Name: Digestión de proteínas, ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño para optimizar el aislamiento de exosomas de suero y Plasma de sangre humana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Aprende a purificar exosomas de suero y plasma humano mediante digestión proteica, ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño. Este método optimizado mejora la identificación de biomarcadores diagnósticos.

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Esta investigación fue apoyada por fondos internos del CSU (a KMD), ATCC contrato #2016-0550-0002 (un subcontrato de NIAID HHSN272201600013C) y la Fundación Bill y Melinda Gates (OPP1039688) (a KMD/recuperación). Agradecemos a la experiencia de investigación NSF para programa de verano de estudiantes universitarios (REU) en la Universidad Estatal de Colorado para soporte adicional.

Este trabajo se determinó no investigación de sujeto humano sobre la revisión inicial de Colorado State University institucional revisar Board (IRB), todas las muestras humanas fueron obtenidas como muestras anónima del biorepositorio de IVT Bioreclamation y recogido bajo protocolos IRB aprobado.
1. preparación de crudo muestra (Plasma o suero) por vesículas de mayor granulación y detritos celulares
Nota: Consideración de seguridad: plasma, suero y otros fluidos biológicos son materiales con riesgo biológico y debe manipularse con especial cuidado, usando equipo de protección personal básico, incluyendo guantes y bata de laboratorio. Se recomienda que las muestras biológicas se procesan en una bioseguridad gabinete; Si no está disponible, se recomienda el uso de protección para los ojos.
<ol><li>Equilibrar un suero o una muestra de plasma colocando el tubo en condiciones de no sacudir en el refrigerador de 4 ° C durante la noche (de cualquiera de los dos -20 o -80 ° C).</li>
	<li>Alícuota de 250 μl de la muestra en un tubo de microcentrífuga utilizando una pipeta de 1000 μl.</li>
	<li>Centrifugar la muestra a 18.000 x g durante 30 min a 4 ° C.</li>
	<li>Con una pipeta de 200 μL, quitar 200 μL del sobrenadante despejado y añadir a un nuevo tubo de microcentrífuga. Evitar cualquier material peletizado al transferir el sobrenadante. Deseche el material peletizado.</li>
	<li>Cuantificar el contenido de proteína de la muestra de ensayo de bicinchoninic ácido (BCA), usando el protocolo del fabricante. Para realizar el ensayo, diluir la muestra 1:50 en 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS). Probar cada muestra por duplicado. Nota: Uso de 1 x PBS a través del Protocolo a menos que se indique lo contrario. En promedio, 200 μL de suero clarificado o plasma (después de 18.000 x g) dará 15 mg de proteína total. Otros tipos de muestras, con contenido de proteínas superior o inferior, pueden requerir diluciones adicionales de BCA.</li>
	<li>Alícuota 10 mg de la muestra en un tubo nuevo de microcentrífuga. Utilizar la concentración obtenida en el paso 1.5 para calcular el volumen correspondiente de muestra. Parte alícuota de la muestra con una pipeta de 200 μl. Nota: Se recomienda almacenar la muestra restante a-80 ° C. Utilice alícuota de la muestra en diferentes tubos de 10 mg por tubo para evitar múltiples hielo-deshielo ciclos en el futuro.</li>
</ol>2. digestión de proteínas de la sangre no exosomal
Nota: El paso de digestión está diseñado para reducir las proteínas no exosomal que pueden purificar conjuntamente con exosomas. Si preservación de proteínas de superficie de exosomas se requiere para los análisis posteriores, debe tenerse en cuenta que este paso tiene el potencial de interferir en este análisis. La detección de la exosomal CD63, una proteína de superficie expuesta tetraspanina, no fue afectada significativamente negativamente por este proceso.
<ol><li>Preparar solución de proteinasa K a una concentración de 500 μg/mL en PBS. Añadir la cantidad correspondiente de proteinasa K en un tubo cónico. Luego añadir el tampón y el vortex durante 30 s, 3 x a temperatura ambiente.</li>
	<li>Añadir 50 μl de solución de proteinasa K a la alícuota de muestra de 10 mg y suavemente mezclar mediante pipeteo arriba y abajo con una pipeta μl 200.</li>
	<li>Incubar la muestra a 37 ° C en un baño de agua durante 30 minutos lugar el tubo en un bastidor de tubo de flotador y evitar la completa inmersión del tubo en el baño de agua para evitar posibles fugas.</li>
	<li>Transferir la muestra y bastidor de tubo flotante para un baño de agua de 60 ° C durante 10 minutos, para inactivar la proteinasa K.</li>
</ol>3. eliminación de pequeñas proteínas y péptidos por ultrafiltración de la centrífuga
<ol><li>Enjuagar un dispositivo de ultrafiltración que contiene 100 kDa peso molecular (MWCO) de corte filtro previo de PBS a usar. Para ello, Añadir 500 μl de PBS, usando una pipeta de 1000 μl del filtro. Gire el dispositivo a 3.700 x g por 5 min descartar cualquier restante retenido así como el efluente. Nota: La capacidad de volumen de muestra del dispositivo de ultrafiltración debe ser 0,5 mL - 4 mL para asegurar que el volumen de muestra reducido final de 50 μl es alcanzable.</li>
	<li>Tomar la muestra del paso 2.4 y aumentar el volumen a 500 μl agregando PBS. Pipetear la muestra en el dispositivo de ultrafiltración previamente enjuagada. Nota: En promedio, el volumen de muestra en el paso 2.4 es 185 μl (120 a 150 μL de muestra y 50 μl de solución de proteinasa K).</li>
	<li>Coloque el dispositivo de ultrafiltración en una centrífuga de ángulo fijo sobremesa a 3.700 x g a 4 ° C hasta que la muestra se reduce a un volumen de 50 μl. PRECAUCIÓN: Cuando se utilicen dispositivos de ultrafiltración con paro volumen, debe tenerse cuidado para evitar la completa sequedad de la membrana del filtro durante los pasos de centrifugación.</li>
	<li>Añadir 500 μl de PBS directamente en el filtro de membrana y la pipeta hacia arriba y abajo 5 veces. Centrifugar como en el paso 3.3. Realizar este paso de lavado un total de 3 veces.</li>
	<li>Transferir el retenido final de 50 μL en un nuevo tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Enjuague el filtro de membrana con 200 μL de PBS pipeteo arriba y abajo 10 veces y transferir el lavado al tubo de paso 3.5.</li>
	<li>Coloque el soporte del filtro en la posición inversa en un tubo nuevo. Ejecute una recuperación vuelta inversa por 5 min a 2.000 x g para recuperar la muestra restante de la membrana. Piscina la muestra con la muestra del paso 3.5.</li>
</ol>4. purificación de vesículas por cromatografía por exclusión de tamaño (SEC)
<ol><li>Agregar 850 μl de la mezcla de la SEC, con los granos con MWCO de 700 kDa, en una columna de flujo de gravedad vacío, tapado con una pipeta de 1000 μl. Colocar las columnas en un tamaño apropiado rack equipado con bandeja de goteo.</li>
	<li>Destape la parte inferior de la columna y dejar que el drenaje líquido durante 5 minutos. Una vez escurrido, añadir 10 mL de PBS para lavar la resina. Deje 20 minutos para el lavado drenar desde la columna.</li>
	<li>La concentrada, proteinasa K tratados muestra de paso 3.5 en un tubo cónico de 15 mL y aumentar el volumen de muestra de 5 mL añadir PBS con una pipeta serológica. Mezclar el tubo suavemente, meciendo durante 1 minuto y luego lentamente la muestra a la columna preparada en el paso 4.2 con una pipeta serológica. Nota: Una vez que se quita la tapa de la columna, la muestra fluirá a través de la resina por gravedad; la muestra de 5 mL totalmente fluirá a través de la columna en 10 minutos.</li>
	<li>Recoge el flujo a través de un nuevo tubo cónico de 15 mL.</li>
	<li>Utilizando una pipeta serológica, aplique el material recogido a la resina para remover cualquier material restante por debajo de 700 kDa.</li>
	<li>Recoge el flujo a través de un nuevo tubo cónico de 15 mL. Lavar la resina dos veces añadiendo 1 mL de PBS. Recoger el flujo a través del tubo de paso 4.5; el volumen final total será aproximadamente de 7 mL. Nota: Tras el paso 4.6, la muestra se diluirá aproximadamente 35 veces del volumen de muestra original; los pasos siguientes se reducen el volumen y concentrar la muestra purificada exosomas.</li>
</ol>5. concentración de exosomas purificada y cuantificación de proteínas totales
<ol><li>Aclarar un dispositivo de ultrafiltración con filtro de 3 kDa MWCO con PBS antes como se describe en el paso 3.1.</li>
	<li>Agregue la muestra de paso 4.6 en el dispositivo de ultrafiltración y centrífuga de un rotor del cubo que hace pivotar a 3.700 x g a 4 ° C. Almacenador intermediario pasará a través del filtro y se puede desechar. Exosomas concentrado serán retenido sobre el filtro. Centrifugue la muestra hasta que el volumen por encima del filtro (retenido) se reduce a 200 μl.</li>
	<li>Transferir el retenido a un nuevo tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Enjuague el filtro de membrana con 200 μL PBS mediante pipeteo sobre la membrana 10 veces y transferir el lavado al tubo de paso 5.3. Esto permitirá que para la recogida de cualquier muestra de exosomas residual.</li>
	<li>Llevar el volumen hasta 500 μl de la muestra agregando PBS. Mezclar mediante pipeteo lentamente arriba y abajo 10 veces. Nota: El protocolo puede hacer una pausa aquí. Las muestras deben almacenarse a 4 ° C durante la noche o a-20 /-80 ° C para almacenamiento a largo plazo.</li>
	<li>Cuantificar el contenido de proteína de la muestra de ensayo BCA, usando el protocolo del fabricante. Diluir la muestra 1:10 y 1:50 en PBS. Ejecute cada muestra por duplicado. Nota: A partir de 10 mg de proteína total del suero o plasma, la producción de proteína total en exosomas purificada de paso 5.6 es, en promedio, 150 μg. diluciones adicionales pueden ser necesarias si se utilizan muestras que no sean de suero o plasma; rendimiento puede variar con el tipo de muestra.</li>
</ol>6. cuantificación y dimensionamiento de los exosomas por nanopartículas seguimiento análisis (NTA)
<ol><li>Añadir 5 μg de exosomas purificada (como cuantificado en 5.6) a 1 mL de PBS y agitar por 15 s en velocidad media-baja.<ol>
<li>Colocar la muestra en una jeringa desechable de 1 mL. Si está disponible, establezca la jeringa en una bomba de jeringa automática para inyectar la muestra de exosomas diluido a razón de 30 μL/min.</li>
		<li>Mida la NTA utilizando las opciones de captura de vídeo: pantalla de ganancia de nivel de 3-4 y cámara de 12-13.</li>
		<li>Definir la secuencia de comandos para análisis realizar tres repeticiones técnicas durante un mínimo de 30 s usando un flujo constante para cada repetición. Para el análisis, establecer el umbral de captura en 5. Nota: Detalles sobre el uso de la jeringa automática y configuración de captura de vídeo están disponibles en la referencia13. Configuración de captura y análisis NTA debe ser coherente a través de diferentes muestras para asegurar la comparabilidad.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. determinación de la reducción de la proteína Soluble de
<ol><li>Añadir 1-10 μg de exosomas purificada a solución tampón de muestras de la SDS y realizar electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE) utilizando un Gel de Tris Bis 4-12% de 1 SDS x MES funcionamiento tampón durante 35 minutos a 200 V. transferencia resueltos proteínas a una membrana de nitrocelulosa 0.2 μm aplicando un voltaje o f 50 V de 1-1.5 h. realizar análisis de western blot para evaluar la presencia de albúmina, apolipoproteínas A y B y el marcador de exosomas CD 63 siguiendo metodologías estándar. Nota: Protocolos de los métodos en 7.1 se pueden encontrar en la referencia14; específicamente, SP007: de geles de poliacrilamida y SP011: Protocolo de Western blot.</li>
	<li>Separar 10 μg de exosomas purificada usando la página como en el paso 7.1 y las bandas de proteínas usando colorante coomassie, recomendaciones estándar, para visualizar la variación de proteína y reducción entre muestras de la mancha. Nota: Más detalles sobre el protocolo específico de CD63 manchas blancas /negras occidentales son descritos por Díaz et al. 15
</li>
</ol>

<ol><li>Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogenesis+and+functions+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The biogenesis and functions of exosomes.</a> Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
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<li>Dobos, K. Production Manuals & SOPs. , Available from:
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<li>Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-isolation+of+extracellular+vesicles+and+high-density+lipoproteins+using+density+gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).</li>
<li>Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biologically-active+exosomes+from+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of biologically-active exosomes from human plasma.</a> J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).</li>
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<li>Baranyai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Exosomes+from+Blood+Plasma%3A+Qualitative+and+Quantitative+Comparison+of+Ultracentrifugation+and+Size+Exclusion+Chromatography+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods.</a> PLoS One. 10 (12), e0145686(2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Un método optimizado para aumentar la pureza y rendimiento de exosomas de sangre aumentará la capacidad de mina con precisión las vesículas extracelulares como fuente de biomarcadores para varias enfermedades. Los métodos estándar actualmente utilizados para aislar exosomas, específicamente, ultracentrifugación y métodos de precipitación, tienen varias desventajas incluyendo agregación de exosomas y granulación de proteínas solubles7,17, <sup class="x...

Exosomas son Nanovesículas (que varían en tamaño desde 30 nm y 150 nm) facilitar la comunicación de célula a célula por casi todas las células en el cuerpo humano procesa1,2. Curiosamente, la composición de los exosomas cambia dependiendo de las células de origen, así como el estado de salud del individuo3,4,5. Además, exosomas pueden ser obtenido de varios fluidos biológicos tales como: saliva, orina y sangre2. Debido a estas características, exosomas se consideran una buena fuente de biomarcadores de la enfermedad. Desafortunadamente, no existe ningún método estándar para el aislamiento de exosomas. Algunos laboratorios consideran varios pasos centrifugación, con un paso de alta velocidad final a 100.000 x g utilizando gradientes de densidad como el método estándar de oro para el aislamiento de exosomas. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que ultracentrifugación induce la agregación de los exosomas con proteínas solubles y otras exosomas, además afectando la integridad de exosomas, que pueden obstaculizar las aplicaciones de bajada6,7 . Otros métodos de aislamiento de exosomas comunes incluyen, pero no se limitan a: precipitación por comercial polietilenglicol (PEG) basado en reactivos, centrífuga ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño (SEC). Los reactivos comerciales usando polímeros de polietilenglicol (PEG) enriquecen exosomas por haciéndolos precipitar y formar una pelotilla. Limitaciones de uso de este polímero son la contaminación con residuales polímeros de PEG y la abundancia de proteínas solubles no exosomal en el producto final. Ultrafiltración utiliza centrifugación para purificar y concentrar las vesículas con membrana de celulosa; exosomas se mantienen por encima del filtro, mientras que las impurezas más pequeñas y otras proteínas atraviesan la membrana7,8. Al igual que otros métodos de ultrafiltración centrífuga tiene una capacidad limitada para purificar exosomas debido a la retención de altos niveles de proteínas no exosomal, incluyendo agregados y complejos de la proteína. Por último, purificación seg utiliza resina porosa para separar moléculas por tamaño. SEC ha demostrado resultados prometedores, superar la mayoría de los problemas experimentados con otros métodos de captura de la mayoría de las proteínas contaminantes y preservar la integridad de la exosomal, puesto que el aislamiento se basa en la gravedad o sistemas de baja presión7, 9. Sin embargo, el aislamiento Co de mayor proteína agregados y lipoproteínas10 durante SEC afecta la pureza de la preparación final de exosomas. Mientras que algunos métodos han sido probados para la purificación de exosomas de sobrenadantes de cultivo de células y plasma7o9,de plasma solamente11, no hay información sobre el desempeño de métodos comparando directamente la sangre plasma y el suero del individuo mismo.
Aquí, nos centramos en la purificación de la sangre exosomas comparando una variedad de flujos de trabajo para determinar si las técnicas de enriquecimiento vesícula son traducibles entre plasma y suero. Nanopartículas de seguimiento análisis y western blot fueron utilizados para cuantificar las diferencias en la composición de proteína, concentración y pureza de exosomas en los productos finales. El método final, detallado en el presente Protocolo, aumenta el número de vesículas y reduce los niveles de proteína no-exosomal. Lo importante, se demostró una reducción drástica de común Co precipitando proteínas como albúmina y Apolipoproteínas. La gran abundancia de estas dos proteínas en sangre y la frecuencia en que co purifican con exosomas causas inconsistencias entre las muestras "purificadas", sesgando el análisis descendentes. Este protocolo incluye el uso de una resina de s disponible en el mercado; la resina se compone de granos porosos en que las proteínas menores de 700 kDa pueden introducir los granos. Una vez dentro, las proteínas son retenidas por un ligando Octilamina. El eluido se compone de exosomas y moléculas más grandes que 700 kDa12. Además, con el fin de reducir los agregados de proteínas y Apolipoproteínas que evaden captura de grano, se incluye un paso de digestión de proteasa en el flujo de trabajo. Actualmente, no es capaz de maximizar el rendimiento de exosomas reduciendo el co purificación proteínas no exosomal solo técnica. Este estudio muestra que un protocolo de purificación que combina un tratamiento previo de digestión de proteasa con varios métodos de recuperación y purificación puede usarse para aumentar el rendimiento de exosomas y pureza del suero sanguíneo y plasma.

<table><tbody>Microcentrífuga de sobremesa <tr><td></td><td>Nanosight Malvern</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Centrífuga de</td> sobremesa Thermo <td>Legend Mico21</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra 6R Baño de</td><td></td></tr><tr><td>agua &nbsp;</td><td>Benchmark</td><td>B2000-4</td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas</td><td>BIOTEK</td><td>Epoch</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Kit de ensayo de proteínas BCA THERMO</td><td></td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas Micro BCA</td><td>THERMO</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>15705-066</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-0.5 con membrana Ultracel-100</td><td>EMD-Millipore</td><td>UFC510096</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-4</td><td>EMD-Millipore UFC800324</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capto Core 700</td><td>GE Healthcare</td><td>17548103</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep&nbsp; Columnas de cromatografía</td><td>BIORAD 7311550</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Geles de proteínas</td><td>THERMO</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulosa, rollo, 0,2 y micro; m</td><td>BIORAD</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K,&nbsp; Tritirachium album</td><td>EMD-Millipore</td><td>539480</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>THERMO</td><td>LC6065</td><td></td></tr><tr><td>SIGMAFAST&nbsp; BCIP/NBT</td><td>Millipore-SIGMA</td><td>B5655</td><td></td></tr><tr><td>4-Cloro-1-naftol</td><td>Millipore-SIGMA</td><td>C6788</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD63 (conejo anti-humano) con cabra anti-conejo anti-anti-conejo HRP ANTICUERPO SECUNDARIO</td> SYSTEM <td>BIOSCIENCES</td><td>EXOAB-CD63A-1</td><td>Anticuerpos primarios y secundarios</td></tr><tr><td>Anticuerpo ALB (F-10)</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td><td>sc-271605</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>primario anticuerpo apoB (C1.4)</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td><td>sc-13538</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>primario anticuerpo apoA-I (B-10)</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td><td>sc-376818</td><td>Anticuerpo primario</td></tr></tbody></table>

digestión de proteínas, ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño para optimizar el aislamiento de exosomas de suero y plasma de sangre humana

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Exosomas, un tipo de nanovesicle liberado de todos los tipos de célula, pueden ser aislado de cualquier líquido corporal. El contenido de exosomas, incluyendo proteínas y ARN, es único a las células que se derivan y pueden ser utilizados como indicadores de enfermedad. Varios protocolos de enriquecimiento común, como la ultracentrifugación, producen exosomas cargado de contaminantes de la proteína soluble. Específicamente, hemos encontrado que las proteínas más abundantes en la sangre a menudo Co purifican con exosomas y pueden confundir los estudios proteómicos aguas abajo, frustrando la identificación de candidatos de biomarcadores de baja abundancia. De preocupación adicional es irreproducible de exosomas cuantificación de proteína debido a representación incompatible de niveles de proteína no-exosomal. El protocolo detallado aquí fue desarrollado para eliminar las proteínas no exosomal que co purifican junto con exosomas, adición de rigor en el proceso de purificación de exosomas. Cinco métodos se compararon mediante pares plasma de sangre y suero de cinco donantes. Análisis usando nanopartículas de seguimiento análisis y ensayo de proteína ácido bicinchoninic micro reveló que un protocolo combinado utilizando cromatografía por exclusión de tamaño y ultrafiltración dio como resultado el enriquecimiento óptima de la vesícula y la eliminación de la proteína soluble. Western Blot se utilizó para verificar que las proteínas de la sangre abundante esperados, incluyendo albúmina y Apolipoproteínas, estaban agotadas.

Los datos presentados a continuación fueron obtenidos usando las muestras pareadas de suero y plasma de donantes de sangre sanos de cinco. Para determinar los efectos de cada paso de proceso, se realizaron cinco variaciones del protocolo presentado, y se compararon los exosomas no exosomas y recuperación extracción de proteína. Los métodos probados incluyen: 1) seg 700 kDa + ultrafiltración 3 kDa; 2) ultrafiltración 100 kDa; 3) proteinasa K + ultrafiltración 100 kDa; 4) SEC 700 kDa + ultr...

Aquí, presentamos un protocolo para purificar exosomas de plasma y suero con menor Co purificación de proteínas de la sangre no exosomal. El protocolo optimizado incluye tratamiento con proteasas y ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño. Mayor purificación de exosomas beneficios aguas abajo los análisis, incluyendo la cuantificación más exacta de las vesículas y caracterización proteómica.

Digestión de proteínas, ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño para optimizar el aislamiento de exosomas de suero y Plasma de sangre humana

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

El objetivo general de este procedimiento es purificar las vesículas de la sangre al tiempo que se reducen las proteínas y complejos copurificantes que pueden interferir con el análisis posterior, incluido el seguimiento de nanopartículas y la proteómica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave, como cuáles son los cambios proteómicos en las vesículas séricas o plasmáticas durante el estado de la enfermedad en comparación con un estado saludable. La principal ventaja de esta técnica es el aumento de la precisión en la enumeración de vesículas.Al eliminar abundantes contaminantes no vesículas, aumentamos la identificación de proteínas de baja abundancia y los posibles biomarcadores de enfermedad. Las implicaciones de este método se extienden al descubrimiento de nuevos biomarcadores diagnósticos. Permite determinar con mayor precisión la composición proteómica de vesículas extracelulares en matrices complejas, como la sangre.En general, las personas nuevas en la purificación de vesículas tendrán dificultades porque hay muchas técnicas publicadas. La reproducibilidad del análisis proteómico posterior se ve afectada por la copurificación de abundantes proteínas séricas. Equilibre una muestra de suero o plasma colocando el tubo en condiciones que no vibren en un refrigerador de cuatro grados centígrados durante la noche.Al día siguiente, alícuota 250 microlitros de la muestra en un tubo de microcentrífuga utilizando una pipeta de 1.000 microlitros. Centrifugar la muestra a 18.000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Con una pipeta de 200 microlitros, extraiga 200 microlitros del sobrenadante aclarado y añádalo a un nuevo tubo de microcentrífuga.Evite cualquier material granulado mientras transfiere el sobrenadante. Cuantificar el contenido de proteínas de la muestra mediante ensayo de BCA utilizando el protocolo del fabricante. Para realizar el ensayo, diluya la muestra de uno a 50 en una solución salina tamponada con fosfato X.Pruebe cada muestra por duplicado. Prepare una solución de proteinasa K a una concentración de 50 microgramos por mililitro en PBS agregando primero la cantidad correspondiente de proteinasa K a un tubo cónico. A continuación, añada el tampón y el vórtice durante 30 segundos tres veces a temperatura ambiente.A continuación, añada 50 microlitros de solución de proteinasa K a la alícuota de muestra de 10 miligramos y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 200 microlitros. Incubar la muestra a 37 grados centígrados en un baño de agua durante 30 minutos, colocando el tubo en una rejilla de flotador. Para evitar posibles fugas, evite la inmersión completa del tubo en el baño de agua.Después de la incubación, transfiera la muestra y la gradilla a un baño de agua a 60 grados Celsius durante 10 minutos para inactivar la proteinasa K. A continuación, enjuague un dispositivo de ultrafiltración que contenga un filtro de corte de peso molecular de 100 kilodalton con PBS antes de usar. Utilice una pipeta de 1.000 microlitros para añadir 500 microlitros de PBS al filtro. Después de hacer girar el dispositivo a 3.700 veces G durante cinco minutos, deseche cualquier retenido restante, así como el eluido.Aumente el volumen de la muestra a 500 microlitros agregando PBS. A continuación, pipetee la muestra en el dispositivo de ultrafiltración previamente enjuagado. Centrifugar el dispositivo de ultrafiltración en una centrífuga de sobremesa de ángulo fijo a 3.700 veces G y cuatro grados Celsius hasta que la muestra se haya reducido a un volumen de 50 microlitros.A continuación, agregue 500 microlitros de PBS directamente sobre la membrana del filtro. Y pipetear hacia arriba y hacia abajo cinco veces antes de volver a centrifugar como antes. Transfiera el retenido final de 50 microlitros a un nuevo tubo de microcentrífuga.Enjuague la membrana del filtro con 200 microlitros de PBS, pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Y transfiera el lavado al tubo. A continuación, coloque el portafiltros en posición inversa en un tubo nuevo.Ejecute una recuperación de giro inverso durante cinco minutos a 2.000 veces G para recuperar la muestra restante de la membrana. Coloque las columnas en un bastidor de tamaño adecuado. Agregue 850 microlitros de purín SEC con perlas con un corte de peso molecular de 700 kilodaltons utilizando una pipeta de 1.000 microlitros.Destapa la parte inferior de la columna y deja que el líquido se drene en un contenedor de residuos durante cinco minutos. Una vez escurrido, añade 10 microlitros de PBS para lavar la resina. Espere 20 minutos para que el lavado se drene de la columna.Colocar la muestra concentrada tratada con proteinasa K en un tubo cónico de 15 mililitros. Y aumentar el volumen de la muestra a cinco mililitros añadiendo PBS con una pipeta serológica. Mezcle el tubo suavemente meciéndolo durante un minuto.A continuación, aplique lentamente la muestra a la columna preparada con una pipeta serológica. Recoja el flujo en un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Pipetear de nuevo el material recogido sobre la resina para eliminar cualquier resto de material por debajo de los 700 kilodaltons, recogiendo el flujo en un nuevo tubo cónico de 15 mililitros.Lava la resina dos veces añadiendo un mililitro de PBS cada vez. Recoja el flujo en un tubo. El volumen final total será de aproximadamente siete mililitros.Enjuague un dispositivo de ultrafiltración con un filtro de peso molecular de tres kilodalton como antes. Centrífuga en un rotor de cangilón oscilante a 3.700 veces G y cuatro grados Celsius. El búfer pasará a través del filtro y se puede descartar.Los exosomas concentrados se retendrán por encima del filtro. Centrifugar la muestra hasta que el volumen por encima del filtro se reduzca a 200 microlitros. Cuantificar el contenido de proteínas de la muestra mediante ensayo de BCA utilizando el protocolo del fabricante.Agregue cinco microgramos de exosomas purificados a un mililitro de PBS. Y vórtice durante 15 segundos a velocidad media baja. Coloque la muestra en una jeringa desechable de un mililitro.Si está disponible, coloque la jeringa en un conjunto de bomba de jeringa automática para inyectar la muestra de exosoma diluida a una velocidad de 30 microlitros por minuto. Defina el script para que el análisis ejecute tres réplicas técnicas durante un mínimo de 30 segundos utilizando un flujo constante para cada réplica. Para el análisis, establezca el umbral de captura en cinco.Finalmente, determine la reducción de proteína soluble como se describe en el protocolo de texto. Se muestran los resultados representativos del análisis de seguimiento de nanopartículas de vesículas de suero purificadas. El tamaño de la vesícula es de aproximadamente 100 nanómetros, como se esperaba.Aquí se muestra un gel de proteína teñido con Coomassie que compara las fracciones séricas crudas, pre y post SEC que muestra la reducción de la albúmina y otros contaminantes no vesículas. Un Western blot muestra la retención de CD63, una proteína de exosoma distintiva después del tratamiento y la purificación de la proteinasa K. El paso de la proteinasa K está diseñado para digerir proteínas solubles.CD63 es una proteína transmembrana y menos susceptible a la proteinasa K a la concentración y duración de incubación determinadas. Aquí, un Western blot muestra el agotamiento de la albúmina, la proteína más abundante en la sangre y una proteína copurificante común después de la purificación. Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en seis horas.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar la ultrafiltración por centrífuga, la digestión de proteasas y la cromatografía de exclusión de tamaño para obtener vesículas de fluidos biológicos. Es importante realizar la cuantificación de proteínas mediante BCA o técnica equivalente antes de una cromatografía y seguimiento de nanopartículas. Los resultados variarán si las concentraciones de proteínas superan las indicadas en este protocolo.No olvide que trabajar con fluidos biológicos puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de equipo de protección personal, incluidos guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad, al realizar este procedimiento. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la cromatografía líquida y la espectrometría de masas para determinar las proteínas exactas contenidas en las vesículas purificadas. Aunque este método puede proporcionar información sobre la composición de las vesículas sanguíneas, también se puede aplicar a otros tipos de muestras, como la orina, el líquido cefalorraquídeo o los sobrenadantes de cultivos celulares.

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Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

En este artículo se presenta un método para el aislamiento de exosomas de sangre total y su posterior análisis mediante el seguimiento de nanopartículas utilizando un instrumento semiautomático. La tecnología presentada proporciona un método extremadamente sensible para visualizar y analizar partículas en suspensión líquida.

Un método innovador para exosome cuantificación y medición de tamaño

El líquido biliar es una valiosa fuente de vesículas/exosomas extracelulares que contienen biomarcadores potencialmente importantes. Este protocolo representa un método sólido para aislar exosomas de la bilis humana para análisis posteriores, incluido el perfil de miARN.

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MicroARNs juegan un importante papel regulador y están surgiendo como nuevas dianas terapéuticas para diversas enfermedades humanas. Se ha demostrado que miRNAs se realizan en las lipoproteínas de alta densidad. Hemos desarrollado un método simplificado para aislar rápidamente HDL purificado adecuado para el análisis de los genes miARN partir de plasma humano.

Método rápido y simplificado para el aislamiento alto rendimiento de procesamiento de miRNA desde muy puras lipoproteína de alta densidad

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Las bacterias secretan vesículas extracelulares (EV) de tamaño nanométrico que transportan moléculas biológicas bioactivas. La investigación EV se centra en comprender su biogénesis, su papel en las interacciones y enfermedades microbio-microbio y huésped-microbio, así como sus posibles aplicaciones terapéuticas. Se presenta un flujo de trabajo para el aislamiento escalable de vehículos eléctricos de varias bacterias para facilitar la estandarización de la investigación de vehículos eléctricos.

Aislamiento escalable y purificación de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias

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El presente protocolo proporciona descripciones detalladas para el aislamiento eficiente de vesículas extracelulares urinarias utilizando perlas magnéticas funcionalizadas. Además, abarca análisis posteriores, como Western blot, proteómica y fosfoproteómica.

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Este artículo describe una metodología para el aislamiento, caracterización y cuantificación de vesículas extracelulares (EV) derivadas del plasma humano y presenta un flujo de trabajo para el análisis sin etiquetas del proteoma EV utilizando cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).

Aislamiento, caracterización y análisis proteómico de vesículas extracelulares derivadas del plasma para el descubrimiento de biomarcadores cardiovasculares

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Aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y médula ósea mediante cromatografía de exclusión de tamaño

Aquí se describe protocolos para romper las células de mamíferos por molienda en estado sólido a una temperatura criogénica, producir un extracto celular a partir del polvo de células resultante, y aislar los complejos de proteínas de interés por captura de afinidad sobre perlas paramagnéticas a escala micrométrica de anticuerpos acoplados.

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Aprende a purificar exosomas de suero y plasma humano mediante digestión proteica, ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño. Este método optimizado mejora la identificación de biomarcadores diagnósticos.

Digestión de proteínas, ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño para optimizar el aislamiento de exosomas de suero y Plasma de sangre humana (Video) | JoVE Journal

Digestión de proteínas, ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño para optimizar el aislamiento de exosomas de suero y Plasma de sangre humana

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