Name: Entrega de mediada por Virus adeno-asociado de CRISPR para Gene cardiaco en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprende a editar genes cardíacos in vivo en ratones usando rAAV y CRISPR para restaurar la expresión de distrofina. Este método ofrece una estrategia terapéutica prometedora para tratar la cardiomiopatía distrofica asociada a la distrofia muscular de Duchenne.

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Los animales utilizados en el presente Protocolo se mantuvieron en recursos de animales de laboratorio de estado de Ohio la Universidad conforme a las directrices de uso de animales. Todos los estudios en animales fueron autorizados por el institucional Animal cuidado, uso y Comité de revisión de la Universidad Estatal de Ohio.
1. diseño y reproducción de gRNAs en el Vector CRISPR
<ol><li>Seleccione 2 gRNAs a distrofina intrón 20 y del intrón 23 (i20 y i23) para SaCas9: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT y i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (la secuencia de PAM es subrayada y en cursiva). Nota: Los sitios de destino para el i20 y i23 son aproximadamente 23 kilo pares (kbp) lejos. Para interrumpir un gen de codificación, la secuencia de dos gRNAs a los exones comunes con el PAM NNGRRT para SaCas9 (preferiblemente NNGAAT, NNGGGT y NNGAGT) y se recomienda distancia dentro 20 kbp.</li>
	<li>Utilice los siguientes parámetros PCR a Recueza la gRNA oligos (100 μmol/L) en el 1 x de buffer de recocido (5 x recocido existencias contiene 0,5 mol/L de acetato de K, 150 mmol/L HEPES-KOH, 10 mmol/L de acetato de magnesio, pH7.4): 95 ° C 10 min, 90 ciclos de 95 a 59 ° C, con un 0,4 ° C disminuye por ciclo de 20 s, 90 ciclos de 59 a 32 ° C con una disminución de 0.3 ° C por ciclo de 20 s, 20 ciclos de 32 a 26 ° C con una disminución de 0.3 ° C por ciclo de 20 s.</li>
	<li>Ligar los oligos gRNA recocido en el pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA con BsaI y T4 ADN ligasa en una reacción (1 μl 50 ng/μl pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA 1 μl recocido oligos, 1,5 μl 10 x T4 ADN ligasa de tampón, 0,5 μl T4 ADN ligasa, 1 μl BsaI, 10 μl ddH2O ), con la condición siguiente de la reacción en un ciclador PCR: 5 ciclos de 37 ° C 5 min y 16 ° C 10 min]; 37 º C 20 min; 80 ° C 5 min.</li>
	<li>Transformar el 15 μl del producto de la ligadura en células competentes de 30 μL, placa las células en placa de agar con 100 μg/mL de ampicilina y cultura a 37 ° C durante 24 h.</li>
	<li>Recoger 5-10 colonias y cultivo en medio LB con ampicilina de 100 μg/mL a 37 ° C, 250 rpm en un Incubador agitador para 3-4 h.</li>
	<li>Las colonias por PCR de la pantalla: 10 μl 2 x master mix PCR 8 μl ddH2O cultura de e. Coli de 1 μl, 1 μl 10 μmol/L U6-adelante la cartilla, cartilla reversa del gRNA i20 o i23 1 μl. Los parámetros del ciclo de PCR: 95 ° C 5 min, 35 ciclos de 95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s.</li>
	<li>Preparar la cultura de 5 mL de los clones positivos agregando 4 mL fresco LB containing100 medio μg/mL ampicilina y cultura durante la noche a 37 ° C, 250 rpm.</li>
	<li>Purificar el plásmido DNA usando el kit de extracción de plásmidos apropiados y verificar el plásmido por Sanger secuenciación con el primer avance de U6.</li>
	<li>Cultura células C2C12 en DMEM suplementado con 10% FBS y 1% Pen-Strep hasta llegar a la confluencia de ~ 70% para el gene de la eficacia de la plásmidos de la edición de la prueba.</li>
	<li>Electroporate un total de 5 μg SaCas9/gRNA mezcla de plásmido en relación molar 1:1 en las células 1 x 106 C2C12 según protocolo del fabricante.</li>
	<li>Transfección después de 48 h, después de cosechar las células C2C12 y extraer la DNA de genomic.</li>
	<li>Uso 100 ng ADN genómico como plantilla para realizar la reacción de PCR para locus de distrofina de ratón: avance primer 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 μl de 10 μmol/L), reverse primer 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 μl de 10 μmol/L), 10 μl 2 x el verde PCR master mix, 7 μl ddH2O, (ADN genómico) 1 μl 100 ng). Uso de PCR ciclismo condiciones 95 ° c 5 min, 35 ciclos [95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s], 72 ° C 2 min.</li>
</ol>2. producción de rAAV
<ol><li>Para la cultura las células, las células de AD293 en 20 a 40 de platos de 15 cm de la semilla y mantener en DMEM suplementado con 10% FBS y 1% Pen-Strep hasta llegar a la confluencia de ~ 90% para la transfección.</li>
	<li>Diluir 3 plásmidos con 200 μL reducción medio de suero (por plato): 1) 10 μg pHelper; 2) 5 μg pXR (rh.74 u otros serotipos) y 3) un total de 5 μg de pX601-i20 y pX601-i23 mezcla (proporción 1:1). Realizar la transfección polietilenimina (PEI) mezclando con 80 μl PEI e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos agregar la mezcla a los cultivos de células AD293 en forma de gota a gota.</li>
	<li>Para la producción de AAV virus, después de transfección de 72 h post, use un raspador celular para recoger los medios de comunicación y los pellets de células AD293 por centrifugación a 1100 x g durante 10 minutos.</li>
	<li>Vuelva a suspender los pellets de células en tampón de lisis de rAAV 15 mL (50 mmol/L de Tris Base, 150 mmol/L de NaCl, pH 8,5) seguidos de 3 ciclos de congelación y descongelación con alternancia de incubación en nitrógeno líquido y un baño de agua de 42 ° C. Almacenar los lysates de la célula de-80 ° C para el procesamiento futuro si ellos no se procesan inmediatamente.</li>
	<li>Filtro de los medios de cultivo con un filtro de 0,45 μm y un 40% PEG8000 en 2,5 mol/L NaCl a una concentración final de 8%. Incubar la mezcla a 4 ° C por 1 h y centrifugar a 1100 x g durante 15 minutos.</li>
	<li>Resuspender el pellet en buffer de lisis de rAAV y combina con los lysates de la célula en el paso 2.3, seguida por el tratamiento de benzonase (50 U/mL) a 37 ° C durante 1 hora.</li>
	<li>Centrifugue el rAAV benzonase tratada que contenga mezcla 1100 x g durante 15 min a 4 ° C y guarde el sobrenadante (la preparación del crudo rAAV).</li>
</ol>3. rAAV purificación y concentración
<ol><li>Cargar la preparación rAAV crudo en un gradiente de iodixanol en un tubo de ultracentrífuga en el siguiente orden desde arriba hacia abajo: crudo AAV lisado (~ 15 mL), 8 mL 15% Iodixanol, 6 mL 25% Iodixanol, 5 mL 40% Iodixanol, 5 mL 58% Iodixanol. Llenar el restante volumen vacío del tubo a la parte superior utilizando 1 x DPBS.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 230.000 x g en un rotor de ultracentrífuga durante 120 min a 10 º C y recolectar 3-4 mL de la fracción de gradiente de 40% que contiene las partículas de rAAV con una aguja de 18 G.</li>
	<li>Diluir las partículas rAAV con 1 x DPBS y centrifugar utilizando la unidad de filtración centrífugas (MWCO 100 kDa). Repita este paso para el 3 - 5 veces y finalmente la preparación de rAAV a 300-500 μl.</li>
</ol>4. rAAV Titering
<ol><li>Extraer el ADN genómico de 2 μl concentrado rAAV, precipitado con 3 NaOAc M en etanol y resuspender en 20 μl ddH2O.</li>
	<li>Obtener la curva estándar para cuantificación de rAAV por dilución seriada del plásmido pX601: 1 x 109, 1 x 108,1 x 107, 1 x 106, 1 x 105 copias en cada 10 μl ddH2O. diluir el rAAV tratados con ADNasa muestras 1:10, 1:50, 1: 100 y 1: 1000.</li>
	<li>Determinar titulación rAAV por PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) utilizando qPCR Kit según instrucciones del fabricante en un sistema de PCR en tiempo real: 1 μl de 10 μmol/L de cada primer (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC y 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 μl de 2 x master mix PCR, 1 μl diluidas muestras de rAAV y 2 μl ddH2O. ejecutan la reacción con los siguientes parámetros ciclismo: 95 ° C 3 min, 45 ciclos de 95 ° C 5 seg y 61 ° C 20 seg].</li>
</ol>5. vía intravenosa y la inyección Intraperitoneal de rAAVrh.74-CRISPR en Neonatal mdx/utrophin+- ratones
<ol><li>Inmovilizar los mdx/utrophin+- cachorros ratón (día 3) colocando en hielo durante 1 minuto y luego administrar con 1 x 1012 partículas virales en 50 μL por ratón sistémicamente a través de un enfoque de retro-orbital o una inyección intraperitoneal.</li>
	<li>Permitir que los ratones recuperar y poner en sus jaulas hogar. A las diez semanas después de la administración de rAAV, eutanasia los ratones por exposición a CO2 para la recolección de tejido.</li>
	<li>Snap-congelar tejidos para extracción de DNA y RNA genómico y uso isopentano en nitrógeno líquido para congelar tejidos con temperatura óptima de corte para cryosectioning de refrigeración.</li>
</ol>6. análisis del Gene de la blanco edición los resultados
<ol><li>
Análisis de PCR de ADN genómico
	<ol>
<li>Aislar el total de ADN genómico de los tejidos del corazón de ratones mdx/utrophin+- tratado con o sin rAAV.</li>
		<li>Utilizar el mismo protocolo en paso 1.12 para análisis de PCR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análisis de RT-PCR de la expresión de distrofina
	<ol>
<li>Extracto de RNA total de los tejidos del corazón con el kit de extracción de RNA siguiendo el manual del fabricante.</li>
		<li>Para reversa de la transcripción, tratamiento previo del RNA total con un libre de Rnasa DNasa y 5 μg de RNA tratado como plantilla para síntesis de cDNA de primera línea con el kit de transcripción inversa.</li>
		<li>Utilizar el producto de la transcripción reversa para análisis de RT-PCR de la expresión de distrofina con los iniciadores de ADNc de distrofina: GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT 5' y 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estimar el gene de la eficacia de edición por análisis de qPCR
	<ol>
<li>Estimar el gen edición eficacia por RT-PCR cuantitativa para detectar la reducción de las transcripciones que contienen 22 exón mediante el primer avance (exón 21): 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA y el cebador reverso (exón 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. Uso de Gapdh como un gen de referencia con el primer avance: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC y el cebador reverso: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.</li>
		<li>Ejecutar la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) usando qPCR Kit según instrucciones del fabricante en un sistema de PCR en tiempo real y las condiciones de reacción 2-paso: 95 ° C 3 min, 45 ciclos de 95 ° C 5 s y 61 ° C 30 seg.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inmunofluorescencia que manchaba para analizar la expresión de distrofina
	<ol>
<li>Cortar los tejidos congelados con un criostato en un espesor de 10 μm. fijar las secciones congeladas con paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 15 minutos.</li>
		<li>Lavado x 2 con PBS e incubar con solución (10% de suero de caballo) de bloqueo durante 1 hora.</li>
		<li>Incubar el anticuerpo primario anti-distrofina, a 4 ° C durante la noche.</li>
		<li>Lavar los portaobjetos con PBS 3 veces, 5 minutos y se incuba con anticuerpos fluorescentes secundarios (1: 500) a temperatura ambiente durante 1 h.</li>
		<li>Montar las diapositivas usando el medio de montaje con DAPI y proyección de imagen con un microscopio confocal invertido.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. objetivo análisis T7E1 análisis
<ol><li>Predecir los sitios potenciales de objetivo utilizando el CRISPR en línea herramientas de diseño tales como < http://crispr.mit.edu>.</li>
	<li>Amplificar las regiones genómicas que cubre la parte superior sitios de fuera de objetivo potencial 5-10 por PCR: genomic DNA 200 ng, 1 μl alta fidelidad polimerasa de la DNA, 5 μl 10 x PCR Buffer mezclar, 1,5 μl 10 μmol/L de site-specific primers hacia adelantados y hacia atrás, ajuste el volumen total de 50 μL con ddH2O.</li>
	<li>Ejecutar los productos PCR por electroforesis, extraer y purificar el ADN utilizando un kit de extracción de gel. Medir la concentración mediante espectrofotometría.</li>
	<li>Promover la formación del heterodúplex por desnaturalización y volver a recocer los amplicones purificados lentamente en el 2.1 de búfer utiliza a un ciclador PCR. Utilice las mismas condiciones de ciclismo como se detalla en el paso 1.2.</li>
	<li>Digerir los productos re-recocidos durante 30 min a 37 ° C con la enzima de T7E1 de 0,5 μl y analizar la reacción por electroforesis en gel de agarosa al 1-2%. Nota: Los amplicones también pueden ser analizadas mediante secuenciación profunda dirigida.</li>
</ol>

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<li>Pozsgai, E. R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Sarcoglycan+gene+transfer+decreases+fibrosis+and+restores+force+in+LGMD2E+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+therapy%22%5BJournal%5D)">beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice.</a> Gene therapy. 23, 57-66 (2016).</li>
<li>Chicoine, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmapheresis+eliminates+the+negative+impact+of+AAV+antibodies+on+microdystrophin+gene+expression+following+vascular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery.</a> Mol Ther. 22, 338-347 (2014).</li>
<li>Chicoine, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+delivery+of+rAAVrh74.MCK.GALGT2+to+the+gastrocnemius+muscle+of+the+rhesus+macaque+stimulates+the+expression+of+dystrophin+and+laminin+alpha2+surrogates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates.</a> Mol Ther. 22, 713-724 (2014).</li>
<li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5, 407-415 (2015).</li>
<li>Tsai, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GUIDE-seq+enables+genome-wide+profiling+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.</a> Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).</li>
</ol>

No existe ningún conflicto de intereses.

En este protocolo, detallamos todos los pasos necesarios para lograr en vivo gene cardiaco edición en ratones postnatales con entrega mediada por el rAAVrh.74 de SaCas9 y dos gRNAs. Como se señaló anteriormente, este enfoque puede utilizarse para restaurar la expresión de distrofina en ratones distróficos como se describe en nuestro trabajo27, pero también podría permitir estudios de genética reversa rápida de genes relacionados con cardiaco en ratones sin el largo proceso de la enfoque t...

El cluster regularmente otro corto palindrómico repetición (CRISPR) tecnología, representa el avance más reciente en la ingeniería del genoma y ha revolucionado la práctica actual de la genética en las células y organismos. La edición del genoma basado en CRISPR utiliza una guía única RNA (gRNA) para dirigir una endonucleasa asociada a CRISPR como proteína CRISPR 9 (Cas9) y Cpf1 con un objetivo de ADN genómico que es complementario en orden a la protospacer codificada por el gRNA con un protospacer específico motivo adyacente (PAM)1,2. El PAM varía dependiendo de la especie bacteriana del gen Cas9 o Cpf1. El más comúnmente utilizado nucleasa Cas9 derivado de Streptococcus pyogenes (SpCas9) reconoce una secuencia de PAM de NGG que en el ADN genómico, en la cadena de destino no se encuentra directamente aguas abajo de la secuencia de destino. En el sitio de destino, las proteínas Cas9 y Cpf1 generan una rotura de doble cadena (DSB), que entonces se repara vía intrínseca celular ADN mecanismos de reparación incluyendo final no homólogo a (NHEJ) y vías de reparación dirigido por homología (HDR)3, 4. En ausencia de una plantilla de ADN por recombinación homóloga, el OSD se repara sobre todo por la vía NHEJ propenso, que puede resultar en inserciones o deleciones (indels) de nucleótidos causando mutaciones del mutágeno ' frameshift ' si el OSD se crearon en la codificación región de un gen5,6. Así, el sistema CRISPR ha sido ampliamente utilizado para las mutaciones de pérdida de función en varios modelos de celulares y organismos enteros, con el fin de investigar la función de un gen. Por otra parte, el catalítico inactivo Cas9 Cpf1 transcripcionalmente se han desarrollado para y epigenéticamente modulan la expresión de genes de destino7,8.
Más recientemente, SpCas9 y SaCas9 (derivado de estafilococo áureo) han sido empaquetados en vectores de virus adeno-asociado recombinante (rAAV) para la corrección del gen postnatal en modelos animales de enfermedades humanas, en particular, Duchenne distrofia muscular (DMD)9,10,11,12,13,14,la15. DMD es una enfermedad recesiva x-ligada fatal causada por mutaciones en el gen DMD , que codifica la distrofina proteína16,17, que afecta a aproximadamente uno en 3500 nacimientos masculinos según evaluación del recién nacido18 , 19. se caracteriza por debilidad muscular progresiva y pérdida. Los pacientes DMD suelen perder la habilidad de caminar entre 10 y 12 años de edad y mueren de insuficiencia respiratoria o cardiaca a la edad de 20-30 años20. En particular, la miocardiopatía se convierte en > 90% de los pacientes DMD y representa la causa principal de muerte en pacientes DMD21,22. Aunque Deflazacort (una droga antiinflamatoria) y Eteplirsen (un exón que salta medicina para salto de exón 51) se han aprobado recientemente para DMD por alimentos y drogas (FDA)23,24, ninguno de estos tratamientos corregir el defecto genético en el nivel genomic de la DNA. El ratón mdx, que lleva una mutación de punto en el exón 23 del gene del dystrophin, ha sido ampliamente utilizado como un modelo DMD25. Además, previamente demostramos que la expresión de distrofina funcional fue restablecida por la eliminación en el marco de la DNA genomic que abarca exones 21, 22 y 23 en los músculos esqueléticos de ratones mdx con entrega de Ad-SpCas9/gRNA intramuscular9 y en los músculos del corazón de mdx/utrophin+- ratones con entrega rAAVrh.74-SaCas9/gRNA intravenosa e intraperitoneales26.
En este protocolo, describimos en detalle cada paso en la edición de postnatal gen cardiaca para restaurar distrofina en mdx/utrophin+- ratones utilizando vectores de rAAVrh.74-SaCas9/gRNA, de gRNA diseño análisis de distrofina en las secciones de músculo de corazón.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 555 cabra anti-conejo IgG Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-21428</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase Nucleasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>Bio Cabinas de seguridad</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1347</td><td>1300 Series A2 Clase II, Tipo A2</td></tr><tr><td>BsaI</td><td>New England BioLabs Inc</td><td>RO535S Células competentes</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td>200314</tr><tr><td>Placas de cultivo celular, 150 mm</td><td>Nest Scientific USA</td><td>715001</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Leica CM3050S</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MT10017CV</td><td>Corning cellgro</td></tr><tr><td>Anticuerpo contra la distrofina</td><td>Spring Bioscience</td><td>E2660</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Ion Midi Plasmdi Kits</td><td>IBI Scientific IB47111</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26-140-079</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtro, 0.45&mu; m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>166-0045</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Master Mixes</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Mini kit de plásmido de alta velocidad</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47102</td><td></td></tr><tr><td>Suero para caballos</td><td>Abcam</td><td>ab139501</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 2239 Baño de agua</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-460-11Q</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Heat Block</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal invertido</td><td>Carl Zeiss Microscopy, LLC</td><td></td><td>LSM 780</td></tr><tr><td>LightCycler 480 Instrumento</td><td>Roche</td><td>5015243001</td><td>LightCycler 480 Instrument II</td></tr><tr><td>Centrífuga de gran capacidad</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-910</td><td>Thermo Scientific Microcentrífuga Sorvall RC 6 Plus</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002445</td><td>Espectrofotómetros Sorvall Legend Micro 21R</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td>NanoDrop&trade; 2000/2000c</td></tr><tr><td>Oligos para i20-F</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>CACCgGGCGT TGAAATTCTCATTAC</td></tr><tr><td>Oligonucleótidos para i20-R</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc;</td></tr><tr><td>Oligonucleótidos para i23-F</td> Tecnologías <td></td> de <td>ADN integradas</td><td>CACCgCACCGATGAGAGGG AAAGGTC</td></tr><tr><td>Oligos para i23-R</td> Tecnologías <td></td> de <td>ADN integradas</td><td>GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc</td></tr><tr><td>Oligos</td> Tecnologías <td></td><td></td>de <td>ADN integradas</td></tr><tr><td>OptiPrep Medio de gradiente de densidad</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>31985070</tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510-1kg-F</td> Polietilenimina <td></td></tr><tr><td></td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga Quick-Seal</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>342414</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de extracción de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Radiante SYBR Verde Hi-ROX Kits de qPCR</td><td>Alkali Scientific</td><td>QS2005</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid RT Kit de transcripción inversa</td><td>Rotor Thermo Fisher Scientific</td><td>K1691</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>337922</td><td>Tipo 70Ti</td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>Nueva Inglaterra BioLabs Inc</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Bio-rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reactivo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>8043-30-1192</td><td>Optima le-80k</td></tr><tr><td>Unidad de filtro ultracentrífugo</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC510096</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Medio de montaje con DAPI</td><td>Vector Laboratories, Inc</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

entrega de mediada por virus adeno-asociado de crispr para gene cardiaco en ratones

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

Agrupado, regularmente otro, corto, palindrómico repetición (CRISPR) sistema ha facilitado enormemente ingeniería del genoma en células cultivadas y los organismos vivos de una gran variedad de especies. La tecnología CRISPR también se ha explorado como novela terapéutica para un número de enfermedades humanas. Datos de prueba de concepto son altamente alentadores ejemplificado por estudios recientes que demuestran la viabilidad y la eficacia del enfoque terapéutico basado en la edición de gene para la distrofia muscular de Duchenne (DMD) utilizando un modelo murino. En particular, intravenosa e intraperitoneal inyección de la rh.74 del serotipo del virus adeno-asociado recombinante (rAAV) (rAAVrh.74) ha permitido la entrega eficiente cardiaca de Staphylococcus aureus proteína CRISPR 9 (SaCas9) y dos Guía RNAs (gRNA) para eliminar una región genómica con un codón mutante en el exón 23 del gen Dmd de ratón. Este mismo método puede utilizarse también para noquear el gen de interés y estudiar su función cardiaca en ratones postnatales cuando el gRNA está diseñado para atacar la región codificante del gen. En este protocolo, se muestra en detalle cómo Ingeniero vector rAAVrh.74 CRISPR y cómo lograr el parto alta eficiencia cardiaca en ratones neonatales.

Debe evaluarse la eficacia de los gRNAs para inducir la supresión de la región Diana de ADN genómica en cultivos celulares antes de empaquetar a rAAV para estudios in vivo. Con este fin, los gRNAs y construcciones expresando SaCas9 eran electroporated en las células C2C12 y el ADN genómico se analizó por PCR con los cebadores que flanquean los sitios de destino (figura 1). Un producto PCR de ~ 500 bp indica eliminación exitosa de la DNA genomic de destino res...

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para llevar a cabo en vivo gene cardiaco edición en ratones usando Virus de Adeno-Associated recombinante (rAAV)-mediado entrega de CRISPR. Este protocolo ofrece una estrategia terapéutica prometedora para tratar cardiomiopatía distrófica en distrofia muscular de Duchenne y puede utilizarse para generar nocaut cardiaco específico en los ratones postnatales.

Entrega de mediada por Virus adeno-asociado de CRISPR para Gene cardiaco en ratones

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

El objetivo general de este protocolo de edición génica cardíaca in vivo es restaurar la expresión de distrofina en el corazón de ratones distróficos utilizando el virus adenoasociado recombinante rh. 74 con CRISPR SaCas9 y vectores de ARN guía. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la distrofia muscular, como si la edición genética es una estrategia terapéutica confiable para tratar la causa raíz de la miocardiopatía asociada con la distrofia muscular de Duchenne.La principal ventaja de estas técnicas es que la expresión del gen de la distrofina corregida se encuentra bajo su control regulador endógeno, y este efecto de rescate es permanente. La implicación de esta técnica se extiende hacia el tratamiento de otras enfermedades genéticas en las que la corrección de genes mutantes se puede lograr mediante la tecnología de edición de genes CRISPR Cas9. Este método no solo proporciona información sobre la restauración de la distrofina en el corazón distrófico, sino que también se puede utilizar para eliminar el gen de interés para estudios genéticos inversos.La demostración del procedimiento estará a cargo de Yandi Gao, un técnico de nuestro laboratorio. El diseño adecuado de los ARN guía, o ARNg, es fundamental para el éxito de este protocolo. Seleccione dos ARNg dirigidos al intrón 20 y al intrón 23 de distrofina para la proteína nueve asociada a CRISPR por Staphylococcus aureus.La secuencia de motivos adyacentes del protoespaciador para cada ARNg está subrayada y en cursiva. Para recocer los oligonucleótidos de ARNg, configure una reacción que contenga 100 micromoles por litro de los oligonucleótidos de ARNg en tampón de recocido 1x. Utilice los siguientes parámetros de PCR: 95 grados Celsius durante 10 minutos, 90 ciclos de 95 a 59 grados Celsius con una disminución de 0,4 grados Celsius por ciclo durante 20 segundos, 90 ciclos de 59 a 32 grados Celsius con una disminución de 0,3 grados Celsius por ciclo durante 20 segundos y 20 ciclos de 32 a 26 grados Celsius con una disminución de 0,3 grados Celsius por ciclo durante 20 segundos.A continuación, prepárese para ligar los oligonucleótidos de ARNg recocidos en el vector CRISP en una reacción. Agregue lo siguiente a un tubo: un microlitro de 50 nanogramos por vector CRISPR de microlitro, un microlitro de oligonucleótidos recocidos, 1,5 microlitros de tampón de ADN ligasa T4 10x, 0,5 microlitros de ADN ligasa T4, un microlitro de Bsal y 10 microlitros de agua destilada doble. Ejecute la siguiente reacción en un termociclador: cinco ciclos de 37 grados Celsius durante cinco minutos y 16 grados Celsius durante 10 minutos, 37 grados Celsius durante 20 minutos y 80 grados Celsius durante cinco minutos.Transforme el producto de ligadura de 15 microlitros en 30 microlitros de células competentes y coloque las células en una placa de agar que contenga 100 microgramos por mililitro de ampicilina. Cultivo a 37 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente, elija de cinco a 10 colonias de la placa de agar y cultive en medio LB que contenga 100 microgramos por mililitro de ampicilina a 37 grados Celsius y 250 rpm durante tres o cuatro horas.Para examinar las colonias por PCR, prepare reacciones que contengan cada una 10 microlitros de mezcla maestra de PCR, ocho microlitros de agua destilada doble, un microlitro de cultivo de E. coli, un microlitro de cebador directo U6 y un microlitro de cebador inverso de ARNg i20 o i23. Utilice los siguientes parámetros de ciclo de PCR: 95 grados Celsius durante cinco minutos, seguido de 35 ciclos de 95 grados Celsius durante 30 segundos, 61 grados Celsius durante 30 segundos y 72 grados Celsius durante 30 segundos. Una vez que se hayan identificado los clones positivos, prepare un cultivo de cinco mililitros de cada clon positivo agregando cuatro mililitros de medio LB fresco que contenga 100 microgramos por mililitro de ampicilina y cultive a 37 grados Celsius y 250 rpm durante la noche.Al día siguiente, purifique el ADN del plásmido utilizando el kit de extracción de plásmidos adecuado. Posteriormente, el plásmido se verifica mediante secuenciación de Sanger con el cebador U6-forward. Para probar la eficacia de la edición génica de los plásmidos, se cultivaron células C2C12 en DMEM suplementadas con 10% de FBS y 1% de Pen-Strep hasta que las células alcanzaran aproximadamente el 70% de confluencia.Electroporar un total de cinco microgramos de mezcla de plásmidos SaCas9/gRNA en una proporción molar de uno a uno en células C2C12 de acuerdo con el protocolo del fabricante. 48 horas después de la transfección, recoja las células C2C12 y extraiga el ADN genómico como se describe en el protocolo de texto. Utilice el ADN genómico como molde para realizar la PCR para el locus de distrofina del ratón.Configure reacciones que contengan el cebador directo, el cebador inverso, la mezcla maestra de PCR verde, agua doblemente destilada y 100 nanogramos de ADN genómico. Utilice las mismas condiciones de PCR que para el cribado de clones positivos. Antes de comenzar este procedimiento, prepare el virus adenoasociado recombinante, o rAAV, como se describe en el protocolo de texto.Administrar a las crías de ratón mdx del tercer día con partículas virales de forma sistémica a través de una inyección intraperitoneal. Permita que los ratones se recuperen y colóquelos de nuevo en sus jaulas domésticas. A las 10 semanas después de la administración de rAAV, recoja tejidos de los ratones.Congele los tejidos para la extracción genómica de ADN y ARN, y utilice isopentano enfriado en nitrógeno líquido para congelar tejidos con un compuesto de temperatura de corte óptima para la crisección. Comience el protocolo de tinción con inmunofluorescencia fijando las secciones de tejido congelado con paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de 15 minutos, lave las secciones de tejido dos veces con PBS.Incubar con solución de bloqueo a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, incube con el anticuerpo primario antidistrofina a cuatro grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, lave los portaobjetos con PBS y luego incube con anticuerpos secundarios fluorescentes a temperatura ambiente durante una hora.Monte los portaobjetos utilizando un medio de montaje con DAPI y obtenga imágenes con un microscopio confocal invertido. Se evaluó mediante PCR la eficacia de los ARNg para inducir la deleción de la región de ADN genómico diana en cultivos celulares. Un producto de PCR de aproximadamente 500 pares de bases indica la eliminación exitosa del ADN genómico objetivo como resultado de la edición de genes, mientras que las células de control no deberían producir una banda.Una vez que se ha confirmado la eficacia de los ARNg en cultivos celulares, los ARNg se empaquetan en rAAV. Las partículas virales rAAV se purifican y la pureza se analiza mediante SDS-PAGE. La presencia de solo tres bandas correspondientes a las tres proteínas de la cápside indica una alta pureza.Estas imágenes representativas de inmunofluorescencia de secciones cardíacas de ratones de tipo salvaje, mdx y mdx tratados con ARNg AAV SaCas9 muestran sistémicamente que el ARNg AAV SaCas9 restaura la expresión de distrofina en ratones distróficos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo lograr ediciones de genes cardíacos in vivo en ratones postnatales utilizando rAAV rh. Entrega mediada por 74 SaCas9 y ARNg.

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En este video, demostramos la entrega de genes basados en virus adenoasociados recombinantes en la cría de ratón. Este método ayuda a estudiar la expresión génica en las células objetivo.

Entrega de genes basada en virus adenoasociados recombinantes: una técnica para la administración de transgenes y la expresión específica del corazón en modelos de roedores

El sistema / Cas9 CRISPR ofrece el potencial para que la edición del genoma específico accesible y asequible para la comunidad científica. Este protocolo está destinado a demostrar cómo crear virus que Knockout un gen de interés utilizando el sistema / Cas9 CRISPR y, a continuación, inyectarlos estereotáxica en el cerebro del ratón adulto.

Proyectos, Embalaje y Entrega de alto título de CRISPR Retro y lentivirus vía estereotáxica Inyección

En este manuscrito, se describe un método para preparar vectores recombinantes del virus adenoasociado 9 (rAAV9) para manipular la expresión génica en el corazón del ratón.

Preparación de rAAV9 que sobreexpresan o una caída en los genes de ratón Corazones

El cluster regularmente otro proteínas cortas repeticiones palindrómico/CRISPR asociado 9 (CRISPR/Cas9) sistema proporciona una herramienta prometedora para la ingeniería genética y abre la posibilidad de integración dirigida de los transgenes. Describimos una mediada por homología se terminan uniendo (HMEJ)-estrategia por turnos para ADN eficiente objetivo integración en vivo y dirigida terapias genéticas usando CRISPR/Cas9.

Integración dirigida CRISPR/Cas9-mediada In Vivo mediante una estrategia basada en unirse a final mediada por homología

Aquí presentamos un protocolo para la manipulación de genes específicos cardiacos en ratones. Bajo anestesia, los corazones de ratón fueron externalizados a través del cuarto espacio intercostal. Posteriormente, adenovirus codificación genes específicos fueron inyectados con una jeringa en el miocardio, seguido por la medida de expresión de la proteína vía proyección de imagen en vivo y Western blot análisis.

Un método sencillo y eficaz para la manipulación In Vivo de Gene cardiaco específico por inyección intramiocárdica en ratones

Se describen protocolos para la edición del genoma altamente eficiente de células madre hematopoyéticas murinas (HSPC) por el sistema CRISPR/Cas9 para desarrollar rápidamente sistemas de modelos de ratón con modificaciones genéticas específicas del sistema hematopoyético.

Edición del genoma mediado por CRISPR/Cas9 para el estudio de células hematopoyéticas en modelos de enfermedades

El desarrollo de modelos murinos con genes específicos mutados en pacientes con cáncer de cabeza y cuello es necesario para comprender la neoplasia. Aquí, presentamos un protocolo para la transformación in vitro de células de la lengua murina primaria utilizando un sistema adeno-asociado virus-Cas9 para generar líneas celulares HNC murinas con alteraciones genómicas específicas.

In Vitro Establecimiento de una línea celular de cáncer de cabeza y cuello de murine genéticamente diseñada utilizando un sistema de virus Cas9 asociado con Adeno

En este protocolo, describimos los procedimientos técnicos para generar ratones knockout específicos para tejido adiposo marrón (BAT) aprovechando un sistema combinado de ARN de guía única (sgRNA) de Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y virus adenoasociado (AAV). Los pasos descritos incluyen el diseño de los sgRNAs, la preparación de las partículas AAV-sgRNA y la microinyección de AAV en los lóbulos BAT.

Generación de ratones knockout específicos de grasa marrón utilizando un sistema combinado de ARN de guía única Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y virus adenoasociado

Este protocolo presenta un enfoque optimizado para la producción de modelos de ratas modificadas genéticamente. El virus adenoasociado (AAV) se utiliza para administrar una plantilla de reparación de ADN, y la electroporación se utiliza para administrar reactivos CRISPR-Cas9 para completar el proceso de edición del genoma en un embrión de 2 células.

Edición del genoma CRISPR-Cas9 de embriones de rata mediante virus adenoasociados (AAV) y electroporación de embriones de 2 células

Este informe detalla el método de inyección localizada de vectores AAV a través de la pelvis renal para una transferencia de genes efectiva y segura al riñón del ratón.

Entrega efectiva y segura de genes al riñón de ratón mediante inyección lenta retrógrada en la pelvis renal de vectores de virus adenoasociados

Aprende a editar genes cardíacos in vivo en ratones usando rAAV y CRISPR para restaurar la expresión de distrofina. Este método ofrece una estrategia terapéutica prometedora para tratar la cardiomiopatía distrofica asociada a la distrofia muscular de Duchenne.

Entrega de mediada por Virus adeno-asociado de CRISPR para Gene cardiaco en ratones

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