Evaluación de agentes inductores de la hiperpermeabilidad Vascular en la piel con el ensayo de millas

El objetivo general de este procedimiento es medir la fuga vascular en la dermis del ratón, que es inducida por la inyección intradérmica de agentes promotores de la permeabilidad. Este procedimiento puede ayudar a responder preguntas clave sobre la regulación de la permeabilidad vascular in vivo, como qué moléculas pueden estimular o inhibir la fuga vascular y cuáles son las vías de señalización involucradas. La principal ventaja de este procedimiento es que es rápido y relativamente sencillo y utiliza principalmente reactivos y materiales de laboratorio comunes.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de enfermedades con edema patológico. En particular, los investigadores pueden utilizar este ensayo para identificar nuevas dianas moleculares y probar fármacos relevantes por su capacidad para inhibir la permeabilidad vascular de una manera relativamente rápida y sencilla. Prepare soluciones separadas del inhibidor de histamina Maleato de pirilamina y el tinte azul de Evans, ambos en solución salina al 0,9%.

Luego, trabajando en una cabina de flujo laminar, esterilice las soluciones pasándolas a través de un filtro de 0,22 micrómetros. Cargue las dos soluciones en jeringas separadas de un mililitro equipadas con agujas de calibre 30. A continuación, revuelve el ratón.

A continuación, incline el ratón de forma que la cabeza se dirija hacia el suelo y el abdomen hacia arriba. Después de colocar el ratón, administre 10 microlitros por gramo de peso corporal de la solución de maleato de pirilamina mediante inyección intraperitoneal. A continuación, para promover la vasodilatación, coloque el ratón en una cámara de calor a 37 grados centígrados durante 10 minutos.

A continuación, mueva el ratón a un retenedor de ratón. A continuación, frote la cola con etanol al 70% para una mayor vasodilatación. Administre 100 microlitros de solución de Evans Blue Dye por vía intravenosa a través de la vena de la cola.

Para evitar el sangrado, sostenga rápidamente la cola entre un dedo y el pulgar y aplique presión en el lugar de la inyección. La inyección intravenosa de Evans Blue Dye en la vena de la cola del ratón es un paso difícil y crítico dentro de este procedimiento. En consecuencia, es esencial que los investigadores sean competentes en la realización de esta inyección antes de continuar con el resto del procedimiento.

El establecimiento de la competencia requerirá práctica previa. Utilice soluciones estériles de solución salina tamponada con fosfato para diluir el reactivo de VEGF de modo que el volumen final de la dosis sea de 20 microlitros. A continuación, cargue el reactivo inductor de permeabilidad VEGF y el control del vehículo en dos jeringas separadas de 300 microlitros equipadas con agujas de calibre 31.

Mantenga la aguja en un ángulo de 15 grados con la piel e inyecte 20 microlitros de VEGF por vía intradérmica en el flanco del ratón. Ubique una burbuja elevada dentro de la piel para validar que la inyección se haya realizado correctamente. Realice inyecciones intradérmicas en dos sitios adicionales al menos a un centímetro de distancia.

A continuación, gire el ratón para exponer el segundo flanco y repita las inyecciones por triplicado con la solución del vehículo. Mantenga un registro de cada uno de los sitios de inyección en papel y la hora en que finaliza el procedimiento de inyección. Luego transfiera el mouse a la jaula de inicio.

Continúe monitoreando al ratón hasta que recupere la conciencia y comience a moverse por la jaula. Deje que la solución VEGF actúe durante 20 minutos antes de llamar al mouse. En esta etapa, inyecte secuencialmente VEGFA y vehículo en todos los ratones que sigan el mismo procedimiento.

Después de 20 minutos, coloque cada ratón sacrificado boca arriba y sujete sus patas en un tablero de corcho envuelto en un pañuelo limpio. A continuación, con la ayuda de unas tijeras sin filo, haz una incisión vertical de tres a cuatro centímetros de largo desde la parte inferior del abdomen hasta el pecho del ratón muerto. Luego, usa pinzas y bisturí para cardar la piel desde ambos lados del flanco.

Use el bisturí para eliminar la grasa que esté presente en las regiones alrededor del sitio de la fuga. A continuación, utiliza las pinzas y el bisturí para extirpar las regiones de la piel con el tinte azul Evans filtrado. Las regiones de la piel extirpadas deben ser de tamaño similar.

Transfiera las muestras de piel a tubos de 1,5 mililitros y etiquételas en consecuencia. Seque la muestra colocando el tubo abierto en un bloque de calor durante la noche. Una vez finalizado el secado, agregue 250 microlitros de formamida desionizada a la muestra en una campana extractora.

Cierre la tapa del tubo y colóquelo en un bloque de calor durante la noche para extraer el tinte Evans. Centrifugar las muestras a 10.000 g o más durante 40 minutos en una centrífuga de sobremesa. Después de la centrifugación, transfiera 100 microlitros de cada sobrenadante que contenga colorante de la muestra centrifugada a los pocillos de una placa de 96 pocillos que opera en una campana extractora.

Lea la absorbancia del azul de Evans utilizando un espectrofotómetro. Para estudiar la fuga vascular inducida por VEGF, se inyecta al ratón 50 nanogramos de VEGFA en solución salina tamponada con fosfato o solo con solución salina tamponada con fosfato como vehículo. La imagen muestra un aumento en la acumulación de tinte azul Evans filtrado en las muestras de piel inyectadas con VEGFA en comparación con el control del vehículo in situ.

Esta imagen de placa de 96 pocillos muestra el tinte azul Evans cargado extraído en formamida de la muestra de piel. Este gráfico muestra los valores de absorbancia normalizados de las muestras de control VEGFA emparejadas y solo del vehículo. El gráfico muestra que la inyección de 50 nanogramos de VEGFA aumenta significativamente la fuga de Evans Dye en comparación con el vehículo solamente.

Este gráfico se obtiene después de cuantificar los cambios de pliegue en la densidad óptica del VEGFA frente a las muestras del vehículo. El gráfico muestra un aumento promedio de tres veces en la fuga vascular después de administrar VEGFA en comparación con el vehículo solo. Una vez dominado, el segmento principal de esta técnica se puede hacer en dos horas si se realiza correctamente.

Al realizar este procedimiento, es importante normalizar la fuga vascular inducida por el agente a la fuga vascular inducida por el vehículo para tener en cuenta la fuga vascular inespecífica y la variación entre ratones. Este procedimiento puede combinarse con otros métodos, como la administración de fármacos, para responder a preguntas como si se puede dirigir una proteína para inhibir la permeabilidad vascular. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología vascular exploraran los mecanismos moleculares de la hiperpermeabilidad vascular en ratones modificados genéticamente, identificando los componentes de señalización clave que se requieren para la fuga vascular.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir y medir la fuga vascular en la dermis del ratón.