Homogénea tiempo resuelto Förster Resonancia energía basada en la transferencia de ensayo para la detección de la secreción de insulina
10 de mayo de 2018
Aquí, presentamos homogénea tiempo resuelve FRET (HTRF) como un método eficiente para la detección rápida de la insulina secretada desde las células.
El objetivo general de este procedimiento es inducir y cuantificar con precisión los niveles de insulina secretada por las células secretoras de insulina. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la diabetes, como los principales mecanismos de la secreción de insulina estimulada por glucosa en las células beta pancreáticas. La principal ventaja de esta técnica es que puede cuantificar de forma precisa y rápida la secreción de insulina en respuesta a la estimulación de la glucosa y detectar los posibles efectos de los fármacos sobre la secreción.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia y el descubrimiento de fármacos para el tratamiento de la diabetes tipo 2, ya que nos permitirá comprender mejor los mecanismos de la disfunción metabólica inducida por fármacos. Aunque este método puede proporcionar información sobre la secreción de insulina de líneas de células beta inmortalizadas, también se puede aplicar a otros sistemas, como los islotes pancreáticos intactos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, debido a los múltiples pasos de manipulación de células y preparaciones de medicamentos.
La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando quisimos elaborar un ensayo rápido para investigar las acciones de los fármacos dopaminérgicos sobre la secreción de insulina. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de manipulación de las células son difíciles de aprender debido a la naturaleza delicada de las células y a la importancia de la precisión para garantizar la coherencia del ensayo entre los experimentos. Primero, haga crecer las celdas INS-1E como se describe en el protocolo de texto.
Una vez que las células alcancen la confluencia deseada, aspire el medio. Lavar las células con cinco mililitros de solución salina tamponada con fosfato. A continuación, agregue 0,5 mililitros de 025% de tripsina a las células y luego déjelas en la incubadora durante tres o cuatro minutos a 37 grados centígrados.
Desactiva la tripsina añadiendo nueve mililitros de medio completo. A continuación, transfiera las celdas a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. A continuación, centrifuga las células para formar un pellet.
Después de la centrifugación, disuelva el pellet en cinco mililitros de medio fresco. Pipetear 10 microlitros de las células resuspendidas del tubo y mezclar con 10 microlitros de tinte vital azul de tripano para evaluar la viabilidad. A continuación, utilice un hemocitómetro para contar el número de células vivas y muertas y asegurarse de que el 90% de las células estén vivas.
Después de contar, agregue un millón de células por mililitro en un medio RPMI 1640 fresco, luego siembre 0,5 mililitros de 500.000 células INS-1E en cada pocillo de una placa de 24 pocillos recubierta de poli-L-lisina. Deje la placa en la incubadora durante todo un día. Al día siguiente, retire el medio y agregue 500 microlitros de medio RPMI 1640 fresco en cada uno de los pocillos.
Incube la placa durante otras 24 horas para que las células se esparzan en las superficies de los pocillos. Para realizar el ensayo, primero prepare el tampón KRB, luego aspire el medio de cada uno de los pocillos y lave con solución salina tamponada con fosfato precalentado, dos veces. A continuación, agregue 450 microlitros de tampón KRB, suplementado con albúmina sérica bovina, pero sin glucosa, en cada pocillo.
Deje la placa de cultivo a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante una hora. Preparar diluciones seriadas de los fármacos en tampón KRB, suplementadas con una concentración final 10X de 200 milimolares de glucosa. Después de la etapa de inanición de glucosa, pipetear 50 microlitros de fármacos diluidos en serie en cada uno de los pocillos correspondientes.
Para la estimulación de la glucosa, agregue los respectivos medicamentos diluidos en serie en presencia de 20 milimolares de glucosa. A continuación, incubar las células a 37 grados centígrados durante 90 minutos. Una vez finalizada la estimulación, recoja los sobrenadantes y transfiéralos a tubos de centrífuga de 1,5 mililitros marcados.
Transfiera 10 microlitros de cada sobrenadante recolectado a una placa de 96 pocillos. Agregue 90 microlitros de KRB a cada pocillo para lograr una proporción de dilución de uno a 10. Mezclar las diluciones para asegurar la homogeneidad.
A continuación, obtenga la curva estándar de insulina para el ensayo de insulina HTRF. A continuación, agregue 10 microlitros de cada una de las muestras de insulina estándar y los sobrenadantes de ensayo diluidos a una placa de 96 pocillos. Prepare la mezcla de anticuerpos en uno o dos donantes para aceptar una proporción en el tampón de detección.
Después de preparar la mezcla de anticuerpos, agregue 30 microlitros a cada uno de los pocillos en una placa de 96 pocillos. Selle la placa e incube a temperatura ambiente. Después de dos horas de incubación, lea la placa con la mezcla de anticuerpos en el lector de placas.
Utilice el módulo óptico HTRF apropiado a 665 y 620 nanómetros para la lectura y utilice 200 destellos para cada pozo. En primer lugar, se traza una curva estándar de insulina para extrapolar los valores reales de insulina a partir de las muestras de ensayo. La curva estándar muestra que la lectura de fluorescencia radiométrica obtenida aumenta significativamente en función de las concentraciones estándar de insulina humana predefinidas.
A continuación, se estudia el nivel basal de secreción de insulina de las células INS-1E en presencia o ausencia de glucosa de 20 milimolares. A partir del gráfico, se muestra que las células segregan aproximadamente 100 nanogramos por mililitro de insulina en presencia de glucosa. Curiosamente, el nivel de insulina es casi la mitad, aproximadamente 15 nanogramos por mililitro en ausencia de glucosa.
A continuación, las células se incuban en presencia de concentraciones crecientes de dopamina con 20 milimolares de glucosa. La insulina secretada se normaliza al valor promedio del porcentaje máximo de insulina de cada pocillo. El gráfico muestra que la dopamina inhibe el GSIS, lo que indica la importancia funcional de los receptores dopaminérgicos en el GSIS.
Este gráfico muestra que la bromocriptina, un medicamento para la diabetes tipo 2, es más potente para inducir GSIS que la dopamina. Este gráfico muestra que con el aumento de la concentración de quinpirol, un agonista D2, aunque menos eficiente que la bromocriptina, muestra una potencia similar a la dopamina en la estimulación del GSIS. Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en cuatro o cinco horas si se realiza correctamente.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar pipetear con cuidado y de manera constante. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros ensayos funcionales, como el ensayo AMP HDRF cíclico, para responder a preguntas adicionales, como los efectos dopaminérgicos de los fármacos en la señalización posterior. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del metabolismo exploraran otras vías de secreción endocrina tanto en líneas celulares inmortalizadas como en islotes pancreáticos.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir con precisión la secreción de insulina de las células usando HDRF.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este artículo presenta la resonancia de transferencia de energía por fluorescencia en el tiempo resuelto homogéneo (HTRF) como un método eficiente para la detección rápida de insulina secretada por células. La técnica es particularmente relevante para comprender la secreción de insulina estimulada por glucosa en células beta pancreáticas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Investigación sobre diabetes
- Mecanismos de secreción de insulina
- Ensayos celulares
Antecedentes
- La secreción de insulina es crucial para el metabolismo de la glucosa.
- Comprender los mecanismos de secreción puede ayudar en la terapia de la diabetes.
- Los métodos actuales pueden carecer de rapidez y precisión.
- HTRF ofrece una alternativa prometedora para la cuantificación.
Objetivo del estudio
- Cuantificar con precisión la secreción de insulina a partir de células secretoras de insulina.
- Explorar los mecanismos de la secreción de insulina estimulada por glucosa.
- Evaluar los efectos de fármacos sobre la secreción de insulina.
Métodos Utilizados
- Técnica de FRET homogénea resuelta en el tiempo (HTRF).
- Inducción de la secreción de insulina en células beta pancreáticas.
- Cuantificación de los niveles de insulina en respuesta a la glucosa.
- Aplicación tanto a líneas celulares inmortalizadas como a islotes pancreáticos intactos.
Resultados principales
- HTRF permite la medición rápida y precisa de la secreción de insulina.
- Se identificaron los mecanismos clave de la secreción estimulada por glucosa.
- Se demostró el potencial para aplicaciones en el descubrimiento de fármacos.
- Se obtuvieron conocimientos sobre la disfunción metabólica relacionada con la diabetes.
Conclusiones
- HTRF es una herramienta valiosa para la investigación de la diabetes.
- Mejora la comprensión de la dinámica de la secreción de insulina.
- Puede facilitar avances en las estrategias terapéuticas para la diabetes tipo 2.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación precisa de la secreción de insulina es esencial para reducir los riesgos en los programas de descubrimiento de fármacos contra la diabetes, ya que permite la evaluación mecanicista de los efectos de compuestos sobre la secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS). El ensayo basado en HTRF proporciona una lectura rápida, reproducible y escalable que apoya la validación temprana de dianas terapéuticas y la identificación de compuestos activos en la investigación de enfermedades metabólicas. Al ofrecer datos cuantitativos de fluorescencia ratiométricos, el método aumenta la confianza predictiva en el perfil farmacológico de moduladores dopaminérgicos y otros secretagogos de insulina.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas relacionadas con la regulación dopaminérgica de la secreción de insulina.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de dianas como los receptores tipo D2 mediante la inhibición dependiente de la dosis de la SFIG.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al distinguir la potencia y eficacia de compuestos en la modulación de la liberación de insulina.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Preparación para el ensayo: Genera mediciones estandarizadas y cuantitativas de insulina adecuadas para formatos de cribado de alto rendimiento.
- Reproducibilidad: Proporciona señales robustas con baja varianza debido a la resistencia a interferencias del FRET con resolución temporal.
- Escalabilidad: Compatible con formatos de placas de 96 pocillos, lo que permite la prueba paralela de bibliotecas de fármacos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela la dinámica secretora humana de insulina utilizando células INS-1E, una línea derivada de insulinoma de rata relevante para la función de las células beta.
- Continuidad traslacional: Conecta hallazgos de descubrimiento con validación preclínica al confirmar los efectos de fármacos sobre la SSIG.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Clarifica la participación de rutas específicas (por ejemplo, la señalización dopaminérgica) antes de avanzar con compuestos hacia estudios in vivo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El ensayo de insulina HTRF se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la selección de interacción con el blanco hasta la validación funcional en programas de enfermedades metabólicas, especialmente en aquellos casos en los que la secreción de insulina actúa como un biomarcador farmacodinámico clave.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis sobre vías que regulan la exocitosis de insulina, como la inhibición mediada por receptores acoplados a proteína G (GPCR) del AMP cíclico (cAMP).
- Screening: Permite la estandarización del ensayo y la cuantificación reproducible de insulina en sobrenadantes de cultivo.
- Análisis: Proporciona lecturas ratiométricas HTRF a 665 nm y 620 nm que permiten extrapolar concentraciones de insulina mediante curvas estándar.
- Investigación Translacional: Conecta datos de secreción in vitro con relevancia preclínica mediante la modelización de las respuestas de células beta humanas a la glucosa y fármacos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para evaluar diversos secretagogos y compuestos inhibidores en diferentes indicaciones metabólicas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad en las interpretaciones mecanicistas de los efectos de los fármacos sobre la secreción.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad entre experimentos mediante protocolos estandarizados de manipulación celular y de reactivos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de continuar o descartar al proporcionar una perspectiva temprana y cuantitativa sobre la responsabilidad metabólica o el potencial terapéutico.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos basada en su modulación de la SSIG.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de cultivo celular, particularmente en el manejo de líneas celulares secretoras de insulina como la INS-1E.
- Depende del acceso a lectores de placas compatibles con HTRF que tengan capacidades de excitación y emisión de doble longitud de onda.
- Necesita la estandarización de la preparación de reactivos, incluyendo el tampón KRB, mezclas de anticuerpos y diluciones de fármacos.
- Implica consideraciones de adaptación al trasladar el método desde líneas celulares inmortalizadas hasta islotes primarios o modelos derivados de humanos.
- Está limitado por la necesidad de una cuidadosa optimización de la densidad de siembra celular y de los tiempos de incubación para garantizar respuestas de secreción consistentes.
