de otros animales hasta que haya recuperado completamente.</li>
		<li>Después de la operación, desinfectar la zona con povidona yodo al 0.1%, 2 x al día durante 3 días.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CD90-positivo magnético activado celular clasificación (MACS) de la cultura primaria y MSCs rbSF
<ol><li>
Preparación de la muestra
	<ol>
<li>Cuando las células alcanzan alrededor de 80% de confluencia, aspirar el medio y luego añadir 1-2 mL de 0.25% tripsina-EDTA a cada plato.</li>
		<li>Incubar los platos para 2-3 min permitir la separación de la célula.</li>
		<li>Una vez que las células son separadas, añadir una cantidad igual de medio de cultivo para hacer inactivo de la tripsina.</li>
		<li>Pasar la suspensión celular a través de un tamiz de 40 μm celular, recoger el filtrado en un tubo de 15 mL y luego girar por las células a 600 × g por 10 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Resuspender el precipitado de células en MACS corriendo buffer (PBS, pH 7.2, 0.5% albúmina de suero bovino y 2 mM EDTA) y luego contar el número de celular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etiquetado magnético Nota: Ordenar los MSCs rbSF con una célula activada por el magnético clasificación kit de columnas, un soporte y separadores (véase Tabla de materiales).<ol>
<li>Determinar el número de celular utilizando un hemocitómetro.</li>
		<li>Centrifugar la suspensión celular en 300 × g por 10 min a 4 ° C. Aspire completamente el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir 80 μl de buffer de resuspensión por 107 de células totales.</li>
		<li>Para 107 de células totales, añadir 20 μl de conjugado con un anticuerpo monoclonal de CD90 anti-conejo microbeads.</li>
		<li>Mezclar los granos magnéticos y células uniformemente en los tubos, luego incubar a 4 ° C durante 15 min en la oscuridad.</li>
		<li>Añadir 1 mL de buffer por 107 células en el tubo y luego la centrifugar a 300 × g por 10 min a 4 ° C para lavar las células. Desechar el sobrenadante después de la centrifugación.</li>
		<li>Resuspender el precipitado en 500 μl de buffer por 107 células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Separación magnética
	<ol>
<li>Coloque la columna con las alas de la columna al frente en el campo magnético del separador magnético.</li>
		<li>Enjuagar la columna separador magnético (MS) con 500 μl del buffer por 107 células.</li>
		<li>Transferir la suspensión sola celda en la columna. Que las células negativas pasan por el campo magnético para desechar estas células sin etiqueta.</li>
		<li>Lavar la columna 1-2 x con 500 μl del buffer por 107 células y descartar el flujo a través.</li>
		<li>Transferencia de la columna en un tubo de centrífuga (15 mL).</li>
		<li>Añada 1 mL de buffer por 107 células en la columna y entonces inmediatamente empuje el émbolo en la columna para eliminar las células magnéticamente etiquetadas.</li>
		<li>Repita el procedimiento anterior con una segunda columna MS para aumentar la pureza de CD90+ las células, que pueden enriquecer la fracción eluída.</li>
		<li>Centrifugar la suspensión celular en 300 × g durante 10 minutos, aspirar el sobrenadante y resuspender con el medio de cultivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultura de la CD90+ rbSF MSCs
	<ol>
<li>Inocular las células en los platos de 100 mm después de la clasificación magnética celular activado.</li>
		<li>Incubar las placas a 37 ° C en un incubador celular humidificada con 5% CO2.</li>
		<li>Cuando se consigue el 80-90% de confluencia de la cultura primaria, en unos 7-10 días, digerir las células adherentes con 0.25% tripsina-EDTA y paso a una dilución de 1:2 para hacer el paso 2 (P2).</li>
		<li>Utilice el mismo método para pasar las células a paso 3 (P3), que pueden ser utilizadas para las pruebas en vitro . Nota: Después de la subcultura y la purificación, se obtienen aproximadamente 1 x 107 rbSF-MSCs.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. identificación de MSCs rbSF
<ol><li>
Confirmación de marcador superficial de las rbSF MSCs mediante citometría de flujo
	<ol>
<li>Cuando las MSCs son 80-90% confluente en P3, lavan las células con PBS y tratar con 1 mL de 0.25% tripsina-EDTA. Luego, incubar las MSCs a 37 ° C durante 2-3 min hasta que las células son separadas.</li>
		<li>Cosecha de las células, usando 10 mL de PBS, transferir a un tubo cónico (15 mL) y centrifugar a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante. Resuspender el precipitado de células en 500 μl de PBS y transferir a un tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Incubar una dilución 1: 100 del conjugado con FITC y PE-conjugado anticuerpos (isotipo, FITC-CD34/PE-CD45, FITC-CD105/PE-CD44) por 1 h en la oscuridad a 4 ° C.</li>
		<li>Centrifugar la mezcla a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente y lavan las células dos veces con PBS por centrifugación a 300 x g durante 5 minutos cada vez. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender las células en 500 μl de PBS, transfiera la suspensión de células en un tubo de fondo redondo (5 mL) y analizarlos utilizando un citómetro de flujo. Nota: Adquirir datos en un citómetro equipado con dos canales de fluorescencia: 533/30 y 585/40. Para cada isotipo de la fluorescencia, utilice el control de isotipo para regular el voltaje del láser adecuado y ajustar la intensidad mínima necesaria para obtener un histograma de fluorescencia que muestra los bordes izquierdo y derecho del pico. Recoger un mínimo de 10.000 eventos para los análisis estadísticos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Multidifferentiation de las MSCs rbSF Nota: Uso P3 rbSF-MSCs para los ensayos de multidifferentiation en vitro .<ol>
<li>
Diferenciación osteogénica
		<ol>
<li>Preparar el medio de inducción osteogénica: DMEM basic (1 x) que contiene 50 mM de L-ascórbico ácido-2-fosfato 10 mM de α-glicerofosfato y 100 nM de la dexametasona.</li>
			<li>Las células en 103 células/cm2 en una placa de cultivo de tejidos 6 bien la semilla y de la cultura en el medio de inducción osteogénica.</li>
			<li>Cambiar el medio de inducción cada 3 días durante 3 semanas.</li>
			<li>Fijar las células con formaldehído al 4% durante 30 min a temperatura ambiente una vez finalizada la diferenciación, las células de tinción con rojo de alizarina 1% por 5 min y lavar luego ellos 3 x con PBS15.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Diferenciación de Adipogenic
		<ol>
<li>Preparar el medio de inducción de adipogenic: DMEM basic (1 x) que consta de 100 mM de indometacina 10 mg/mL de insulina humana recombinante, 1 mM de dexametasona y 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina.</li>
			<li>Tratar el P3 rbSF-MSCs para 3 semanas en el medio de inducción de adipogenic.</li>
			<li>Después de 3 semanas, mancha las vacuolas del lípido neutral usando aceite rojo O para confirmar la diferenciación adipogenic. Fijar las células en una solución de formaldehído 4% durante 30 min a temperatura ambiente y luego lavar 3 veces con PBS16.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Diferenciación condrogénica
		<ol>
<li>Preparar el medio de inducción condrogénica: DMEM basic (1 x) que consta de 10 ng/mL de TGFβ1, 1% de su suplemento, 0.35 m m de la L-Prolina, 100 nM de dexametasona, 50 mM de L-ascórbico ácido-2-fosfato y 1 mM de piruvato de sodio.</li>
			<li>Utilizar pellets de cultivo para la inducción condrogénica. Centrifugar 5 × 105 P3 rbSF-MSCs a 1500 rpm durante 10 min en un tubo de polipropileno (15 mL) para formar un pellet.</li>
			<li>La cultura las pastillas durante 3 semanas con el medio de inducción condrogénica.</li>
			<li>Cambiar el medio cada 3 días durante 3 semanas.</li>
			<li>Después de la inducción de 3 semanas, incrustar el sedimento celular con parafina, sección en rodajas de 4 mm y con 0.1% de la mancha azul de toluidina durante 30 min a temperatura ambiente de17.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Extracción de RNA total y análisis por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR)
	<ol>
<li>Aislar el ARN total de las células después de la inducción de la diferenciación de 3 semanas usando la extracción de RNA comercial kit (véase Tabla de materiales).<ol>
<li>Retire el medio de cultivo en la placa de cultivo y añadir 1 mL de reactivo de aislamiento.</li>
			<li>Lyse las células mediante pipeteo repetido hasta que la solución es homogénea. Incubar a temperatura ambiente durante 3 minutos.</li>
			<li>Transferir el lisado de células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
			<li>Añada 100 μl de cloroformo, agitar por 15 x mano e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 3 minutos.</li>
			<li>Centrifugar el tubo a 12.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
			<li>Añadir 500 μl de isopropanol y precipitar el ARN durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
			<li>Centrifugar a 12.000 g del × de minat 10 4 ° C. El pellet de RNA debe ser visible en la parte inferior del tubo.</li>
			<li>Quite el sobrenadante y añadir 500 μl de etanol 75%. Brevemente, haga girar el tubo durante varios segundos para lavar el pellet de RNA. Centrifugue a 7.500 × g por 5 min a 4 ° C.</li>
			<li>Eliminar el etanol residual.</li>
			<li>Disolver el pellet de RNA en 10 μl de agua DEPC y coloque los tubos en hielo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Inversa transcribir ARN en ADNc con una síntesis de la DNA kit (véase Tabla de materiales). Nota: Realice los siguientes procedimientos en el hielo.<ol>
<li>Preparar la mezcla principal de reversa de la transcripción.</li>
			<li>Añada 25 μl de RNA tratado con DNasa a cada tubo con 1 μg de ARN.</li>
			<li>Incubar la mezcla a las temperaturas siguientes utilizando un termociclador PCR: 26 ° C durante 10 minutos (para permitir el random hexamers a Recueza), 42 ° C por 45 min (transcripción reversa) y 75 ° C durante 10 minutos (inactivar la transcriptasa inversa).</li>
			<li>Inmediatamente analizar la resultante cDNA por PCR cuantitativa en tiempo real y almacenar a-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Realizar el análisis de expresión génica con un sistema PCR en tiempo real cuantitativo.<ol>
<li>Uso de qRT-PCR Master Mix (véase Tabla de materiales) para llevar a cabo la polimerización en cadena. Los cebadores PCR de GAPDH, Runx2, Agg y PPARy se enumeran en la tabla 1.</li>
			<li>Calcular la expresión del gen mediante el métodoΔΔCT 2−.</li>
			<li>Realizar un análisis estadístico utilizando el software estadístico estándar. Use una prueba t de muestras independientes para comparar las medias de grupo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

La existencia de las MSCs en el líquido sinovial proporciona una alternativa para la terapia celular. Estudios anteriores han demostrado que lesiones sitios contienen cantidades más altas de células madre mesenquimales en su líquido sinovial, que puede ser correlacionado positivamente con el período posterior a la lesión5. El MSCs en el líquido sinovial pueden ser beneficiosos al tejido para mejorar la curación espontánea después de una lesión18,<sup class="xref"...

MSCs se han sugerido como una fuente valiosa para la medicina regenerativa, especialmente para las lesiones de cartílago. MSCs, incluyendo condrocitos, osteoblastos, adipocitos, miocitos esqueléticos y viscerales células stromal, ampliamente amplían las áreas para el trasplante de células madre debido a su alta expansión tasa y multilineal diferenciación potencial1. MSCs pueden ser aislados de los esquelético muscular, membrana sinovial, la médula ósea y tejido adiposo2,3,4. Resultados tienen también confirmó la presencia de MSCs en el líquido sinovial, y la investigación anterior ha identificado MSCs derivados del líquido sinoviales (SF-MSCs) como candidatos prometedores para la regeneración articular5,6.
Sin embargo, investigación y experimentación preclínica en muestras humanas están sujetas a muchas cuestiones éticas. En cambio, conejos han sido y siguen siendo los más utilizados las especies animales para demostrar que el trasplante de MSCs puede reparar el daño de cartílago. En los últimos años un número creciente de investigadores ha estudiado las células madre mesenquimales conejo (rbMSCs) ambos en vitro y en vivo, como estas células son MSCs similares al ser humano en su fisiología celular biología y tejido. Asimismo, los rbMSCs son capaces de adherirse a las superficies plásticas, mostrando morfología de fibroblastos fusiformes en MSCs humanos. Además, las muestras mesenquimales conejo son simples y fáciles de obtener7. Además, los puntos más importantes son que rbMSCs expresan marcadores de superficie, como el CD44, CD90, CD105, y que se conserva la diferenciación multilineal potencial, que está de acuerdo con los criterios para la identificación de las poblaciones de MSC como definido por la sociedad internacional de terapia celular8,9. En particular, son capaces de condrogénesis no hipertrófica cuando inducida por TGF-β1, así haciéndolos fuentes celular adecuado para el cartílago articular fenotípicamente regeneración10,11, chondroprogenitors líquidos sinoviales 12.
Sin embargo, el aislamiento de SF-MSCs es mucho diferente de otros tejidos, incluyendo el cordón umbilical, tejido adiposo, sangre periférica y médula ósea. Actualmente, los enfoques más comunes para la purificación y separación de SF-MSCs son citometría de flujo y basado en grano separación inmunomagnética, aunque el método de citometría de flujo requiere un entorno específico y altamente costosos instrumentos13.
Este artículo presenta un procedimiento para la recolección simple y mínimamente invasivo de muestras de líquido sinovial de Nueva Zelanda conejos blancos. Durante el procedimiento, los MSCs rbSF estable expandida en vitro y entonces aislaron con CD90 positivos procedimientos magnéticos basados en grano. Por último, el protocolo muestra cómo se obtiene MSCs con alta pureza y viabilidad de las fuentes de células cosechadas.
En el presente Protocolo, el aislado rbSF-MSCs se caracterizan basado en su morfología, expresión de marcadores específicos y pluripotencia de células madre. Immunophenotyping de basados en citometría de flujo revela una expresión positiva significativa de CD44 y CD105, mientras que la expresión de CD45 y CD34 es negativa. Por último, un ensayo en vitro para MSCs rbSF demuestra la diferenciación osteogénica adipogenic y condrogénica de estas células.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MesenGro</td><td>StemRD</td><td>MGro-500 1703</td><td>Warm in 37 &deg; C baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>MesenGro Suplemento</td><td>StemRD</td><td>MGro-500 M1512</td><td>Componente del medio de cultivo MSCs</td></tr><tr><td>DMEM básico</td><td>Gibco Inc.</td><td>C11995500BT</td><td>MSCs medio de diferenciación</td></tr><tr><td>Solución salina isotónica</td><td>Litai, China</td><td>5217080305</td><td>Cavidad reactivo de procedimiento de artrocentesis</td></tr><tr><td>Salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>HyClone Inc.</td><td>SH30256.01B</td><td>PBS, libre de Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Suero bovino fetal (FBS)</td><td>Gibco Inc.</td><td>10099-141</td><td>Componente del medio de cultivo MSCs Solución de</td></tr><tr><td>yodo Povidona</td><td>Guangdong, China</td><td>150605</td><td>Agente de esterilización</td></tr><tr><td>75% etanol</td><td>Lircon, China</td><td>170917</td><td>Agente de esterilización</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA</td><td>Gibco Inc.</td><td>25200-056</td><td>Reactivo de disociación celular</td></tr><tr><td>1% Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco Inc.</td><td>15140-122</td><td>Componente del medio MSCs</td></tr><tr><td>MACS Running Buffer</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>5160112089</td><td>Contiene solución salina tamponada con fosfato (PBS), 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) y 2</td></tr><tr><td>microperlas conjugadas con anticuerpos mMEDTA CD90</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>5160801456</td><td>para la clasificación de células activadas</td></tr><tr><td>magnéticamente Piruvato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>Componente de las MSCs condrogénicas </td></tr><tr><td>diferenciación dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td>Componente de la diferenciación osteogénica de las MSC</td></tr><tr><td>ITS</td><td>BD</td><td>354352</td><td>1%, Componente de la diferenciación condrogénica de las MSCs</td></tr><tr><td>L-prolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5607</td><td>0,35 mM, Componente de la diferenciación condrogénica de las MSCs</td></tr> ácido <tr><td>L-ascórbico-2-fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td>50 mM, Componente de la diferenciación condrogénica de las MSC</td></tr><tr><td>3-isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td>0,5 mM, Componente de la diferenciación adipogénica</td></tr><tr><td>Indometacina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td>100 mM, Componente de la diferenciación adipogénica</td></tr><tr><td>TGF&beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>10 ng/mL, Componente de las MSCs diferenciación condrogénica</td></tr>&<tr><td>alfa;-glicerophsphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6751</td><td>Componente de la diferenciación osteogénica de las MSCs</td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal CD34, FITC Bioss conjugado</td><td></td><td>bs-0646R-FITC Marcador de</td><td>células madre hematopoyéticas</td></tr><tr><td>Anticonejo de ratón CD44 Bio-Rad</td><td></td><td>MCA806GA</td><td>membrana Thy-1 glicoproteína (marcador de MSCs)</td></tr><tr><td>CD45 (anticuerpo monoclonal)</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA808GA</td><td>Marcador de células madre hematopoyéticas</td></tr><tr><td>Marcador de anticuerpos CD105</td><td>Genetex</td><td>GTX11415</td><td>Marcador de MSCs</td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030</td><td>Precipitados Extracción de ARN fases orgánicas</td></tr><tr><td>Triclorometano</td><td>Wengué, China</td><td>61553</td><td>Extracto de ARN total</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>Aislado de ARN total</td></tr><tr><td>SYBR mezcla maestra verde</td><td>Takara Bio, Japón</td> Kit de síntesis de ADNc para <td>prueba de PCR</td><td>RR420A</td></tr><tr><td></td><td>Takara Bio, Japón</td><td>RR047A</td><td>Transcrito inverso a ADN complementario</td></tr><tr><td>Alizarina Rojo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td>Tinción de compuestos de calcio</td></tr><tr><td>Azul de toluidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89640</td><td>Tinción de tejido cartilaginoso</td></tr><tr><td>Aceite Solución roja O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1391L</td><td>Tinción de vacuolas lipídicas</td></tr><tr><td><fuerte>Equipo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separador</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-102</td><td>Para la clasificación por células activadas magnéticamente</td></tr><tr><td>MultiStand</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-303</td><td>Para la clasificación por células activadas magnéticamente</td></tr><tr><td>Columnas MS</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-201</td><td>Para la clasificación de células activadas magnéticamente</td></tr><tr><td>Filtro de células</td><td>FALCON Inc.</td><td>352340</td><td>40 &mu; m</td></tr><tr><td>Hemocitómetro de</td> nylon <td>ISOLAB Inc.</td><td>075.03.001</td><td>Recuento de células</td></tr><tr><td>Plato Falcon de 100 mm</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>Plato de cultivo celular</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C Tubos de</td> centrífuga de <td>extracción de ARN y PCR</td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>91050</td><td>Esterilizado por rayos gamma</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de alta velocidad</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>Celdas de centrífuga</td></tr><tr><td>Célula de dióxido de carbono incubadora</td><td>Thermo scientific</td><td>3111</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Instrumento de PCR en tiempo real Life</td><td>Tech</td><td>Life Tech QuantStudio</td><td>Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real</td></tr><tr><td>Citómetro de flujo</td><td>BD Biosciences</td><td>342975</td><td>Analizador</td></tr> celular <tr><td>Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>O25456F</td><td>Transferir el líquido</td></tr><tr><td>Cilindro de clonación</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3983-50EA</td><td>Aislar y seleccionar colonias celulares individuales</td></tr><tr><td>Jeringa hipodérmica estéril</td><td>Double-Dove, China</td><td>131010</td><td>Procedimiento de artrocentesis</td></tr><tr><td>Jaula para conejos</td><td>Zhike, China</td><td>ZC-TGD</td><td>Sujetar al conejo</td></tr></tbody></table>

célula activada por el magnético clasificación estrategias para aislar y purificar sinovial líquido mesenquimales células madre derivadas de un modelo de conejo

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Las células madre mesenquimales (MSCs) son la fuente principal de la célula para terapia basada en células. Pueden utilizar MSCs de líquido sinovial de la cavidad articular para la ingeniería del tejido fino del cartílago. MSCs de líquido sinovial (SF-MSCs) han sido considerados candidatos prometedores para la regeneración articular, y su potencial beneficio terapéutico les ha hecho un tema de investigación importante últimamente. SF-MSCs de la cavidad de la rodilla del conejo Nueva Zelanda blanco pueden ser empleados como modelo traduccional optimizado para evaluar humana medicina regenerativa. Por medio de CD90-basado celular activado magnética clasificación tecnologías (MACS), este protocolo con éxito obtiene conejo SF-MSCs (rbSF-MSCs) de este modelo de conejo y completamente demuestra el fenotipo MSC de estas células induciendo a distinguir a osteoblastos, adipocitos y condrocitos. Por lo tanto, este enfoque puede aplicarse en la investigación en biología celular e Ingeniería del tejido fino usando procedimientos y equipos sencillos.

Aislamiento, purificación y la cultura de las rbSF MSCs: Este protocolo utiliza MACS para aislar rbSF-MSCs, basados en la expresión del marcador de superficie MSC CD90. Figura 1muestra un diagrama de flujo proceso de rbSF-MSCs aislamiento, purificación, caracterización y el protocolo de cultivo en vitro .
Morfología de la célula después de la célula activada magn...

Este artículo presenta un protocolo sencillo y económico para el simple aislamiento y purificación de células madre mesenquimales del líquido sinovial del conejo blanco de Nueva Zelanda.

Célula activada por el magnético clasificación estrategias para aislar y purificar sinovial líquido mesenquimales células madre derivadas de un modelo de conejo

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el protocolo de clasificación en el campo de las células madre al proporcionar un procedimiento para purificar las células madre mesenquimales directamente del líquido sinovial. La principal ventaja de esta técnica es que hemos establecido un protocolo sencillo y económico para el aislamiento y la purificación de MACS a partir de líquido sinovial de conejo. Generalmente en la investigación, debido a este método, hacemos grandes esfuerzos, porque la pluación de la población celular depende de la producción de una sola suspensión celular.La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de que solo el método de clasificación de células activadas magnéticamente está aprobado por la FDA para aplicaciones clínicas. Comience este procedimiento con anestesia animal como se describe en el protocolo de texto. Para realizar la recolección de líquido sinovial articular de la rodilla del conejo, seleccione un área de aproximadamente cinco por cinco centímetros de tamaño alrededor de la rodilla.Afeita el pelo de conejo alrededor de esta área con una afeitadora eléctrica de seguridad. Alternativamente, desinfecte

magnetic-activated-cell-sorting-strategies-to-isolate-purify-synovial

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Rata MSC fueron aisladas de fémur y la tibia y luego enriquecido por la clasificación de células magnéticas. Células seleccionadas fueron confirmados para la expresión de marcadores de superficie por citometría de flujo. Estas células fueron cultivadas a una densidad de clones para formar colonias aisladas y luego estas colonias fueron separados por cilindros de clonación.

Aislamiento y enriquecimiento de las células de rata madre mesenquimales (MSC) y la separación de una sola colonia Derivado MSC

Se describe una técnica experimental para el tratamiento de defectos osteocondrales en la articulación de la rodilla del conejo. La implantación de células madre mesenquimatosas alogénicas en defectos osteocondrales proporciona un desarrollo prometedor en el campo de la ingeniería de tejidos. La preparación de la fibrina por células...

El tratamiento de los defectos osteocondrales de articulación de la rodilla del conejo mediante la implantación de células madre mesenquimales alogénicas en coágulos de fibrina

Este protocolo describe una técnica de aislamiento para obtener células mesenquimales del estroma residentes de pulmón primarios de ratas, mediante el uso de la digestión enzimática, la separación por gradiente de densidad, la adherencia de plástico y CD146 + selección de perlas magnéticas.

Aislamiento de CD146<sup&gt; +</sup&gt; Las células estromales mesenquimales de pulmón Residente de los pulmones de ratas

Presentamos las técnicas necesarias para aislar la fracción vascular estromal (FSV) de los depósitos de tejido adiposo inguinal (subcutáneo) y perigonadal (visceral) de ratón para evaluar su expresión génica y actividad colagenolítica. Este método incluye el enriquecimiento de células madre derivadas de alto tejido adiposo (ASC) Sca1 mediante separación celular inmunomagnética.

La separación inmunomagnética de Sca1 depósitos de grasa específica<sup&gt; alta</sup&gt; Células Madre derivadas de tejido adiposo (ASC)

Se presenta un protocolo que establece células madre mesenquimales (MSCs) aisladas del líquido sinovial y de la médula ósea de minicerdos y recolectadas de forma no invasiva mediante aspiración con jeringa. El fenotipado celular se realizó mediante citometría de flujo después del aislamiento celular y cultivo in vitro de médula ósea y fluidos sinoviales derivados de MSCs.

Aislamiento y Celular del fenotipo de células madre mesenquimales derivadas del líquido sinovial y la médula ósea de cerdos enanos

Condrogénesis de células madre requiere un ajuste fino de las condiciones de cultivo. A continuación, presentamos un enfoque magnético para la condensación de las células, un paso esencial para iniciar la condrogénesis. Además, mostramos que la maduración dinámica en un biorreactor se aplica estimulación mecánica a las construcciones celulares y mejora la producción de la matriz extracelular cartilaginosa.

3D agregación magnética Stem Cell y biorreactor de maduración para la regeneración del cartílago

Aquí, presentamos un protocolo para producir un gran número de exosomas de grado GMP a partir de células madre mesenquimales del líquido sinovial utilizando un biorreactor 3D.

Preparación a gran escala de exosomas derivados de células madre mesenquimales del líquido sinovial mediante cultivo de biorreactores 3D

El presente estudio proporciona un protocolo modificado para aislar macrófagos sinoviales y fibroblastos del tejido de artritis inflamatoria murina.

Aislamiento y cultivo de macrófagos sinoviales primarios y fibroblastos a partir de tejido murino de artritis

Este estudio ha establecido un método estable y eficiente para el aislamiento, cultivo y determinación funcional de células madre CD34+ residentes en la pared vascular (CD34+ VW-SCs). Este método de aislamiento fácil de seguir y eficaz en el tiempo puede ser utilizado por otros investigadores para estudiar los posibles mecanismos implicados en las enfermedades cardiovasculares.

Aislamiento inmunomagnético de células madre CD34+ residentes en la pared vascular de ratones

Las células madre mesenquimales de la médula ósea de la mandíbula tienen funciones significativas en la diferenciación diversa, la autorrenovación y la modulación inmunitaria. Se han convertido en un reservorio crucial de células precursoras en terapia génica, ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. Aquí, presentamos un método único para aislar células madre mesenquimales de médula ósea de la mandíbula en ratas.

Técnica para el aislamiento y cultivo de células madre mesenquimales de médula ósea de mandíbula de rata

Este protocolo describe un método de clasificación basado en perlas magnéticas que utiliza anticuerpos de citometría de flujo marcados con ficoeritrina (PE) y microperlas anti-PE para aislar subpoblaciones específicas de células madre mesenquimales con alta positividad de marcadores objetivo postclasificación y actividad metabólica preservada basada en CCK-8 bajo las condiciones probadas, sin requerir costosos clasificadores celulares ni perlas personalizadas específicas para cada objetivo.

Aislamiento y validación de subpoblaciones de células madre mesenquimales positivas para podoplanina utilizando una estrategia indirecta de perlas magnéticas

Aprende a aislar y purificar células madre mesenquimales de líquido sinovial de conejo mediante clasificación celular activada por magnetismo. Este protocolo simple y económico facilita la investigación en medicina regenerativa.

Célula activada por el magnético clasificación estrategias para aislar y purificar sinovial líquido mesenquimales células madre derivadas de un modelo de conejo (Video) | JoVE Journal

Célula activada por el magnético clasificación estrategias para aislar y purificar sinovial líquido mesenquimales células madre derivadas de un modelo de conejo

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