Name: Evaluación funcional salival murino mediante pilocarpina estímulo siguiente fraccionado radiación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprende a evaluar la función salival murina mediante estimulación con pilocarpina. Este protocolo modular incluye traqueotomía, recolección de saliva y disección de glándulas para investigar disfunciones glandulares y probar intervenciones potenciales.

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Investigación en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de odontología y el Instituto Nacional de cáncer (NCI) de los institutos nacionales de salud Premio número R56 DE025098, DE027695 UG3 y F30 CA206296 Craniofacial Research (NIDCR). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud. Este trabajo también fue apoyado por la NSF DMR 1206219 y la innovación de la IADR en Premio de Cuidado Oral (2016).
Nos gustaría agradecer al Dr. Eri Maruyama y Andrew Hollomon su asistencia con la colección de saliva. Nos gustaría agradecer su ayuda con la disección de la glándula Weng Pei-Lun. Nos gustaría agradecer a Matthew Ingalls por su ayuda en la preparación de la figura. Nos gustaría agradecer al Dr. Elaine Smolock y Emily Wu lectura crítica de este manuscrito.

Todo en vivo los procedimientos descritos a continuación fueron aprobados por el Comité de la Universidad sobre los recursos de la Universidad de Rochester, Rochester. NUEVA YORK.
1. preparación
<ol><li>Utilizando una balanza analítica, pesan 20 mg de pilocarpina. Disolver en 2 mL de solución salina estéril en un tubo de microcentrífuga. Nota: Porque pilocarpina es sensible a la luz y pierde actividad con el tiempo, esta solución debe ser preparada el día de la inyección y protegida de la luz hasta que administra.</li>
	<li>Utilizando una balanza analítica, pesar e identificar todos los tubos y capilares de vidrio. El número de tubos y capilares de vidrio debe coincidir con el número de ratones.</li>
</ol>2. traqueostomía
<ol><li>Pesar ratones C57/BL6 utilizando una balanza analítica.</li>
	<li>Utilizando una jeringa de 0.5 mL con aguja 29 x ½", anestesiar ratones con una solución salina estéril inyectada por vía intraperitoneal de 100 mg/kg ketamina y 10 mg/kg xilacina. Proceder al paso siguiente cuando el ratón deja de responder a los estímulos (es decir, ausencia del reflejo pedal retirada), que ocurre generalmente dentro de 5 a 10 minutos después de la inyección.</li>
	<li>Después de dispensar lubricante en un aplicador con punta de algodón, suavemente aplique a los ojos y coloque el ratón en una posición supina en el escenario. El animal anestesiado debe mantenerse en la superficie caliente. Nota: Todas las medidas se realizan a temperatura ambiente.</li>
	<li>Asegure la nariz, extremidades y cola a la etapa con cinta quirúrgica.</li>
	<li>Limpiar y mojar el cuello con un algodón empapado en alcohol. Nota: Esto ayudará a prevenir la piel entren en incisiones posteriores.</li>
	<li>Levantando la piel del cuello del midline ventral con pinzas, hacer un corte pequeño y superficial con tijeras de disección. Guía de las tijeras en la abertura y abra lentamente las hojas por vía subcutánea para separar tejidos planos.</li>
	<li>Mantener la piel levantada, cuidadosamente corte a 1 cm por debajo de la boca.</li>
	<li>Hacer dos incisiones laterales en los aspectos inferior y superiores del primer corte. Suavemente con unas pinzas, reflejan a la piel para permitir el acceso a las estructuras de cabeza y cuello.</li>
	<li>Usando el microscopio de disección con 8 aumentos, visualizar las glándulas submaxilar (media: figura 1).</li>
	<li>Con unas pinzas finas, levante suavemente las glándulas para exponer los cuatro músculos del infrahyoid (correa) que cubre la tráquea. Evitar desgarros o interrumpir la vasculatura circundante o conductos excretores.</li>
	<li>Si recoger saliva de más de un ratón, repita los pasos 2.1-2.10 con cada ratón antes de continuar. Nota: Este procedimiento puede realizar con seguridad en hasta 5 ratones al mismo tiempo.</li>
	<li>Con pequeñas tijeras de disección, quitar la porción medial de los músculos de la correa durante su estancia lo más cerca posible de la línea media. Corte solamente tanto como sea necesario visualizar la tráquea y mantener los músculos de la correa del camino durante el procedimiento. Evitar mellar cualquier buques cercanos porque si hay depleción de volumen secundaria a hemorragia significativa, pilocarpina no será eficaz en la inducción de secreción.</li>
	<li>Reflejo de los músculos de la correa de la tráquea.</li>
	<li>Visualizar la laringe, la tráquea y la glándula tiroides. Asegúrese de que la tráquea esté libre de tejido sobrepuesto.</li>
	<li>Hacer una incisión horizontal en la tráquea inferior posterior de la tiroides usando pequeñas tijeras de disección. Asegurar la vía aérea patente y claro del líquido.</li>
</ol>3. saliva colección
<ol><li>Retire la cinta junto a la boca y el ángulo de fase de disección hacia abajo (45°, cranially) para ayudar a flujo de la saliva.</li>
	<li>Utilizando una jeringa de 0.5 mL con aguja 29 x ½", realizar la inyección intraperitoneal de 10 μl/g cuerpo peso la pilocarpina para una dosis total de 100 mg/kg.</li>
	<li>Iniciar un temporizador. Si la dosis múltiples ratones, reducir tiempo moviendo rápidamente y por tener un ayudante inyecta simultáneamente los ratones restantes.</li>
	<li>Con unas pinzas estándar, abrir la boca para el acceso del tubo capilar.</li>
	<li>Una vez que se observa una gota de saliva en la boca, coloque el extremo proximal del tubo capilar en el líquido, con el extremo distal se coloca en un tubo colector colocado debajo de la etapa de disección (ambos tubos previamente pesados). Nota: En los ratones hembra C57/BL6 6-10 semanas de edad, bruta salivación ocurre dentro de 2 minutos de la inyección de pilocarpina.</li>
	<li>Si saliva en la boca del edificio, pero no fluye a través del tubo, reintentar el paso anterior. Asegúrese de que el tubo no esté directamente contra una superficie mucosa, que puede obstruir la entrada.</li>
	<li>Recoger saliva para un total de 12 minutos después del estímulo la pilocarpina. Asegúrese de que el estoma permanece claro. Nota: Aumento del volumen tidal y secreciones (salivales, urinarias, fecales) son normales durante este tiempo.</li>
	<li>Si los ratones han presionado función de saliva (ej., debido a lesión o intervención), transferir el líquido restante de la boca en el tubo de la colección mediante una micropipeta de P200. Si recogida de varios ratones, asegúrese de que los consejos han cambiado.</li>
	<li>Registrar el peso de saliva recogida más tubos 12 min después de la inyección de pilocarpina.</li>
</ol>4. glándula disección
<ol><li>Eutanasia a ratones por CO2 eutanasia (como se describe en las pautas de AVMA de eutanasia de los animales: edición 2013) seguido de toracotomía, teniendo cuidado de preservar las estructuras de la cabeza y el cuello. Por esta razón, evitar la dislocación cervical como método de eutanasia.</li>
	<li>Coloque el ratón en una posición supina en el escenario. Vuelva a colocar las glándulas en el sitio original sobre la tráquea (figura 1).</li>
	<li>Utilizando un microscopio de disección bajo 8 aumentos, visualizar las glándulas principales: el PG, SMG y SLG. Para distinguir las glándulas durante la disección, identificar que el PG es difusa, lateral a la SMG y SLG. Nota: Si el PG de disección, esto debe hacerse en primer lugar porque es el menos definido y más probable ser rasgado.</li>
	<li>Agarre la cola de la PG con pinzas, tirando lejos de las estructuras subyacentes y suavemente aplique tensión antes de cortar la cabeza de la PG con tijeras de disección.</li>
	<li>Incumplimiento la cápsula que rodea el metralletas con unas pinzas. Separe suavemente el SMG de izquierda y derecho.</li>
	<li>Libre de la cara dorsal de la SMG del tejido nonglandular adherido con unas pinzas.</li>
	<li>Retire el SMG del cuello tenso del conducto de Wharton con pinzas y corte el tubo con tijeras de disección.</li>
	<li>Separe suavemente el SLG de SMG con unas pinzas. Nota: La SLG es en el aspecto superolateral del SMG.</li>
	<li>Con una balanza analítica, registre pesos SMG.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Presentamos un método de varios pasos para evaluar la función de la glándula salival, que puede ser aplicada para el estudio de lesiones de la glándula y terapéutica. Nuestro procedimiento consiste en traqueostomía, la recolección de saliva y disección de la glándula, que tiene aplicaciones experimentales que soporten un estudio integrado de la biología de la glándula salival. Por ejemplo, traqueotomía murino se ha utilizado para la gestión general de la vía aérea durante procedimientos de obstrucción de la cavidad bucal...

Trastornos de la glándula salival incluyen síndromes de altera o deteriora la secreción hacia la superproducción (sialorrea) o insuficiente (xerostomía e hiposalivación) de saliva1. En ambos casos, hay un interés por mejorar nuestra comprensión de la biología de la glándulas salivales hacia la meta final del desarrollo terapéutico2.
Las glándulas salivales son órganos altamente radiosensibles y a menudo se dañan durante la radioterapia de cáncer cabeza y cuello, hacia la permanente boca seca (xerostomía)3,4. Sin embargo, a diferencia de otros tejidos radiosensibles, índice de rotación de la glándula salival es relativamente baja, y el mecanismo de la pérdida de secreción es mal entendido5,6. En este escenario de lesiones únicas, estrategias de regeneración y protección radiológica de tejido requieren evaluación funcional salival. Experimentalmente, colección de saliva murino es una herramienta especialmente valiosa en la evaluación de la respuesta de la glándula a la radiación y los agentes terapéuticos.
Aquí, presentamos un método para realizar y cuantificar la secreción de saliva estimulada con pilocarpina, un potente agonista muscarínico7. La pilocarpina estimula el sistema nervioso autónomo para inducir la secreción de la glándula8,9. Para completar correctamente esta prueba, una traqueotomía se requiere para asegurarse de que el ratón mantenga una vía aérea patente durante todo el procedimiento y para reducir los riesgos de asfixia y aspiración de secreciones agrupadas en la cavidad oral10.
Este es un procedimiento terminal, culminando en la eliminación de las tres glándulas salivales mayores: parótida (PG), el submaxilar (SMG) y sublingual (SLG). Para los estudios funcionales, glándula pesos se registran y se utilizan a menudo para normalizar saliva medición11,12,13. Esta información es particularmente importante en estudios de radiación, en la que la atrofia de la glándula es un resultado esperado14,15
Hay variabilidad en la literatura con respecto a la secreción de saliva estimulada cómo se realiza y divulga16. Por ejemplo, dosis de pilocarpina en la literatura palmo por lo menos tres órdenes de magnitud17,18,19,20,21,22,23. Aquí, presentamos un protocolo de pilocarpina optimizado de dosis alta con la intención de mejora reproducibilidad en ejecución método, así como proporcionar una plataforma modular de técnicas (traqueostomía, la recolección de saliva y disección de la glándula) que pueden ser adaptados como necesario.
Además de la demostración del Protocolo, incluimos datos funcionales representativos de flujo de la saliva a las 2 semanas después de la radiación fraccionada (4 dosis de 6.85 Gy) a la región SMG.

<table><tbody><tr><td>Clorhidrato de pilocarpina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6503</td><td>Pilocarpina</td></tr><tr><td>Student Vannas Tijeras de resorte</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-9</td><td>Tijeras de resorte para traqueostomía</td></tr><tr><td>Solución salina estéril</td><td>Medline</td><td></td><td>RDI30296H solución salina</td></tr><tr><td>Dumont #7 Pinzas Fine</td><td>Science Tools</td><td>11274-20</td><td>Pinzas curvas Pinzas</td></tr><tr><td>Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>Pinzas</td></tr> rectas <tr><td>Pinzas de patrón estándar</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>Pinzas romas</td></tr><tr><td>Tijeras finas- carburo de tungsteno</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td>Tijeras de disección</td></tr><tr><td>Microhematocrito Tubos capilares heparinizados</td><td>Fisher Scientific</td><td>22362566</td><td>Tubos capilares</td></tr><tr><td>Ungüento</td> <td>lubricante para los ojosRefresh</td><td>N/A</td><td>Refresh Lacri-Lube</td></tr><tr><td>Goat polyclonal anti-Nkcc1</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC-21545</td><td>Nkcc1 Anticuerpo</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>GraphPad Prisma</td><td>GraphPad</td><td>ver6.0</td><td>Software estadístico</td></tr><tr><td>Aplicador con punta de algodón</td><td>Medline</td><td>MDS202000</td><td>Aplicador para ungüento ocular</td></tr><tr><td>0.5cc Jeringa de insulina, 29G x 1/2"</td><td>BD</td><td>7629</td><td>Jeringa para inyección intraperitoneal</td></tr></tbody></table>

evaluación funcional salival murino mediante pilocarpina estímulo siguiente fraccionado radiación

Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

Hiposalivación se observa comúnmente en la reacción autoinmune síndrome de Sjögren o siguiente lesión por radiación a las glándulas salivales mayores. En estos casos, quedan preguntas con respecto a la patogénesis de la enfermedad y las intervenciones eficaces. Una técnica optimizada que permite la evaluación funcional de las glándulas salivales es muy valiosa para la investigación terapéutica, disfunción y biología de la glándula exocrine. Aquí, presentamos un enfoque paso a paso para realizar la pilocarpina estimula la secreción de saliva, incluyendo la disección de las glándulas salivales murinas principales tres y traqueostomía. También detallamos la anatomía cabeza y cuello murina apropiada accedida durante estas técnicas. Este enfoque es escalable, permitiendo múltiples ratones ser procesados simultáneamente, mejorando así la eficiencia del flujo de trabajo. Nuestro objetivo es mejorar la reproducibilidad de estos métodos, cada uno de ellos tiene más aplicaciones en el campo. Además de la colección de saliva, discutimos métricas para cuantificar y normalización de la capacidad funcional de estos tejidos. Datos representativos se incluyen de las glándulas submaxilares con función deprimida de la glándula salival 2 semanas después de la radiación fraccionada (4 dosis de 6.85 Gy).

Cuando realizar pilocarpina dosis altas estimula la colección de saliva, es importante mantener la vía aérea para prevenir la aspiración o asfixia de las secreciones en la cavidad bucal. Un esquema de la traqueotomía se proporciona (figura 1). Tras la incisión traqueal, el estoma debe permanecer claro de tejido y fluidos.
Para mejorar la acción capilar durante la recogida de saliva, ratones deben co...

Presentamos un enfoque detallado para realizar la colección de saliva, incluyendo traqueotomía murino y el aislamiento de tres glándulas salivales mayores.

Evaluación funcional salival murino mediante pilocarpina estímulo siguiente fraccionado radiación

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la función salival murina mediante la estimulación de la pilocarpina. Este método se puede aplicar tanto para comprender la historia natural de la disfunción de las glándulas salivales como para probar la eficacia de cualquier intervención potencial. Nuestro protocolo proporciona una plataforma modular de técnicas, que incluyen traqueotomía murina, recolección de saliva y disección de glándulas.Clínicamente, esta técnica tiene implicaciones para los estudios que evalúan la sequedad bucal o la sobreproducción de saliva. Y también se puede aplicar a otros procedimientos intraorales que requieren manejo de la vía aérea. Aquellos que aprenden este protocolo por primera vez pueden encontrar la traqueostomía y la disección de la glándula desafiantes.Esperamos que este video te ayude a aprender la técnica adecuada de aislamiento de glándulas, así como la anatomía relevante. Usando una balanza analítica, pese 20 miligramos de pilocarpina y luego disuélvala en 2 mililitros de solución salina estéril. Las soluciones de pilocarpina deben hacerse frescas el día de su uso.A continuación, pese todos los recipientes de recolección para el proce

murine-salivary-functional-assessment-via-pilocarpine-stimulation

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Un protocolo optimizado para el aislamiento de células madre de la glándula salival del ratón se describe. El método emplea la digestión enzimática y mecánica, y permite el aislamiento de salispheres que contiene células con características de células madre.

Aislamiento de células de la glándula salival del ratón madre

Un protocolo para la canalización de la glándula salival submaxilar del ratón a través de conductos de Wharton se describe. Para este experimento, la solución de azul tripán se usa como un tintorero para demostrar cómo esta técnica efectiva entrega infusiones en la glándula blanco, y sugerir la fiabilidad de este nuevo enfoque como un potencial clínico de drogas / terapia celular para la regeneración de las glándulas salivales.

Canulación de la glándula salival submaxilar del ratón a través del conducto de Wharton

La hipofunción de las glándulas salivales, un efecto adverso importante de la radioterapia de cabeza y cuello, disminuye la calidad de vida del paciente. La demostración de la eficacia de nuevas terapias en modelos animales es un requisito previo antes de la transición clínica. Este protocolo describe la administración retroductal y la irradiación local de las glándulas submandibulares de rata.

Retroductal submandibular Glándula instilación y con localización fraccionado irradiación en un modelo de rata de hipofunción salival

Se describe un método que usa irradiación periférica dirigida a inducir un comportamiento a la fatiga como en ratones. La dosis de irradiación no letal seleccionado conduce a una reducción de una semana de duración de la actividad voluntaria rueda de funcionamiento.

Un modelo de ratón de la fatiga inducida por irradiación periférica

Hipofunción de la glándula salival es una consecuencia frecuente de la terapia de radiación y enfermedad autoinmune. Evaluación reproducible de la función de la glándula salival en modelos de ratón de estas enfermedades es un desafío técnico. Aquí, se describe un método simple de medida preciso y reproducible de la producción de saliva de ratones.

Un método para la medición de la función de la glándula salival en ratones

Entrega local de la droga a las glándulas submaxilares es de interés en biología de la glándula salival de entendimiento y para el desarrollo de nuevas terapias. Presentamos un protocolo de inyección de retroductal actualizada y detallada, diseñado para mejorar entrega exactitud y reproducibilidad experimental. La aplicación presentada en este documento es el de nanopartículas poliméricas.

Inyección de nanopartículas de Retroductal a la glándula submaxilar de ratón

El uso de cultivos organotípica tridimensionales para visualizar la morfología y los marcadores funcionales de las glándulas salivales puede proporcionar ideas novedosas sobre los mecanismos de daño tisular después de la radiación. Aquí se describe un protocolo de sección, cultura, irradiar, mancha, y la imagen de 50 – 90 μm grueso secciones de la glándula salival antes y después de la exposición a la radiación ionizante.

Tratamiento de radiación de cultivos organotípico de glándulas salivales submandibulares y parótidas modelos clave en vivo características

Las imágenes inmunofluorescentes están limitadas por la capacidad de observar procesos biológicos complejos y dependientes del tiempo en una sola instantánea en el tiempo. Este estudio describe un enfoque de imágenes en vivo realizado en cortes de glándula submandibular de ratón cortados con precisión. Este enfoque permite la observación en tiempo real de las interacciones célula-célula durante la homeostasis y los procesos de regeneración y reparación.

Interrogación de las interacciones célula-célula en la glándula salival a través de imágenes de células vivas ex vivo

Aquí presentamos un protocolo para aplicar agulla de fuego bajo guía por ecografía a las capas glandulares o musculares para el tratamiento de la sialorrea en pacientes traqueotomiados tras un ictus.

Acupuntura con aguja de fuego guiada por ultrasonidos para tratar la sialorrea en pacientes traqueotomizados

Un modelo murino de la estimulación eléctrica neuromuscular (EENM), una modalidad clínica segura y de bajo costo, a los músculos del compartimento anterior se describe. Este modelo tiene la ventaja de modificar un dispositivo clínico fácilmente disponibles para el propósito de provocar contracciones musculares específicas y específica en ratones.

Un modelo murino de entrenamiento de los músculos mediante la estimulación eléctrica neuromuscular

Aprende a evaluar la función salival murina mediante estimulación con pilocarpina. Este protocolo modular incluye traqueotomía, recolección de saliva y disección de glándulas para investigar disfunciones glandulares y probar intervenciones potenciales.

Evaluación funcional salival murino mediante pilocarpina estímulo siguiente fraccionado radiación

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