Un modelo de asa Intestinal ligados en pollos libre anestesiados patógenos específicos para el estudio de virulencia de Clostridium Perfringens

Aquí presentamos un protocolo quirúrgico crear «loops ligados intestinales» en intestino de pollo. Este procedimiento permite la comparación de virulencia en situ en un único host de varias cepas de Clostridium perfringens . Este método disminuye marcadamente el número de pollos generalmente necesarios para experimentos similares en vivo .

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación de la enteritis necrótica de pollo. Como comparar la virulencia de cepas específicas de Clostridium perfringens que causan esta enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que reduce notablemente el número de pollos generalmente necesarios para experimentos ambivore similares.

Si bien este método puede proporcionar información sobre el potencial de virulencia de las cepas de Clostridium perfringens, también se puede aplicar a otros patógenos intestinales como Clostridium difficile, o Salmonella enterica. Generalmente, los individuos nuevos en este método lucharán porque los procedimientos quirúrgicos necesitan entrenamiento específico y sólo deben ser realizados por aquellos que han adquirido habilidades como suturar, una técnica antes del experimento. Después de anestesiar un pollo sin piernas libre de patógenos de 10 semanas de edad, configure los monitores para mediciones vitales y comience a eliminar manualmente las plumas del abdomen mediante una tracción suave.

A continuación, frote el sitio quirúrgico usando gluconato de clorhexidina con un cepillo de cerdas suaves. Frote suavemente la piel desde el centro hasta la periferia durante cinco minutos sin invertir el curso. A continuación, realice tres pasajes alternos en el sitio quirúrgico con solución de gluconato de clorhexidina y alcohol isopropílico utilizando gasas estériles.

Una vez más, ir desde el centro a la periferia, a continuación, cubrir el pollo. Comience abriendo la cortina por encima del sitio quirúrgico, luego haga una incisión de piel de línea media baja en forma de L con un bisturí número tres, comenzando un centímetro de abrazo al esternón, y terminando en un centímetro craneal a la cloicha. A continuación, continúe la incisión en forma de L perpendicular a la primera haciendo una segunda incisión comenzando en el extremo del abrazo de la primera incisión y continúe cinco centímetros al lado izquierdo del abdomen siguiendo la línea de la pelvis.

Esta abertura permitirá una fácil extracción de los intestinos. A continuación, abra el peritoneo y los músculos abdominales utilizando el mismo patrón en forma de L para acceder a la cavidad abdominal. Los sacos de aire ahora estarán expuestos y deben mantenerse húmedos usando gasa empapada de solución salina.

A continuación, inserta un gancho de snook en la cavidad abdominal siguiendo la pared abdominal izquierda y trabajando el gancho alrededor de los sacos de aire abdominal para extraer los intestinos. Luego, usando gasa seca, continúe exteriorizando suavemente los intestinos para exponer el Jejunum. Extiende los intestinos y mantenlos húmedos con una pulverización frecuente con Saline y cubriéndolos con gasa empapada de Saline.

Es importante ser muy suave al sacar los intestinos porque la tensión excesiva puede romper los vasos mesentéricos que pueden conducir a lesiones isquémicas intestinales y comprometer en gran medida el resultado del procedimiento. Después de exteriorizar los intestinos, hacer una serie de bucles en los intestinos que comienzan en el Jejunum. Cada bucle se puede utilizar para diferentes tratamientos.

En el Jejunum proximal, colocar una ligadura simple con un material absorbente sintético de poliglutamina multifilamento evitando la ligadura de los principales recipientes mesentéricos. A continuación, coloque una ligadura distal a dos centímetros de distancia de la ligadura proximal para completar el primer bucle. Todas las ligaduras proximales y distales deben estar espaciadas por unos dos centímetros.

Cada par de ligaduras hace un bucle, que es un segmento hermético. A continuación, cree un interloop o un segmento de intestino entre los bucles. Coloque una ligadura simple de medio centímetro aboremente a la ligadura distal del primer bucle.

Esta ligadura está en el centro del interloop y disminuirá la posible contaminación cruzada entre bucles. Ahora, continúe el patrón de crear otro bucle de medio centímetro aborra de la ligadura interloop. Aquí, se crean nueve bucles y ocho interloops que cubren 26 centímetros de intestino.

El número de bucles se puede ajustar según sea necesario. A continuación, proceder con la inyección de cepa de Clostridium perfringens en los bucles. En el lado antimesentérico del bucle, utilice una aguja de calibre 26 en un ángulo de 45 grados para inyectar 0,2 mililitros de solución de BHI, que contiene un millón de unidades formadoras de colonias de bacterias en la fase de crecimiento del midlog.

En esta situación, con nueve bucles, cinco cepas diferentes se inyectan en bucles alternos con los bucles intermedios inyectados con el vehículo solo como controles negativos. Después de inyectar los patógenos, reemplace suavemente el tracto intestinal a la zona dorsal de la cavidad abdominal debajo de los sacos de aire. Luego, cierra la cavidad abdominal.

Suturar el peritoneo y los músculos abdominales a lo largo de la pelvis con un patrón de sutura continua simple utilizando un material absorbente sintético de poliglutamina multifilamento. Continúe suturando el peritoneo y los músculos abdominales desde el esternón hasta el cloiche utilizando suturas continuas simples. A continuación, suturar la piel cerca utilizando un material sintético Multifilamento de poliglutamina y un patrón continuo simple.

Primero, sutura a lo largo de la pelvis, luego sutura desde el esternón hasta el cloiche. Después de cerrar las incisiones, mantenga el pollo bajo anestesia general con el uso adecuado de analgésicos para minimizar el dolor animal durante el tiempo de infección. Continúe la monitorización anestésica para garantizar un nivel adecuado de anestesia.

Después de la cantidad deseada de tiempo de infección, como siete horas en el presente experimento, eutanasia el ave y recoger los tejidos intestinales. Usando un bisturí número tres, corte una sección de bucle de medio a centímetro. A continuación, transfiera la sección a 10%Formalin para la fijación durante la noche y análisis histopatológicos posteriores.

Luego, usa la misma cuchilla de bisturí en el mismo lazo para cortar el resto del lazo y transferir ese tejido a un tubo microfundido para el aislamiento de las bacterias. Repita este procedimiento para cada bucle con una nueva cuchilla de bisturí cada vez. Siete horas después de la inyección, un lazo intestinal inyectado con un medio estéril de control tiene un borde de cepillo muesco intacto sin necrosis.

La congestión leve en las capas intestinales de los segmentos no es infrecuente. Siete horas después de la inyección con el patógeno, Clostridium perfringens, las puntas de las vellosidades se erosionan con sitios de entrada necrótica que rodean las puntas. Y luego material necrótico que rodea las vellosidades, hay racimos de bacterias grandes en forma de varilla.

A veces la necrosis se debe a una mala ejecución procesal y puede ser malinterpretada como lesiones producidas por bacterias. Un signo revelador es la ausencia de bacterias en la sección histológica. Además, los vasos sanguíneos de la capa muscular se dilatan gravemente por la acumulación de muchos eritrocitos degenerantes indicativos de congestión vascular.

Esto fue causado por vasos sanguíneos mesentéricos ligados que probablemente fueron ligados para hacer tensión física excesiva en los intestinos. Los bucles isquémicos se pueden identificar fácilmente microscópicamente durante los procedimientos quirúrgicos. Después de la congestión vascular severa unos minutos después de la ligadura, la serosa será de color azul oscuro en lugar de su coloración rojiza rosa normal.

Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo crear múltiples bucles intestinales en un modelo de pollo mediante la colocación de ligaduras en los intestinos. Una vez dominados los procedimientos quirúrgicos, excluyendo el tiempo de infección, se pueden hacer en menos de tres horas, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener el pollo bajo anestesia profunda para controlar el dolor y controlar los signos vitales durante todos los procedimientos, incluyendo la parte quirúrgica y después del tiempo de infección.

Siguiendo este procedimiento o sus métodos como el aislamiento bacteriano, y la identificación directa, como la detección de genes por PCR, se pueden realizar para responder a preguntas externas como la recuperación y la identificación del patógeno inyectado inicial. Después de este desarrollo, esta técnica allanó un camino para que los investigadores en el campo de la patogénesis Clostridium perfringens exploraran la Enteritis Necrótica en pollos. No olvides que trabajar con animales vivos puede ser extremadamente variable.

Y las precauciones tales como el monitoreo anestésico continuo del pollo siempre deben hacerse durante el proceso de realización de este procedimiento.