Evaluación de la inclusión del exón inducido por empalme conmutación oligonucleótidos antisentidos en fibroblastos del paciente de SMA
11 de mayo de 2018
Diferentes oligonucleótidos antisentidos (AONs) han demostrado para inducir la inclusión del exón (modulación de empalme) y rescatar la expresión de SMN para atrofia muscular espinal (SMA). Aquí, describimos un protocolo para AON lipotransfection inducir la inclusión del exón del gen SMN2 y los métodos de evaluación para determinar la eficacia de fibroblastos pacientes SMA.
El objetivo general de este protocolo de lipotransfección es introducir oligonucleótidos antisentido en las células y evaluar la eficacia de estos fármacos en la inclusión de exones en las células de AME. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la terapia antisentido. Por ejemplo, la eficacia de nuevos oligonucleótidos antisentido para proporcionar tratamiento a los pacientes.
La principal ventaja de esta técnica es que es rápida, fácil y lo suficientemente sensible para la prueba de diversas químicas de oligonucleótidos antisentido. Aunque este método se puede utilizar para la transfección de oligonucleótidos antisentido en fibroblastos, también se puede aplicar a otros tipos de células, como los mioblastos primarios y otras líneas celulares. La demostración del procedimiento estará a cargo de Aleks, un técnico de mi laboratorio.
Primero, descongele una solución de 10 micromolares de mezclador de LNA/ADN en hielo. Diluir la solución del mezclador en medios privados de suero hasta la concentración requerida en un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, diluya el reactivo de transfección y agregue el reactivo de transfección diluido al mezclador en una proporción de uno a uno.
Es fundamental que la confluencia celular sea de alrededor del 65 al 80% mientras se realiza la transfección. Si la confluencia es superior al 80%, la eficiencia de la transfección se reducirá. A continuación, incube la mezcla de reactivos de transfección a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Después de 10 minutos, pipetear 900 microlitros de medio privado de suero con 5% de suero bovino fetal en el tubo. No agregue el FBS antes de la incubación con el reactivo de transfección y los mezcladores LNA/ADN, ya que también afecta la eficiencia de la transfección. A continuación, aspire el medio antiguo de la placa de cultivo.
Ahora, agregue un mililitro del medio que contiene el mezclador de LNA / ADN a la placa de cultivo. Luego, deje la placa en la incubadora a 37 grados centígrados durante 24 a 48 horas. Después de la incubación, aspire el medio de la placa de cultivo.
A continuación, pipetee un mililitro de reactivo GPC a las células. A continuación, lave los pocillos varias veces con el reactivo GPC. Después de varios lavados, recoja las células en un tubo de 1,5 mililitros y mantenga las muestras en hielo.
A continuación, agite el tubo a alta velocidad durante 30 segundos. Luego, guarde el tubo a menos 80 grados centígrados durante una hora. Ahora, descongele la muestra a temperatura ambiente y vértice rápidamente.
A continuación, agregue 200 microlitros de cloroformo a la muestra y agítela enérgicamente durante 15 segundos. Luego, incube el tubo a temperatura ambiente durante tres minutos. Después de tres minutos, centrifugar la muestra a 12.000 g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.
Una vez finalizada la centrifugación, recoja la fase acuosa de la parte superior del tubo de centrífuga. A continuación, transfiera la fase acuosa a un nuevo tubo. A continuación, agregue 500 microlitros de isopropanol y un microlitro de ocho microgramos por microlitro de glucógeno de grado de ARN a la fase acuosa.
Agite rápidamente la muestra durante 10 segundos e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la incubación, centrifugar la muestra a 12.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Decantar el sobrenadante una vez finalizada la ejecución.
Agregue un mililitro de etanol frío al 75% y haga un vórtice breve para lavar el pellet obtenido. De nuevo, centrifugar la muestra a 7500 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, expulsa todo el etanol y seca el pellet a temperatura ambiente.
Después de que el pellet se haya secado, disuélvalo en 30 microlitros de agua libre de ADNasa/ARNasa. Luego, incube la muestra a 60 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, lea la concentración del ARN a 260 nanómetros en el espectrofotómetro y ajústela a 15 nanogramos por microlitro.
Para constituir la mezcla maestra de RT-PCR, agregue los dos tampones de reacción X RT-PCR, la mezcla de enzimas RT-PCR de un paso, cebadores directos e inversos y agua destilada libre de ARNasa/ADNasa. Distribuya la mezcla maestra en tubos de PCR de 0,2 milímetros y agregue el ARN total para cada muestra respectiva. A continuación, inicie la reacción de PCR.
Una vez completada la RT-PCR, agregue cinco microlitros de seis tintes de carga X al producto amplificado. A continuación, cargue cinco microlitros de la mezcla en un gel de agarosa al 2%. Encienda la unidad de electroforesis a 100 voltios durante 40 minutos.
En primer lugar, se estudia la eficiencia de diferentes mezcladores. Para ello, se analiza la inclusión del exón 7 de SMN2 y los niveles de GAPDH en fibroblastos SMA transfectados con los mezcladores. La imagen en gel muestra la inclusión del exón 7, donde las bandas superior e inferior representan el exón 7, incluido y excluido, el ARN SMN2.
La eficiencia de inclusión también se cuantifica en 78 a 98% cuando se transfecta con los mezcladores del uno al cinco. Por otro lado, no se obtienen resultados significativos cuando se utilizan mezcladores de seis a ocho para transfectar los fibroblastos AME del paciente en comparación con el control. En el experimento, se utiliza GAPDH como control.
A continuación, se realiza una PCR cuantitativa para analizar la expresión relativa de la longitud completa de SMN2 en comparación con GAPDH. Se observa un fuerte aumento en la cantidad del nivel de transcripción de SMN2 cuando se transfecta con los mezcladores uno a tres y número cinco, en comparación con el control. También se estudia el nivel de expresión de la proteína SMN, que muestra un aumento en el nivel de expresión de la proteína SMN en el fibroblasto del paciente transfectado con los mezcladores uno a cinco.
Se observa un fuerte aumento de 1,5 a 1,9 veces en el nivel de la proteína SMN. En este caso, el control utilizado es la cofilina. Por el contrario, el mezclador seis a ocho no altera el nivel de expresión de la proteína SMN.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo transfectar oligonucleótidos antisentido a fibroblastos y evaluar la eficacia in vitro.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este artículo presenta un protocolo de lipotransfección para introducir oligonucleótidos antisentido (AONs) en células con el fin de inducir la inclusión de exones en el gen SMN2, orientado al tratamiento de la atrofia muscular espinal (AME). La eficacia de este método se evalúa en fibroblastos de pacientes con AME.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Genética
- Biología celular
Antecedentes
- La atrofia muscular espinal (SMA) es un trastorno genético que afecta a las neuronas motoras.
- Los oligonucleótidos antisentido pueden modular el empalme y restaurar la expresión de SMN.
- Los métodos eficaces de administración de AON son cruciales para aplicaciones terapéuticas.
- Este protocolo permite la evaluación de diversas químicas de AON.
Objetivo del estudio
- Introducir eficazmente los AONs en células de AME.
- Evaluar la eficacia de los AONs para inducir la inclusión de exones.
- Proporcionar un método rápido y sensible para probar los AONs.
Métodos Utilizados
- Transfección lipídica de oligonucleótidos antisentido en fibroblastos.
- Evaluación de la inclusión de exones en el gen SMN2.
- Aplicación del método a diversos tipos celulares, incluyendo mioblastos primarios.
- Demostración del procedimiento por un técnico de laboratorio.
Resultados principales
- El método de lipotransfección es eficaz para la administración de AON.
- Se indujo con éxito la inclusión de exones en el gen SMN2.
- El protocolo es adaptable a diferentes tipos celulares.
- Los resultados respaldan el potencial de los AON como tratamiento para la AME.
Conclusiones
- Este protocolo de lipotransfección es una herramienta valiosa para la investigación en terapia antisentido.
- Permite la evaluación rápida de la eficacia de los AON en células de SMA.
- Estudios futuros pueden ampliar este método para explorar nuevos AON.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite una evaluación rápida y sensible de la eficacia de oligonucleótidos antisentido (AON) para inducir la inclusión de exones en SMN2 en fibroblastos derivados de pacientes, apoyando la validación temprana de dianas y la identificación de compuestos iniciales para terapias moduladoras del empalme. Al cuantificar la inclusión de exones y la recuperación de proteínas a bajas concentraciones de AON, proporciona una confianza predictiva para priorizar candidatos con mayor potencia y perfiles de toxicidad reducida. La adaptabilidad del método en diferentes tipos celulares y químicas facilita la reducción de riesgos preclínicos y la continuidad traslacional en las líneas de desarrollo de fármacos para la atrofia muscular espinal (SMA).
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la medición de la eficiencia de inclusión del exón 7 de SMN2 como lectura funcional del acoplamiento al objetivo.
- Valor operativo: Utiliza RT-PCR y qPCR para cuantificar la inclusión de exones y los niveles de transcritos, proporcionando resultados cuantitativos y reproducibles para la validación de objetivos.
- Valor predictivo: Demuestra la recuperación dependiente de la dosis de la proteína SMN mediante inmunotransferencia tipo Western, lo que apoya la reducción del riesgo mecanicista y la selección de candidatos a AON en el portafolio.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Establece un flujo de trabajo basado en lipotransfección compatible con pruebas de alto rendimiento de diversas químicas de AON, incluyendo mixmeros LNA/DNA.
- Reproducibilidad: Normaliza las condiciones de transfección (confluencia del 65 % al 80 %, relaciones de reactivos) y la normalización respecto a los controles GAPDH y cofilina, asegurando consistencia entre experimentos.
- Escalabilidad: Compatible con mioblastos primarios y otras líneas celulares, lo que permite reutilizar la plataforma en modelos relevantes para enfermedades.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la Enfermedad: Utiliza fibroblastos de pacientes con AME para mantener la fidelidad genética y fenotípica, mejorando así la validez traslacional de los datos de cribado de AON.
- Continuidad Preclínica: Relaciona la inclusión de exones con la expresión de la proteína SMN, proporcionando un vínculo mecanicista entre la modulación del blanco molecular y la recuperación fenotípica funcional.
- Avance con Ajuste de Riesgo: Permite tomar decisiones de avance o interrupción basadas en la eficiencia de inclusión de exones (78–98 %) y el cambio de expresión proteica (1,5–1,9 veces), reduciendo el riesgo biológico en fases tardías.
Integración de la tubería y del flujo de trabajo
El método se integra en la continuación del descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales y la evaluación preclínica, permitiendo la evaluación iterativa de la eficacia de los AON antes de los estudios in vivo.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis sobre mecanismos de cambio del empalme al cuantificar la inclusión de exones y excluir efectos fuera del blanco mediante la normalización con GAPDH.
- Selección: Ofrece preparación del ensayo y resultados cuantitativos (porcentaje de inclusión de exones, cambio relativo de transcritos) para una evaluación fiable de compuestos en distintas químicas de AON.
- Análisis: Genera lecturas cuantificables (cuantificación de bandas de RT-PCR, expresión relativa de qPCR, niveles proteicos en inmunotransferencia) que permiten el análisis comparativo de diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta la eficacia molecular con la recuperación de proteínas en células derivadas de pacientes, favoreciendo la alineación de biomarcadores y la continuidad preclínica.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo estandarizado de lipotransfección aplicable a múltiples tipos de AON y sistemas celulares, reduciendo el desarrollo redundante de métodos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva en la validación de objetivos mediante la medición directa de la inclusión de exones y la recuperación de la proteína SMN.
- Valor operativo: Asegura la estandarización, reproducibilidad y sensibilidad para probar diversas químicas de AON a bajas concentraciones.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance/no avance al vincular la eficiencia de inclusión de exones con la expresión proteica, reduciendo el riesgo de fracaso en etapas avanzadas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos de AON basada en umbrales cuantitativos de eficacia.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de ácidos nucleicos, optimización de la transfección y análisis de ARN/proteínas.
- Depende de la compatibilidad del reactivo de transfección, espectrofotómetro para la cuantificación de ARN e instrumentación para electroforesis en gel, qPCR o inmunotransferencia (Western blot).
- Necesita la estandarización entre equipos de las condiciones de transfección (confluencia, relaciones de reactivos) y la normalización con controles (GAPDH, cofilina) para obtener resultados reproducibles.
- La adaptación a mioblastos primarios u otras líneas puede requerir la optimización de la eficiencia de transfección y la evaluación de citotoxicidad.
- Las limitaciones prácticas incluyen la variabilidad en el número de pases de fibroblastos de pacientes y la necesidad de preservar la integridad del ARN durante la extracción.
