Generación de células epiteliales nasales humanas esferoides para estudio de regulador de conductancia de la transmembrana individualizada la Fibrosis quística

El objetivo general de este procedimiento es generar esferoides de células nasales humanas que, en última instancia, se pueden utilizar como ensayo para estudios funcionales de CFTR. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la fibrosis quística, como la evaluación de la respuesta de un sujeto individual a los fármacos que alteran el CFTR en un sistema modelo ex vivo. La principal ventaja de esta técnica es que se genera un gran número de esferoides en un período de tiempo relativamente rápido a partir de una pequeña muestra de células nasales, lo que permite realizar pruebas exhaustivas.

Lauren Strecker y Jessica Moncivaiz, técnicas de mi laboratorio, harán una demostración del procedimiento. Después de procesar y expandir las células epiteliales nasales humanas o HNE en fibroblastos alimentadores de acuerdo con el protocolo de texto, lleve el medio de expansión previamente preparado, el medio de diferenciación, la solución de tripsina EDTA al 0,1% y el PBS estéril a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, utilice etanol al 70% para limpiar los contenedores y transfiéralos a un armario de bioseguridad limpio.

En la cabina de bioseguridad, utilice una pipeta Pasteur conectada a una línea de vacío para aspirar y desechar el medio del cultivo de HNE. Luego, con una pipeta serológica limpia, use cinco mililitros de PBS para lavar el plato agregando, agitando y aspirando el tampón. Agregue cinco mililitros de solución de EDTA de tripsina al 0,1% al cultivo y devuélvalo a la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cinco minutos.

Luego, bajo un microscopio invertido a cuatro a 10X, verifique que las células se desprendan de la placa, se vuelvan redondas y floten. Golpee suavemente el costado de la placa de cultivo para desalojar las células y, si es necesario, vuelva a incubar la placa durante cinco minutos adicionales hasta que la mayoría de las células se desprendan. A continuación, con una pipeta serológica de 10 mililitros, añada cinco mililitros de medio de expansión a la placa y recoja todo el líquido en un tubo cónico estéril de 50 mililitros etiquetado.

Si las células permanecen adheridas a la placa de cultivo después de tres rondas de tripsinización, use un raspador de células estéril para liberar suavemente las células restantes y con cinco mililitros de medio de expansión, lave el raspador y la placa y recoja el contenido en el mismo tubo cónico etiquetado. Centrifugar el tubo a 360 veces g en cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Aspire el sobrenadante y use un mililitro de medio de expansión para resuspender el pellet de la célula.

Luego use un hemocitómetro para contar las células. Descongele la matriz de la membrana basal en hielo según las instrucciones del fabricante. Separe un número apropiado de células de paso tripsinizadas diferencialmente para obtener una concentración final de 500.000 células por mililitro de la matriz.

Para una placa de cuatro pocillos, use 200.000 células y recójalas en un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, centrifugar la mezcla celular a no más de 360 veces g durante cinco minutos. Luego, con una pipeta de un mililitro, aspire y deseche completa y cuidadosamente el medio, teniendo cuidado de no alterar la pastilla celular.

Mantenga el tubo de células en hielo cuando no lo manipule activamente. Utilice una punta de pipeta de un mililitro para añadir 100 microlitros de la matriz de la membrana basal por pocillo planificado a las células. Mientras no vacíe completamente la punta de la pipeta para evitar la introducción de burbujas de aire, pipetee hacia arriba y hacia abajo para resuspender las células con cuidado y a fondo.

Muévase rápidamente para evitar la solidificación de la matriz. Para sembrar alícuotas de matriz de 100 mililitros en cada pocillo de una placa de cultivo de FIV de cuatro pocillos, use un par de tijeras limpias para recortar los tres o cuatro milímetros distales de una punta de pipeta de 200 microlitros. Pipetee con cuidado y lentamente una gota de 100 microlitros de mezcla de matriz celular en el centro de cada pocillo, asegurándose de que la gota permanezca esférica y no toque los lados del pocillo.

Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos hasta que esté sólida. A continuación, pipetee cuidadosamente 500 microlitros de medio de diferenciación en cada pocillo, teniendo cuidado de no alterar la caída de la matriz. Asegúrese de que el medio solo cubra la gota y agregue más si es necesario.

Para cultivar esferoides HNE, con una punta de pipeta de un mililitro, aspire suavemente todo el medio del pocillo evitando la matriz que destruirá los esferoides. A continuación, con una punta de pipeta nueva de un mililitro y evitando tocar o alterar la matriz, añadir suavemente 500 microlitros de medio de diferenciación al pocillo que rodea la matriz. Continúe incubando los esferoides, reemplazando el medio de diferenciación tres veces por semana como se acaba de demostrar.

Bajo un microscopio invertido con un aumento de 20X, evalúe diariamente la morfología del esferoide. Los esferoides deben formarse dentro de los tres a cinco días posteriores a la siembra y alcanzar la madurez dentro de aproximadamente 10 días. Las HNE deben adherirse a la placa de cultivo y formar pequeñas islas dentro de las 72 horas posteriores a la siembra.

Aquí se muestran ejemplos de buena y mala formación de islas en una semana. Las islas deben expandirse para cubrir el plato en el transcurso de 15 a 30 días. Dentro de los primeros tres o cuatro días de cultivo, deben comenzar a formarse pequeñas estructuras quísticas en la matriz y madurar durante aproximadamente 10 días.

Si se siembran a la densidad descrita, los cultivos exitosos contendrán de 50 a 100 esferoides por gota de matriz. Los lúmenes pueden ser relativamente claros, como en el caso de los CFTR de tipo salvaje, o estar llenos de restos celulares y moco, como en los esferoides de FQ. El enmascaramiento para delinear el área luminal de los esferoides se demuestra en estos dos paneles.

A continuación se muestran ejemplos de cultivos de esferoides mal formados y no exitosos. Como se ilustra en estos gráficos de ensayos funcionales, los esferoides de sujetos con CFTR de tipo salvaje deben hincharse más de una hora cuando se estimulan y deben hincharse menos o encogerse si se estimulan en presencia del inhibidor de CFTR inh-172. Los esferoides de un sujeto homocigoto para F508del-CFTR deberían encogerse o hincharse muy ligeramente, con un aumento de la hinchazón o una menor contracción cuando se corrigen farmacológicamente con los moduladores de CFTR VX809 y VX770.

Una vez dominado, la siembra de esferoides de células nasales se puede realizar en 15 a 20 minutos si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener procedimientos operativos limpios dentro de la cabina de bioseguridad para minimizar el riesgo de contaminación de la muestra y evitar cualquier riesgo para su propia salud. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la fijación, la tinción y la microscopía para responder preguntas adicionales sobre la morfología y la composición celular.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo generar esferoides primarios de células nasales humanas que se pueden utilizar como un ensayo personalizado de la función CFTR. No olvide que trabajar con tejidos humanos primarios puede ser peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso adecuado del equipo de protección personal al realizar este procedimiento.