Name: Generación de monómero Exon1 huntingtina nativo, sin etiquetar y fibrillas utilizando una estrategia de fusión de SUMO (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Aprende a producir monómeros y fibrillas nativos de huntingtina sin etiquetas mediante una estrategia de fusión SUMO. Este método robusto facilita estudios estructurales y funcionales de proteínas propensas a la agregación.

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Este trabajo fue financiado principalmente por donaciones de la Fundación CHDI y la Swiss National Science Foundation. Agradecemos Dr. Sophie Vieweg discusiones útiles durante el desarrollo de este nuevo sistema de expresión y otros miembros del grupo Lashuel para compartir su experiencia con este sistema de expresión y para su entrada y valiosa retroalimentación. También agradecemos a Prof. Oliver Hantschel para proporcionar el plásmido ULP1. Los autores agradecen Dr. John B. Warner y Dr. Senthil K. Thangaraj revisión crítica del manuscrito

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Los autores declaran que tienen no hay conflictos de intereses con el contenido de este artículo.

En este protocolo, hemos descrito un procedimiento eficaz para obtener cantidades de miligramos de nativos, untagged Httex1 que contienen residuos de glutamina 23 o 43. Esto se logró mediante la expresión Httex1 como una fusión de la terminal C a su6-etiqueta de SUMO, que se utiliza para aislar la proteína de la fusión de la célula de lisado de IMAC y troceado antes de purificación de HPLC de Httex1. Mientras que la estrategia SUMO se ha utilizado en la producción de varias otras proteínas, nuestro método muestra que las propiedades únicas de que sumo también podría ser utilizado para generar intrínsecamente desorden, propenso a la agregación, proteína amyloidogenic que previamente han demostrado ser extremadamente difícil de manejar y producir43,44. Presentamos un protocolo que es sencillo, fácil de usar y comparable a un protocolo para la generación de una proteína "bien-comportada". La fusión de SUMO solubiliza y estabiliza la Httex1 durante el paso de la purificación de IMAC y la expresión. Ruptura prematura de la etiqueta, como se observa con la agregación y intein estrategia10 eran no más un problema.
Las proteínas intrínsecamente desordenadas son especialmente vulnerables a la degradación. Mientras que la degradación del N-terminal en la región de N17 no es un problema con este protocolo, truncamientos en el PRD de Httex1 pueden ocurrir. Como las proteínas truncadas son muy similares a Httex1 de hidrofobicidad, carga y tamaño, quitar por medios cromatográficos es un reto, así es mejor prevenir su formación en primer lugar. Pegarse de cerca en el protocolo, siempre trabajando en el hielo y usando una cantidad suficiente de inhibidor de la proteasa deberían ayudar a mantener muy bajo el nivel de truncamiento observado. Aplicar una etiqueta de fusión en el C-terminal de Httex1 podría quitar truncamientos en el PRD fácilmente como la proteína truncada perdería así la etiqueta de afinidad. Sin embargo, si la secuencia nativa necesita mantener que esta opción no puede aplicarse como Httex1 termina con prolina y al mejor de nuestro conocimiento no hay no hay etiquetas de fusión C-terminal que son conocidos por inducir escote sin dejar huellas y eficiente después de prolina.
La parte más crítica del protocolo es el manejo de la Httex1 liberada después de la ruptura de la etiqueta SUMO por ULP1. La proteína debe ser purificada inmediatamente por RP-HPLC. Afortunadamente, se trata de una reacción rápida y eficaz que generalmente se completa en 10-20 min a 4 ° C. En contraste, la estrategia intein requiere varias horas de ruptura completa de las inteinas, así requiriendo un compromiso entre la hendidura incompleta y agregación de principio con el fin de maximizar el rendimiento. Un workup rápido es necesario para la mutante Httex1, comienza a agregar en la comparativamente alta concentración presente en la reacción de hendidura, mientras que la variante 23Q es estable por más tiempo. Durante la purificación de RP-HPLC, otra ventaja de SUMO se hace evidente: mientras que la Ssp DnaB intein es hidrófobo y se adhiere fuertemente a la columna, SUMO es más hidrofílico y elutes totalmente de la columna de fase inversa de C4. Aunque ULP1 comercial es bastante costosa, la proteína se puede producir fácilmente en alto rendimiento siguiendo protocolos previamente publicados29.
La importancia de la aplicación de un protocolo de desagregación antes de utilizar Httex1 no puede ser tensionado bastantes. Proteínas poliQ liofilizado como Httex1 son estables y pueden ser almacenados largos periodos, pero no son totalmente solubles en agua y en tampones. La presencia oligómeros preformados o fibrillas podría tener un impacto significativo sobre la cinética de agregación y propiedades biofísicas de la proteína45. El protocolo de desagregación se describe aquí permite la desagregación de la proteína, eliminación de los agregados preformados y generación de una solución de Httex1 monoméricas a partir de una muestra liofilizada. Se observó morfología similar de cinética y fibrilla de agregación de Httex1 obtenidos con el SUMO y la estrategia del intein.
En comparación con los métodos anteriores para la producción de Httex1, la estrategia SUMO aquí descrita ofrece varias ventajas y amplía la gama de posibles estudios para investigar la estructura y propiedades funcionales de esta proteína en salud y enfermedad. La proteína de la fusión de SUMO Httex1 es fácil de manejar, puede ser congelado y almacenado o mantenido en solución por 24 h a temperatura ambiente, mientras que el mHttex1 gratis agregado rápidamente. La estabilidad y la alta solubilidad de las proteínas de fusión de SUMO-Httex1 proporcionan una mayor flexibilidad para manipular la proteína o introducir modificaciones enzimáticas y químicas en mHttex1 que de lo contrario no sería posible después de la hendidura. Esto incluye la introducción de modificaciones post-traduccionales, fluoróforos, spin etiquetas, etiquetas de biotina, etc. los avances presentados aquí deben 1) facilitar futuros estudios para elucidar relaciones estructura-función de Httex1; 2) generan nuevas herramientas para investigar Htt agregación y difusión de la patología; 3) permiten el desarrollo de nuevos ensayos para identificar moléculas que estabilicen a mutante Httex1 y evitar su agregación; y 4) alentar a los científicos de otros campos para llevar a trabajar en esta proteína y Únete a nuestra búsqueda para encontrar curas para la enfermedad de Huntington.

HTT es una proteína del 348 kDa y se ha implicado en varias funciones fisiológicas1. Cuando Htt contiene una región de poliQ ampliado de más de 36 residuos en su N-terminal, causa HD2,3. Patología de la EH se caracteriza por las inclusiones celulares en el cuerpo estriado y la corteza, que conduce a la muerte neuronal y atrofia de los tejidos afectados4,5. Varios fragmentos N-terminal Htt que contienen las vías repetición poliQ han sido detectados en cerebros post mortem de pacientes con EH y se piensan para ser generadas por el proceso proteolítico de la proteína huntingtina del6. Estudios recientes sugieren que Httex1 también podría ser formado debido a empalmar de mRNA aberrante. Httex1 contiene la mutación patológica poliQ y su sobreexpresión en los animales puede recapitular muchas de las características claves de HD7, resaltando así un posible papel central de este fragmento en HD patología y enfermedad progresión6, 8,9.
Debido a la agregación alta propensión del mutante Httex1 (mHttex1) en vías de expansión poliQ, la mayoría de los sistemas de expresión existentes se basa en la fusión transitoria de Httex1 a las proteínas (como la glutatión-S-transferasa (GST), tiorredoxina (TRX) o proteína de unión a maltosa (MBP) o péptidos (poly-histidina) que diferencialmente mejoran su solubilidad, estabilidad, purificación o expresiones10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. El socio de fusión es Httex1 con una corta secuencia que contiene un sitio de la hendidura para proteasas como tripsina, tabaco etch virus (TEV) proteasa o PreScission para el escote y la liberación de Httex1 antes de la iniciación de la agregación o purificación. Limitaciones de estos métodos incluyen la posibilidad de dejar residuos adicionales debido a la hendidura no sin dejar huellas y la creación de fragmentos truncados debido a la miscleavage dentro de la secuencia de Httex1, además de heterogeneidad debido a la hendidura incompleta ( Ver Vieweg et al. , para una discusión más detallada sobre las ventajas y limitaciones de este enfoque)10. Para hacer frente a estas limitaciones, hemos desarrollado recientemente una estrategia de expresión que permite la generación de Httex1 libre de etiqueta nativo por primera vez utilizando una fusión transitoria del N-terminal de Synechocystis SP. (Ssp) DnaB intein a Httex110. Mientras que el escote intein es traceless y específica y produce la cantidad de mg de proteínas, aún sufre dos inconvenientes que podrían reducir el rendimiento: es decir, prematura ruptura de la inteína que puede ocurrir durante la expresión y el hecho de que la hendidura ocurre en varias horas, que podrían conducir a la pérdida de proteínas debido a la agregación, especialmente para Httex1 con repeticiones de expansión poliQ.
Para enfrentar estas limitaciones y para afinar nuestra estrategia para la producción de nativo, Httex1 libre de etiqueta, hemos desarrollado un nuevo sistema de expresión basado en la fusión transitoria de SUMO, más exactamente el homólogo de levadura Smt3 a Httex1. La aplicación del sistema para la producción de proteínas recombinantes SUMO fue publicado por primera vez en 200429, donde se demostraron una mayor tasa de expresión y solubilidad de la proteína de la fusión de SUMO. La etiqueta SUMO puede ser dividida por la ubiquitina como proteasa específica de proteína 1 (ULP1), que no requiere un sitio de reconocimiento, pero reconoce la estructura terciaria de SUMO y prácticamente elimina la posibilidad de miscleavage30. Por otra parte, el clivaje mediado por ULP1 es rápido y sin dejar huellas y no deja residuos adicionales. La ruptura prematura de la etiqueta de fusión, como se observa con el10del intein autocatalíticas, es evitar totalmente por el requisito de una proteasa externo. Mientras que la estrategia SUMO es hoy en día ampliamente utilizada para la producción de proteína recombinante31,32,33, demostramos en este trabajo que es especialmente útil para la generación de un intrínsecamente desordenadas, proteína de amyloidogenic proclive a la agregación, como Httex1. Creemos que la simplicidad, eficiencia y robustez de nuestro método basado en la fusión de SUMO hacen más accesible a investigadores de diferentes disciplinas Httex1 nativa, etiqueta-libre y eliminar la necesidad de utilizar secuencias de no nativos de Httex1 en vitro . Este es un importante avance que facilitará futuros estudios para aclarar la relación estructura-función de Httex1.
El protocolo describe la purificación de Httex1 de 12 L de cultivo bacteriano, pero el protocolo podría adaptarse fácilmente para producciones de menor o mayor escala. El protocolo describe la producción de tipo salvaje Httex1 (wtHttex1) con una longitud de la repetición poliQ debajo (23Q) y mutante Httex1 (mHttex1) con un poliQ repetir longitud arriba (43Q) el umbral patógeno (36Q).

<table><tbody><tr><td>Formiato de uranilo (UO2(CHO2)2)</td><td>EMS</td><td>22450</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/carbon 200 mesh, rejillas de Cu 50</td><td>EMS</td><td>FCF200-Cu-50</td><td></td></tr><tr><td>Célula de alta precisión de cuarzo SUPRASIL de 1 mm de Hellma Analytics</td><td>HellmaAnalytics</td><td>110-1-40</td><td></td></tr><tr><td>Sustancia tampón Dulbecco's (PBS sin Ca y Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA</td><td>Witech</td><td>SVA4730203</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>AxonLab</td><td>A0839.0100</td><td></td></tr><tr><td>Caldo Luria (Caldo LB de Miller)</td><td>&nbsp; Chemie Brunschwig</td><td>1551.05</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)</td><td>AxonLab</td><td>A1008.0025</td><td></td></tr><tr><td>E. coli B ER2566</td><td>NEB</td><td>NEB# E4130</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma</td><td>56750-500G</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete&nbsp; Cóctel de inhibidores de proteasas</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Huntingtina, a.a. 1-82</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>MAB5492</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD Cabra anti-ratón IgG (H + L)</td><td>Licor</td><td>925-68070</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>AxonLab</td><td>A0999.0005</td><td></td></tr><tr><td>HisPrep 16/10 columna&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28936551</td><td></td></tr><tr><td>columna de HPLC C4</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4168. P0</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; 10 y micro; m C4 300 &Aring;, Columna LC 250 x 21,2 mm, Phenomenex, 19x10 mm Columna de protección, no encamisada de temperatura</td></tr><tr><td>Acetonitrilo HPLC</td><td>MachereyNagel</td><td>C2502</td><td></td></tr><tr><td>Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre estéril</td><td>Sarstedt AG</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro semi-micro cubeta</td><td>Reactolab S.A.</td><td>2534</td><td></td></tr><tr><td>Superloop, accesorios de 1/16" (&Auml; KTAdesign), 50 ml</td><td>GE Healthcare</td><td>18111382</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>GREINER Tubos para FPLC 16 x 100 mm, tap. 12,0 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>7.160 102</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Microcon de 100 kD&nbsp; filtros de flujo rápido</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>MRCF0R100</td><td></td></tr><tr><td>Vibra-cell VCX130 procesador de líquido ultrasónico</td><td>Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA 900 equipado con un colector de fracción&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jasco J-815 Dicroísmo Circular</td><td>Jasco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters Sistema UPLC&nbsp;</td><td>Waters</td><td></td><td>C8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 micras columna&nbsp; , columna precalentada (40 &deg; C), caudal de 0,6 mL/min, volumen de inyección de 4 &mu; L</td></tr><tr><td>waters Sistema de HPLC</td><td>Waters Detector</td><td>UV 2489 de Waters y módulo de gradiente cuaternario 2535, bucle de 20 mL en carcasa FlexInject</td>ESI-MS: Finnigan LTQ Thermo Fisher Scientific instrumento liofilizador FreeZone 2.5 Plus Tecnai Spirit BioTWIN&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td>Microscopio electrónico <td>FEI</td><td></td><td>equipado con un cañón LaB6 y una cámara CCD FEI Eagle (FEI) 4K x 4K y operado a 80 kV</td></tr><tr><td>37 &deg; C temblor&nbsp; incubadora</td><td>Infors HT multitron Standard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biophotometer plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generación de monómero exon1 huntingtina nativo, sin etiquetar y fibrillas utilizando una estrategia de fusión de sumo

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Enfermedad de Huntington (EH) es una enfermedad hereditaria neurodegenerativa fatal causada por una expansión CAG (≥36) en el primer exón del gen HD, dando como resultado la expresión de la proteína huntingtina (Htt) o N-terminal sus fragmentos con una ampliada del polyglutamine ( estiramiento de la poliQ).
Exon1 de la proteína huntingtina (Httex1) es el más pequeño fragmento de Htt que recoge muchas de las características de HD en celulares y modelos de animales y es uno de los fragmentos más ampliamente estudiados de Htt. El tamaño pequeño del Httex1 hace experimentalmente más favorable a la caracterización biofísica, utilizando técnicas estándar y de alta resolución en comparación con fragmentos más largos o Htt de larga duración. Sin embargo, la propensión de la alta agregación de mutante Httex1 (mHttex1) con contenido mayor poliQ (≥42) ha hecho más difícil desarrollar expresión eficiente y sistemas de purificación para producir estas proteínas en cantidades suficientes y hacerlos accesibles a científicos de diferentes disciplinas sin el uso de otras estrategias que alteran la secuencia nativa de la proteína o proteínas de fusión. Aquí presentamos un método robusto y optimizado para la producción de cantidades del miligramo de nativo, etiqueta libre de Httex1 basado en la fusión transitoria de ubiquitina pequeños modificadores relacionados (SUMO). La simplicidad y la eficacia de la estrategia eliminará la necesidad de utilizar secuencias de no nativos de Httex1, así que esta proteína más accesible a los investigadores y mejorar la reproducibilidad de los experimentos en diferentes laboratorios. Creemos que estos avances también facilitará futuros estudios dirigidos a dilucidar la relación estructura-función de Htt, así como en desarrollo nuevas herramientas de diagnóstico y terapias para tratar o retardar la progresión de la EH.

Httex1 se expresa en e. coli con un N-terminal su6-etiqueta SUMO. Los resultados representativos de la expresión y purificación de la proteína de fusión se resumen en la figura 1. La secuencia de Httex1 consiste en los residuos 2-90 de Htt y empieza por Ala2, porque Met1 es totalmente exfoliados en vivo42. La numeración de los aminoácidos se refiere a la variante 23Q, la secuencia completa de la proteína de fusión expresada se muestra en la figura 1A. La plásmidos se depositará en el Addgene en un futuro cercano para compartir con la comunidad. Se muestra un esquema del plásmido y la proteína de fusión expresado en la figura 1B. His6-SUMO Httex1 expresa en un nivel medio (figura 1C) y la mayoría de la proteína de fusión está presente en la fracción soluble después de la lisis, tanto para la variante 43Q y la 23Q. La proteína de fusión migra más de lo esperado, basado en el peso molecular. Esto es en parte debido al fuerte repliegue de SUMO pero sobre todo debido a la composición de la secuencia inusual de Httex1, que contiene principalmente residuos de glutamina y prolina. El tipo salvaje (23Q) y el mutante (43Q) proteína de fusión puede ser enriquecida a ~ 80% de pureza por IMAC (figura 1D) la presencia de co purificar proteína huésped puede explicarse por el nivel comparativamente bajo de la expresión de Httex1 y la gran muestra volumen aplicado a la columna.
El escote de su6-etiqueta SUMO y la purificación del Httex1 se muestra en la figura 2A. UPLC es una herramienta eficaz para controlar la ruptura de su6-etiqueta SUMO (figura 2B). Se consume el pico original de la proteína de fusión y dos picos nuevos y bien separados, correspondientes a su6-etiqueta SUMO y Httex1 aparecen. La reacción de hendidura está acabada en 10-20 minutos. El Western Blot (WB) es demasiado lento para controlar eficazmente la reacción de hendidura, pero ha sido incluida en la figura de referencia y demostrar la integridad de la división SUMO. Ambos Httex1 23Q y 43Q pueden ser separados de su6-SUMO de la etiqueta por RP-HPLC (figura 2C) y fueron obtenidos en alta pureza como se muestra por el análisis de UPLC, MS y SDS-PAGE (figura 2D).
Para ilustrar que las proteínas de Httex1 preparadas por este método de conservan las propiedades de agregación esperado de Httex1, se evaluó la cinética del fibrillization de la mutante Httex1 a 37 ° C por un ensayo de sedimentación, controlar los cambios en la estructura secundaria por el CD Espectroscopia y caracteriza la morfología de los agregados por TEM. Un conjunto de datos representativo de la cinética de agregación de mHttex1 de formación de fibrilas según lo determinado por un ensayo de sedimentación se muestra en lafigura 3A. La pérdida de Httex1 soluble 43Q con el tiempo, debido a la formación de fibrilas se cuantificó por UPLC. Se observa un agotamiento total de proteína soluble después de 48 horas de incubación. Además, se determinó la estructura secundaria de la proteína por espectroscopia de CD (figura 3B). Httex1 43Q turnos de no estructurados (λmin 205 nm) a conformación rica principalmente β-hoja (λmin 215 nm) después de 48 horas de incubación. Este cambio estructural es acompañado por la formación de agregados fibrilares largos como observables por TEM en 48 horas (figura 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig1.jpg"> Figura 1 . Expresión y purificación de su6-proteína de fusión del SUMO Httex1.  (A) la secuencia de aminoácidos de su6-SUMO-Httex1-QN fusión construcciones (su6-SUMO en verde y Httex1 QN en color naranja); (B) Descripción esquemática de la expresión y purificación de la proteína de fusión; (C) análisis de SDS-PAGE de la expresión y la solubilidad de la proteína de fusión después de lisis; (D) cromatograma del análisis de las fracciones por SDS-PAGE y la purificación de la IMAC de la proteína de fusión (roja de la barra: barra de fracción no unida, azul: fracción de lavado, negro de la barra: fracciones que contienen el pico de elución); <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig2.jpg"> Figura 2 . Escote de su etiqueta SUMO6 y purificación de proteínas Q Httex1N libre de etiqueta. (A) Descripción esquemática; (B) análisis de la ruptura de la etiqueta SUMO con ULP1 por UPLC (azul: antes de la adición de ULP1; negro: 20 min (23Q), respectivamente de 10 min (43Q) después de la adición de ULP1) y WB (MAB5492 1: 2000, secundario cabra anti anticuerpo de ratón 1: 5000); (C) cromatograma de la purificación de RP-HPLC preparativa de Httex1; D: Análisis de la Httex1 purificada por UPLC, SDS-PAGE y ESI-MS; el peso molecular esperado es Da 9943 (23Q) y Da 12506 (43Q) respectivamente. <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig3.jpg"> Figura 3 . Agregación de 43Q Httex1: ensayo de sedimentación (A) basa en UPLC. (B) espectro de CD de la estructura secundaria en 0 h y micrografías TEM 48 h. (C) de los agregados a las 48 h (las barras de escala son 200 nm). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, presentamos un protocolo robusto y optimizado para la producción de cantidades de miligramos de monómeros nativos, libre de etiqueta y las fibrillas de la exon1 de la proteína huntingtina (Httex1) basado en la fusión transitoria de ubiquitina pequeños modificadores relacionados (SUMO).

Generación de monómero Exon1 huntingtina nativo, sin etiquetar y fibrillas utilizando una estrategia de fusión de SUMO

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Este método nos permite producir un exón libre de etiquetas que lleva la secuencia nativa de la proteína y proporciona nuevas oportunidades para estudiar la función estructural de esta proteína, lo que nos permite comprender su función en la salud y la enfermedad. Las principales ventajas aquí son la simplicidad, eficiencia y robustez del método. Al eliminar la heterogeneidad de la secuencia, este método permitirá y facilitará la comparación y la reproducibilidad entre diferentes laboratorios.Aunque este método se desarrolló para la producción del exón uno de la huntingtina, también se puede aplicar a otros sistemas propensos a la agregación, como el péptido beta amiloide y la alfa-sinucleína. En primer lugar, filtre un sobrenadante previamente aislado que contenga la proteína de fusión del exón uno de la huntingtina His-SUMO utilizando un filtro de jeringa de 0,45 micrómetros. Extraiga una muestra de 20 microlitros del sobrenadante filtrado para el análisis SDS-PAGE.Llene el lisado clarificado en un Superloop. Aísle la proteína de fusión del exón uno de la huntingtina His-SUMO del lisado bacteriano clarificado mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizada en un sistema de cromatografía líquida de rápido rendimiento a cuatro grados Celsius. Pase volúmenes de 10 columnas o 200 mililitros de tampón A a 10 mililitros por minuto para lavar las proteínas no unidas.Eluir la proteína de fusión con volúmenes de 2,5 columnas o 50 mililitros de 100% de tampón B a dos mililitros por minuto. Tome 20 microlitros de cada fracción para el análisis SDS-PAGE. Agregue 20 microlitros de tinte de carga a cada muestra.Cargue dos microlitros de la proteína bruta, la fracción no unida, la fracción de lavado y cada fracción del pico de elución en un gel al 15%. Haga funcionar el gel durante 90 minutos a 180 voltios. Cuando termine la ejecución, tiña el gel con tinte Coomassie de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Agrupe las fracciones que contienen la proteína de fusión de acuerdo con el pico del cromatograma. A continuación, añada 100 milimolares de DTT y 100 milimolares de L-cisteína a las fracciones agrupadas, y disuelva invirtiendo suavemente el tubo. Para preparar el disolvente A para la purificación por HPLC, añada dos mililitros de ácido trifluoroacético a una botella de agua de dos litros.Para preparar el disolvente B, agregue 2,5 mililitros de ácido trifluoroacético a una botella de 2,5 litros de acetonitrilo. Prepare el sistema de HPLC según lo sugerido por el fabricante. Realice una tirada en blanco para asegurarse de que la columna esté limpia.Después de esto, tome 100 microlitros de la proteína de fusión antes de la adición de ULP1 para monitorear la reacción de escisión por UPLC. Transfiera 20 mililitros de la proteína de fusión a un nuevo tubo de 50 mililitros y agregue 0,4 mililitros de solución madre ULP1. Incubar la muestra en hielo y mantener el resto de la proteína de fusión en hielo.No almacene la proteína durante los pasos intermedios y proceda con la purificación hasta su finalización. Cada 10 minutos, retire 100 microlitros de la reacción de escisión para monitorear el progreso del UPLC. Después de centrifugar las muestras, analice dos microlitros de cada sobrenadante por UPLC.Compare los cromatogramas obtenidos para la muestra antes de la adición de ULP1 y las muestras tomadas después. Una vez que se complete la hendidura de SUMO, filtre la muestra con un filtro de jeringa de 22 micrómetros. A continuación, purifique la muestra filtrada mediante HPLC de fase reversa.Analice las fracciones de HPLC por UPLC y ESI-MS. Piscina de fracciones de pureza similar en tubos de plástico de 50 mililitros. Congelar las muestras en nitrógeno líquido y liofilizar.Luego, transfiera la proteína liofilizada a tubos de plástico de dos mililitros y guárdela a menos 20 grados centígrados. Disuelva 100 microgramos de exón de huntingtina liofilizado uno en ocho microlitros de ácido trifluoroacético puro en un tubo de 1,5 mililitros. Después de incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente, evapore con cuidado el ácido trifluoroacético debajo de una campana extractora con un chorro de nitrógeno o argón.Una vez que la proteína esté seca, disuélvela en 100 microlitros de agua. A continuación, analice dos microlitros de muestra por UPLC. Ahora mezcle 20 microlitros de solución de proteína con 20 microlitros de tinte de carga 2X.Analice muestras de proteína de uno a 10 microgramos mediante SDS-PAGE. Haga funcionar el gel durante 90 minutos a 180 voltios. Cuando termine la ejecución, tiña el gel con tinte Coomassie de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Prepare 10 mililitros de DPBS en un tubo de 50 mililitros. Filtre la solución de DPBS a través de un filtro de 2 micrómetros antes de cada uso. A continuación, disuelva 150 microlitros de exón de huntingtina liofilizada uno de cada 12 microlitros de ácido trifluoroacético puro en un tubo de 1,5 milímetros.Después de incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente, evapore con cuidado el ácido trifluoroacético en una campana extractora con un chorro de nitrógeno o argón. Disuelva la proteína desagregada en un mililitro de DPBS preenfriado y ajuste el pH entre 7,2 y 7,4 con un hidróxido de sodio molar. A continuación, filtre la solución proteica a través de un filtro centrífugo de 100 kilodalton en tubos de plástico de 1,5 mililitros.Determine la concentración de huntingtina exón uno utilizando una curva de calibración UPLC basada en la detección de análisis de aminoácidos. A continuación, calcule la cantidad de DPBS que debe añadirse para obtener una concentración de Huntingtina de tres micromolares exón uno. Diluya la proteína a tres micromolares agregando la cantidad calculada de DPBS al tubo de ensayo.Mantenga el tubo en hielo hasta el inicio del protocolo de agregación. La validación mediante electromicroscopía y otras técnicas debe realizarse para validar que el protocolo de desagregación ha tenido éxito en la eliminación de los agregados preformados. Aquí se muestra la secuencia completa de aminoácidos de la proteína de fusión expresada.Aquí se muestra un esquema del plásmido y la proteína de fusión expresada. El exón uno de Huntingtina His-SUMO se expresa a un nivel medio, y la mayor parte de la proteína de fusión está presente en la fracción soluble después de la lisis, tanto para la variante de 23 glutaminas como para la de 43 glutaminas. Tanto la proteína de fusión de tipo salvaje como la mutante pueden enriquecerse hasta alcanzar una pureza aproximada del 80% mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizados.Aquí se muestra la escisión de la etiqueta His-SUMO y la purificación del exón uno de Huntingtina. Se consume el pico original de la proteína de fusión y aparecen dos picos nuevos y bien separados que corresponden a la etiqueta His-SUMO y al exón uno de Huntingtina. Tanto el exón uno de huntingtina 23 glutaminas como las 43 glutaminas se pueden separar de la etiqueta His-SUMO mediante HPLC de fase reversa y se obtuvieron en alta pureza como se muestra en el análisis UPLC, MS y SDS-PAGE.La cinética de agregación de la formación de fibrillas del exón uno de m-huntingtina, determinada por un ensayo de sedimentación, muestra un agotamiento completo de la proteína soluble después de 48 horas de incubación. La espectroscopia CD de la estructura secundaria de la proteína muestra un cambio de las glutaminas del exón uno de Huntingtina 43 de no estructuradas a la conformación rica en láminas beta. Este cambio estructural se acompaña de la formación de agregados fibrilares largos observados por TEM.Una vez dominado, este método para la expresión y purificación del exón uno de la huntingtina se puede llevar a cabo en tres días si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es muy importante recordar que las proteínas del exón uno de la huntingtina, especialmente la proteína con estiramiento de poliglutamina expandido, tienen una propensión muy alta a agregarse. Gracias a este método, somos capaces de producir suficientes proteínas del exón uno de la huntingtina y realizar estudios previamente inaccesibles para investigar la estructura, la agregación y la toxicidad de la proteína y desarrollar nuevos ensayos para detectar y cuantificar la forma del exón uno de la huntingtina asociada a la enfermedad.La estabilidad y la alta solubilidad de la proteína de fusión SUMO proporcionan una mayor flexibilidad en la manipulación de la proteína y permiten la introducción de modificaciones en el contexto de las proteínas de fusión que de otro modo no serían posibles después de la escisión. Esperamos que la simplicidad y la eficiencia de este método eliminen la necesidad de utilizar secuencias no nativas y sistemas modelo y animen a los investigadores de diferentes disciplinas a unirse a nuestra búsqueda para comprender la biología de esta importante proteína y desarrollar terapias efectivas para el tratamiento de la enfermedad de Huntington.

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Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

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Este protocolo describe la conversión de fibroblastos de piel en mioblastos y su diferenciación en miotubes. Las líneas celulares se derivan de pacientes con trastornos neuromusculares y se pueden utilizar para investigar mecanismos patológicos y para probar estrategias terapéuticas.

Reprogramación directa de fibroblastos humanos en mioblastos para investigar terapias para trastornos neuromusculares

Proporcionamos protocolos escalables que cubren el diseño de constructo, la transfección transitoria y la expresión y purificación de variantes de proteína huntingtina humana de longitud completa en células HEK293.

Producción eficiente y escalable de variantes completas de huntingtina humana en células de mamíferos utilizando un sistema de expresión transitoria

Describimos aquí un método para la identificación de proteínas de unión a moléculas pequeñas utilizando el marcaje de fotoafinidad. La ventaja de esta técnica es que la unión y el marcaje covalente de las proteínas diana se producen dentro del entorno celular vivo, lo que elimina el riesgo de alterar la estructura de la proteína nativa y las condiciones de unión durante la lisis celular.

Identificación de las pequeñas proteínas de unión a la molécula-celular en un entorno nativo de Células vivas marcado por fotoafinidad

Aprende a producir monómeros y fibrillas nativos de huntingtina sin etiquetas mediante una estrategia de fusión SUMO. Este método robusto facilita estudios estructurales y funcionales de proteínas propensas a la agregación.

Generación de monómero Exon1 huntingtina nativo, sin etiquetar y fibrillas utilizando una estrategia de fusión de SUMO

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