Uso de anticuerpos Anti-phospho-girdin visualizar células de penacho Intestinal en Cryosections de yeyuno ratón flotante

El objetivo general de este procedimiento de tinción es visualizar las células del penacho en criosecciones de yeyuno de ratón. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la gastroenterología, como cómo se produce la proliferación de células de penacho en el intestino de los mamíferos durante la infección por parásitos. La principal ventaja de esta técnica es que los investigadores con experiencia histológica limitada pueden obtener imágenes de células de penacho de alta calidad.

Comience exponiendo los órganos pélvicos de un cadáver de ratón recién fijado en formol. Corta el extremo del recto del ano y separa los intestinos del cuerpo cortando el mesenterio. Para aislar el yeyuno, corte los intestinos a cuatro centímetros del lado anal del antro gástrico y deseche la mitad anal del intestino delgado restante.

Corta el yeyuno por la mitad para facilitar el procedimiento de lavado. Cargue 20 mililitros de solución de formalina neutra tamponada al 10% en una jeringa de 20 mililitros y coloque una aguja recta de calibre 18 sin el bisel. A continuación, inyecte una solución de formalina neutra tamponada al 10% desde un extremo del yeyuno recortado para eliminar el contenido intestinal y fijar la superficie del lumen intestinal.

Lave la luz intestinal inyectando PBS. Luego, enjuague con una solución de gelatina líquida para reemplazar el PBS. Cierre un extremo del yeyuno recortado mediante una ligadura de sutura, utilizando una sutura de corte de nailon 6-0.

Llene el yeyuno con gelatina líquida y cierre el extremo opuesto mediante ligadura de sutura. A continuación, haz cuatro nudos de sutura a lo largo del yeyuno. Remojar los tejidos en 50 mililitros de sacarosa al 15% en una solución de formalina neutra tamponada al 10% durante la noche, a 4 grados centígrados.

Al día siguiente, corte el yeyuno en los nudos de sutura para obtener tres piezas de jejunem en forma de salchicha con ambos extremos ligados. Alinee las piezas en un molde criogénico, luego cúbralas con compuesto de inclusión. Congele a presión el criomold en isopentano enfriado con nitrógeno líquido.

Para preparar secciones de yeyuno, comience por ajustar la temperatura de la cámara de criostato y la temperatura del objeto a menos 22 grados Celsius. Coloque el bloque de tejido congelado en un molde criogénico en la cámara de criostato durante al menos 15 minutos. Después de 15 minutos, corte el bloque por la mitad con una cuchilla de afeitar para exponer la sección transversal del yeyuno.

Monte la mitad del bloque en un adaptador de criostato. Divida el yeyuno relleno de gelatina en secciones de 30 micras de grosor. Use pinzas congeladas para transferir suavemente las secciones a una placa de cultivo de 35 milímetros que contenga 3 mililitros de PBS.

Después de lavar las secciones tres veces durante cinco minutos cada una con 3 mililitros de PBS-T, agregue 3 mililitros de solución de recuperación de antígenos recién preparada al plato que contiene las secciones flotantes. Luego, cierre la tapa, selle el espacio entre el plato y la tapa con una tira de cinta vinílica e incube a 50 grados centígrados en una incubadora de hibridación durante tres horas, sin agitar. Después de la inmunotinción, transfiera la placa de secciones teñidas en PBS a un microscopio estereoscópico.

Coloque 200 microlitros de PBS en una gota en el centro de un portaobjetos de vidrio blanco con código MAS. A continuación, utilice una punta de pipeta P200 para transferir una sección de yeyuno de la placa a la gota. Después de ajustar la alineación de la sección, aspire todos los PBS restantes que rodean la sección.

Agregue 20 microlitros de medios de montaje acuosos y coloque un cubreobjetos encima del medio. Selle inmediatamente los bordes deslizantes de la cubierta con medios de montaje a base de xileno y deje secar durante dos o tres horas antes de comenzar la microscopía confocal. El relleno de gelatina del yeyuno conserva la forma de disco redondo y mantiene la posición vertical de las vellosidades.

En ausencia de relleno de gelatina, las secciones yeyunales tienden a doblarse, lo que permite que las vellosidades se balanceen hacia atrás. pY1798 delinea de forma reproducible células enteras del penacho, incluida la membrana, el citoplasma del soma en forma de carrete y la punta luminal fuertemente teñida, donde la condensación de la señal robusta corresponde al penacho que sobresale de una célula del penacho. La faloidina tiene una alta afinidad por la actina filamentosa, que está presente en las microvellosidades que forman el borde del cepillo intestinal.

La faloidina marca de forma reproducible y prominente el borde engrosado del cepillo que corresponde a una masa de raicillas que se extienden desde el penacho. La colocalización consistente de las señales de pY1798 con el borde en cepillo prominentemente engrosado y positivo para faloidina demuestra que este protocolo identifica con éxito las células del penacho independientemente de si se encuentran en una vellosidad o en una cripta. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres días si se realiza correctamente.

La combinación de gelatina de bajo punto de emisión, criosecciones flotantes y recuperación de antígenos a baja temperatura se puede aplicar para inmunoteñir otros tejidos del proyecto.