Name: Análisis de Micro-CT cuantitativa de Aortopathy en un modelo murino de disección y aneurisma de la aorta inducida por β-oxidasa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Aprende a cuantificar el diámetro aórtico en modelos murinos de aneurisma mediante micro-CT con perfusión de silicona radiopaca. Esta técnica permite obtener imágenes detalladas de vasos grandes y pequeños para estudios de biología vascular.

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Nos gustaría agradecer a Mark Smith por su ayuda con la proyección de imagen radiográfica. Este trabajo es apoyado por la concesión de T32 de NIH para la investigación interdisciplinaria en la enfermedad Cardiovascular (BOA), la Asociación Americana de corazón (SMC) y la subvención NIH del R35 (DKS).

Los protocolos para el manejo de animales fueron aprobados por el cuidado institucional de Animal y uso de la Universidad de Maryland, Baltimore (número de protocolo animal 0116024) y realizados según los estándares de AAALAC International.
1. preparación de reactivos
<ol><li>
Heparina
	<ol>
<li>Diluya 250 μl de 1000 sulfato de heparina U/mL en 50 mL de fosfato tampón salino para una concentración final de 5 U/mL.</li>
		<li>Caliente la heparinizada (5 U/mL) fosfato tampón salino, que sustituirá a la sangre en la vasculatura en un baño de agua a 37 ° C.</li>
		<li>Preparar la bomba mediante la conexión de la tubería necesaria y vacío de 2 jeringas de 10 mL, 1 para el buffer salina heparinizada y 1 para el agente de contraste.</li>
		<li>Llenar el tubo con el cálido heparinizada tamponada de fosfato salino y eliminar las burbujas de aire en el tubo de la bomba de presión.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Agente de contraste Nota: Consulte la Tabla de materiales para los componentes de kit de agente de contraste.<ol>
<li>Mezclar un compuesto pigmentado con un diluyente para conseguir un tinte 1:6 al cociente de diluyente.</li>
		<li>Inmediatamente antes de su uso (paso 2.3.12), añadir 200 μL de un agente endurecedor para cada alícuota de 5 mL del compuesto pigmentado diluido y mezclar bien (4% en volumen). Nota: El fabricante informó que el tiempo de trabajo es de 40 minutos. El agente de contraste de caucho de silicona comienza a polimerizar 20 minutos después de la adición del agente de curado, es importante preparar la solución inmediatamente antes de su infusión.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Agua potable BAPN
	<ol>
<li>Β-oxidasa (BAPN) se disuelven en el agua potable para crear una concentración final de 3 g/L (adaptado de protocolos previamente descritos en la literatura)9,16,17.</li>
		<li>Administrar el agua potable que contiene BAPN a un grupo de ratones, una vez que son 4 semanas de edad hasta el momento de la perfusión para micro-CT.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. quirúrgico
<ol><li>
Preparación de animales
	<ol>
<li>Destetar a los ratones a las 3 semanas de edad, mantener un ciclo oscuro h 12 h luz/12 y alimentarlos chow roedor estándar. Para el grupo tratado con BAPN, administrar el agua potable BAPN recién preparado para 16-26 semanas ad libitum. Proporcionan que los animales de control con consumo estándar de agua ad libitum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Técnica anestésica Nota: se realiza 24 horas antes el análisis de CT, el siguiente procedimiento. Procedimientos quirúrgicos son promulgados para preparar a la muestra para una perfusión intracardiaca post mortem.<ol>
<li>Inducir una anestesia a través de un tanque de inducción con 100% O2 y 3% isoflurano suministra a través de un vaporizador de precisión. Después de la inducción de la anestesia, deje el isoflurano y limpie la cámara con O2. Mantener la anestesia con isoflurano % 2-2.5 y 1 L/min de O2 a través de un cono de nariz.</li>
		<li>Conecte la cámara de inducción y la máscara a un tesoro carbón para adsorción de gases residuales para proteger al personal. Para asegurar un adecuado plano anestésico, demostrando que no hay ninguna respuesta a los estímulos nocivos (pellizco del dedo del pie).</li>
		<li>Preparar un campo operatorio que consiste en una bandeja quirúrgica y el instrumental quirúrgico necesario.</li>
		<li>Transferir el animal al campo quirúrgico y posición de recumbency dorsal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Técnica operativa
	<ol>
<li>Con unas tijeras, hacer una incisión de línea media a través de la piel y tejidos blandos de a medio camino entre la sínfisis púbica a la escotadura esternal, extendiéndose a través de la piel y tejidos blandos que cubren el esternón.</li>
		<li>Usando las tijeras, crear un orificio en el diafragma en el proceso del xiphoid para entrar en la cavidad torácica.</li>
		<li>Utilice tijeras para diseccionar la membrana de la pared ventral del tórax, bilateral.</li>
		<li>Corte a través de los cartílagos costales para separar las costillas el esternón en el borde derecho esternal.</li>
		<li>Se aplica una pinza hemostática fina en la punta del esternón (cerca del proceso xifoides) y mover la pinza cranially por lo que se coloca sobre la cabeza del ratón. Esto retraerá el timo y el esternón lejos del corazón, exponiendo el corazón y grandes recipientes para la manipulación de otros.</li>
		<li>Disecan agudamente cualquier accesorio entre el corazón y la pared torácica.</li>
		<li>Conecte la aguja de calibre 27 IV catéter a una jeringa pre cargada con 10 mL de solución salina heparinizada tamponada de fosfato (5 U/mL) y completar todos los tubos con el tampón para eliminar las burbujas de aire de los tubos de la bomba de presión.</li>
		<li>Tenga cuidado mientras se prepara el líquido de burbujas en la línea de líquido puede impedir el llenado de recipientes más pequeños. Limitar el número de vasos que están dañados durante la preparación del animal, ya que el agente de contraste para escaparse de los vasos de cortado, cambiar el volumen requerido para un llenado completo y la introducción de artefactos en la imagen final.</li>
		<li>Punción del ventrículo izquierdo con una aguja de calibre 27 que se estabiliza con una abrazadera de ángulo recto. Inmediatamente haga una incisión en el ventrículo derecho o vena cava inferior para drenar la solución de heparina y sangre. Nota: Se utiliza heparina como anticoagulante para evitar que la sangre de la coagulación en los vasos después de la muerte del animal.</li>
		<li>Inundar el animal a una velocidad constante de 2 mL por minuto, usando una sola bomba. Observe la palidez visible de los órganos. Continuar la perfusión hasta que la solución de drenaje de la circulación venosa de la sangre (aproximadamente 5-6 mL). Parar la bomba.</li>
		<li>Desconecte el tubo del catéter IV de la jeringa de 10 mL, cuidando de no para alterar la posición de la aguja en el ventrículo izquierdo.</li>
		<li>Inmediatamente después de la completa exsanguinación, separar la solución de agente de contraste en alícuotas de 5 mL y agregue el agente endurecedor en este momento (vea el paso 1.2). Mézclelos bien. Elaboración de 5 mL de la mezcla del agente de contraste en una jeringa de 10 mL y perfusión el animal con él.</li>
		<li>Para un llenado completo de los vasos (arterias y venas), continuar la infusión más allá del punto cuando se ve salir la solución venosa. Buscar signos de una perfusión exitosa incluyendo la visualización de un agente de casting en las arterias coronarias, arterias pulmonares, del intestino y vasculatura hepática.</li>
		<li>El agente de contraste se cura después de aproximadamente 20 minutos a temperatura ambiente. Curado, cosecha los órganos individuales, según sea necesario y fijar en 10% formalina tamponada neutra. Fijar canales todo si las muestras no se utilizan para el día siguiente la exploración micro-CT. Si las canales va a utilizar el día siguiente, colocar en una bandeja de metal y coloque en el refrigerador a 4 ° C para curar durante la noche.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. micro-exploración del CT y los parámetros
Nota: Los parámetros de adquisición de imagen específica dependerá la máquina en uso.
<ol><li>Adquirir imágenes de la tomografía computada de la radiografía de cada ratón el día siguiente la perfusión utilizando un tomógrafo micro con una tensión de tubo de rayos x de 55 kVp, una corriente de 150 mA, un factor de ampliación del sistema de 2.19 y CCD cámara pixel binning factor de 2. Esto produce un tamaño de píxeles efectivos de 29 μm.<ol>
<li>Coloque la carcasa del ratón supina sobre la mesa micro-CT escáner y obtener a un scout scan de rayos x.</li>
		<li>El detector de campo de visión de 57,4 mm (axial) x 37,1 mm (transaxial) se centran en el torso a la imagen de toda la longitud de la aorta.</li>
		<li>Adquirir 180 proyecciones de imagen con un incremento de rotación de 2 grados y tiempo por proyección de 2800 ms.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reconstruir las imágenes usando un algoritmo modificado de Feldkamp; el tamaño del voxel reconstruido es de 29 x 29 x 29 μm3 (espesor de la rebanada = 29 μm) usando la visualización 3D Multimodal plug-in para el software utilizado aquí.</li>
</ol>4. post procesamiento y representación
<ol><li>Convertir los datos del CT en un formato DICOM usando el software apropiado.</li>
	<li>Analizar las imágenes para identificar si un aneurisma estaba presente. Mida el diámetro del eje menor en el punto más ancho del arco aórtico, aorta torácica, descendente y aorta abdominal como describió anteriormente18 (figura 1). Nota: En nuestro estudio, imágenes fueron analizadas por dos observadores independientes (uno ciego) utilizando un visor DICOM para identificar si un aneurisma estaba presente. Se midió el diámetro del eje menor en el punto más ancho del arco aórtico, descendente aorta torácica y aorta abdominal como se describió anteriormente19 (figura 1). Significa no aneurismática segmentos arteriales de los ratones no tratados BAPN establecieron diámetros de vaso normal como los valores de edad comparable del control.</li>
	<li>Los aneurismas se definen como una dilatación localizada o difusa de los segmentos aórticos para diámetros mayores al 50% del diámetro de referencia. Localizar estos basados en las mediciones anteriores.</li>
</ol>

<ol><li>Meszaros, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+clinicopathology+of+aortic+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22CHEST%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and clinicopathology of aortic dissection.</a> CHEST. 117 (5), 1271-1278 (2000).</li>
<li>Kochanek, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deaths%3A+final+data+for+2009%5BTitle%5D)+AND+%22National+Vital+Statistics+Reports%22%5BJournal%5D)">Deaths: final data for 2009.</a> National Vital Statistics Reports. 60 (3), 1-116 (2011).</li>
<li>Li, J. S., Li, H. Y., Wang, L., Zhang, L., Jing, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+beta-aminopropionitrile-induced+aortic+dissection+model+in+rats+by+different+administration+and+dosage%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular%22%5BJournal%5D)">Comparison of beta-aminopropionitrile-induced aortic dissection model in rats by different administration and dosage.</a> Vascular. 21 (5), 287-292 (2013).</li>
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<li>Kanematsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologically-induced+thoracic+and+abdominal+aortic+aneurysms+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Pharmacologically-induced thoracic and abdominal aortic aneurysms in mice.</a> Hypertension. 55 (5), 1267-1274 (2010).</li>
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<li>Kurihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+matrix+metalloproteinase+9+triggers+acute+aortic+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived matrix metalloproteinase 9 triggers acute aortic dissection.</a> Circulation. 126 (25), 3070-3080 (2012).</li>
<li>Dillavou, E. D., Buck, D. G., Muluk, S. C., Makaroun, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+versus+three-dimensional+CT+scan+for+aortic+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endovascular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional versus three-dimensional CT scan for aortic measurement.</a> Journal of Endovascular Therapy. 10 (3), 531-538 (2003).</li>
<li>Muratoglu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRP1+protects+the+vasculature+by+regulating+levels+of+connective+tissue+growth+factor+and+HtrA1%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">LRP1 protects the vasculature by regulating levels of connective tissue growth factor and HtrA1.</a> Arterioclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33, 2137-2146 (2013).</li>
<li>Badea, C. T., Dragova, M., Holdsworth, D. W., Johnson, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+small+animal+imaging+using+micro-CT+and+digital+subtraction+angiography%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo small animal imaging using micro-CT and digital subtraction angiography.</a> Phys Med Biol. 53 (19), R319-R350 (2008).</li>
<li>Zhou, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-guided+left-ventricular+catheterization%3A+A+novel+method+of+whole+mouse+perfusion+for+microimaging%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-guided left-ventricular catheterization: A novel method of whole mouse perfusion for microimaging.</a> Laboratory Investigation. 84, 385-389 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Micro-CT en la proyección de imagen puede utilizarse para proporcionar reconstrucciones altamente detalladas y tridimensionales de la patología vascular en modelos animales. Mediante el uso de medios de contraste intravasculares, no mejora los tejidos blandos, como el lumen de un vaso sanguíneo, se pueden distinguir de aquellos que están mejorando. Láser Doppler, microangiography, angiografía por resonancia magnética, histología con microscopia confocal y dos fotones puede utilizarse para evaluar vasculares camas, suelen...

La incidencia de la disección aórtica es de 3 casos por 100.000 por año1. Disección aórtica y aneurisma enfermedades representan más de 10.000 muertes en los Estados Unidos cada año, 1-2% de todas las muertes en los países occidentales2. La disección aórtica se inicia por un desgarro en la capa íntima del vaso con la propagación de la sangre a través de las capas de la pared aórtica en presiones fisiológicas. Presión de pulso elevada de pacientes está asociados con una mayor incidencia de disección y complicaciones. Esfuerzo cortante de pared creciente se asocia con la expansión de la pared aórtica a un aneurysm formación3,4. Las consecuencias de la disección aórtica incluyen la obstrucción del flujo de sangre a órganos distantes como el cerebro, riñones, intestinos y extremidades, la formación de aneurismas crónica, ruptura o muerte5,6,7.
En la actualidad, los procesos bioquímicos y celulares implicados en la iniciación y progresión de los aneurismas aórticos y disecciones son todavía poco conocidos. Modelos animales reproducibles de aneurisma aórtico y disección son clave para comprender su fisiopatología. Β-oxidasa (BAPN) es un inhibidor de oxidasa lisil, que evita que el cross-linking de colágeno y elastina y se ha demostrado para alterar significativamente la estructura de la matriz extracelular de la pared de recipiente y su integridad biomecánica6, 8. Roedores tratados con BAPN se han utilizado como modelo animal común de aneurisma aórtico y disección9,10.
Modalidades de imágenes vasculares son instrumentales en la identificación de patología vascular, confirmar la permeabilidad del vaso y evaluar la perfusión de órganos. Recientemente, la tomografía micro computada (micro-CT) se ha utilizado para el estudio de la vasculatura de ratones y animales de tamaño. A diferencia del hueso, la proyección de imagen axial de los vasos sanguíneos por la tomografía computada es limitada, ya que sangre intraluminal es inherentemente relativamente radiolúcido. Cuando se combina con agentes de contraste intravascular, sin embargo, micro-CT permite reconstrucciones tridimensionales detalladas de vasculatures animal para el estudio de patología vascular anatómica macro11.
El agente de contraste seleccionados (véase la Tabla de materiales) es un caucho de silicón radiopaco que contiene cromato de plomo y sulfato de plomo. En perfusión en presencia de un catalizador, rápidamente se endurece para formar un elenco de la vasculatura con mínimas alteraciones en la arquitectura macro anatómicas de los vasos, hacer la vasculatura altamente radiopaco en contraste con los tejidos de fondo cuando examen radiográfico. Este agente del contraste es ventajoso porque es fácil de manejar y evita la degradación del tejido y pérdida de la nave debido a la fractura a menudo asociado con la corrosión del molde vascular. Como cura con la contracción mínima12, vasos despejados sangre quedan patentes y permiten una evaluación precisa de la macro-vasculatura animal en experimentos de supervivencia no. Trabajo previo ha utilizado goma de silicón radiopaco-contraste en una variedad de estudios en animales. Específicamente, se ha demostrado la aplicabilidad en visualizar las coronarias, glomerular, placenta y las circulaciones cerebral11,12,13,14,15 . En este artículo, detallaremos la metodología de punción ventricular izquierda abierta para la perfusión intravascular del caucho de silicón radiopaco con base de plomo para caracterizar cuantitativamente patología aórtica BAPN-inducida en un modelo de ratón por el micro-CT.

<table><tbody><tr><td>Microfil</td><td>Flow Tech, Inc</td><td>MV-122</td><td>Utilizamos amarillo, se puede pedir un color diferente según se desee. El kit incluye compuesto MV, diluyente MV y agente de curado MV.</td></tr><tr><td>Heparina (1000 U/mL)</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>25021-400-10</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Vet One, MWI</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>3-Sal de fumarato de aminopropionitrilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3134</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa única</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-831-200</td><td></td></tr><tr><td>calibre 27 aguja para juego de venas del cuero cabelludo</td><td>Exel Int</td><td>26709</td><td>tubo de 27G x 3/4", 12"</td></tr><tr><td>Escáner Inveon Micro-CT</td><td>Siemens Medical Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osirix MD</td><td>Pimxmeo SARL</td><td></td><td>Versión 8.0.2</td></tr><tr><td>Inveon Research Workplace</td><td>Siemens Medical Solutions</td><td></td><td>Versión 4.2</td></tr><tr><td>Roedor Chow</td><td>Harlan Teklad</td><td>2018sx</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de micro-ct cuantitativa de aortopathy en un modelo murino de disección y aneurisma de la aorta inducida por β-oxidasa

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of &#946;-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Disección y aneurisma de aorta se asocia con una morbilidad significativa y mortalidad en la población y puede ser altamente letales. Si bien existen modelos animales de enfermedad aórtica, en vivo las imágenes de la vasculatura ha sido limitada. En los últimos años, micro-automatizado tomografía (micro-CT) se ha convertido en una modalidad preferida para grandes y pequeños vasos de la proyección de imagen en vivo y ex vivo. Junto con un método de riego vascular, hemos utilizado con éxito micro-CT para caracterizar la frecuencia y la distribución de la patología aórtica en ratones C57/Bl6 tratados con β-oxidasa. Limitaciones técnicas de este método incluyen variaciones en la calidad de la perfusión por mala preparación de animales, la aplicación de metodologías adecuadas para la cuantificación del tamaño de buque y la no supervivencia de este procedimiento. Este artículo detalla una metodología para la perfusión intravascular de un caucho de silicón radiopaco con base de plomo para la caracterización cuantitativa de aortopathy en un modelo murino de aneurisma y disección. Además de visualizar patología aórtica, este método puede utilizarse para examinar otras camas vasculares en vivo o vascular camas quitar post mortem.

Para evaluar este protocolo, 20 ratones adultos machos, del fondo mixto como se describió anteriormente19 y de 20-30 semanas de edad, con o sin tratamiento BAPN, fueron perfundidos con un caucho de silicón radiopaco con base de plomo (véase el tabla de materiales ) utilizando el protocolo detallado arriba. Experimentaron la exploración micro-CT en el día siguiente (figura 1 y figu...

Este artículo describe una metodología detallada del uso de un caucho de silicón radiopaco con base de plomo para inundar la vasculatura murina para la cuantificación del diámetro aórtico en un modelo murino de aneurisma aórtico y disección.

Análisis de Micro-CT cuantitativa de Aortopathy en un modelo murino de disección y aneurisma de la aorta inducida por β-oxidasa

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of ...

Este método podría ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología vascular, como determinar cómo se ve afectado el tamaño de los vasos en diferentes modelos animales de enfermedad vascular. La principal ventaja de esta técnica es que la micro-TC permite obtener imágenes detalladas de vasos grandes y pequeños, tanto in vivo como ex vivo, que se pueden cuantificar con precisión. 24 horas antes del análisis de la TC, realizar los procedimientos quirúrgicos para preparar la muestra para una profusión intracardíaca postmortem.Para la anestesia, use isoflurano al 3% y asegúrese de tener un eliminador de carbón a mano. Luego, mantenga la anestesia con dos a 2.5 por ciento de isoflurano de una mascarilla, también conectada a un carroñero con un litro de oxígeno por minuto. Antes de comenzar la cirugía, realice un pellizco en el dedo del pie para verificar la ausencia de un reflejo pedal.Luego, establezca un campo operativo con instrumentos y así sucesivamente. A continuación, coloque al animal en decúbito dorsal y asegure las extremidades. Ahora, con unas tijeras, haga una incisión en la línea media a través de la piel y el tejido blando sobre el esternón entre la sínfisis púbica y la escotadura esternal.A continuación, utilice las tijeras para crear un agujero en el diafragma en la apófisis xifoides para entrar en la cavidad torácica. Luego, continúe usando las tijeras para diseccionar el diafragma de la pared torácica ventral bilateralmente. Corte a través de los cartílagos costales para separar las costillas del esternón en el borde esternal derecho.Ahora, aplique una pinza hemostática fina en la punta del esternón cerca de la apófisis xifoides y mueva el hemostático cranealmente para que quede colocado sobre la cabeza del ratón. Luego, disecciona bruscamente cualquier inserción entre el corazón y la pared torácica. Limite el número de vasos dañados durante la preparación del animal, ya que esto hará que el agente de contraste se escape de los vasos cortados, lo que cambiará el volumen requerido para un llenado completo e introducirá artefactos en la imagen final.Ahora, conecte una aguja de catéter intravenoso de calibre 27 a una jeringa precargada con 10 mililitros de PBS heparinizado y llene todos los tubos con el tampón, eliminando todas las burbujas de aire. La eliminación de todas las burbujas de las líneas es esencial. Luego, incida inmediatamente el ventrículo derecho, o la vena cava inferior, para drenar la solución de heparina y la sangre.Para continuar, use la cánula para perforar el ventrículo izquierdo, estabilizado por la pinza. Conduzca la profusión a una velocidad constante de dos mililitros por minuto utilizando una bomba de jeringa. Debe haber un blanqueamiento visible de los órganos.En unos minutos, la circulación de la vena debería estar libre de sangre. Luego, detenga la bomba y desconecte el tubo del catéter de la jeringa, pero no mueva la aguja del catéter. Ahora, separe la solución de agente de contraste en alícuotas de cinco mililitros, agregue el agente de curado y mezcle bien.Luego, cargue cinco mililitros de la mezcla en una jeringa de 10 mililitros y profundice el animal con el agente de contraste a una velocidad constante de dos mililitros por minuto. Mantenga la infusión más allá del punto en que se vea que el agente de fundición sale del animal. El agente de contraste se curará en 20 minutos.Una vez curados, recoja los órganos de interés y fíjelos en formalina tamponada neutra al 10%. A continuación, si las muestras no se utilizan para la exploración micro-CT, fije toda la carcasa. De lo contrario, coloque la carcasa en una bandeja de metal y colóquela en un refrigerador a cuatro grados centígrados para que se cure durante la noche.Al día siguiente, adquiera imágenes de tomografía computarizada de rayos X de cada ratón utilizando un escáner de micro-CT. Configure los parámetros del escáner de la siguiente manera; Un voltaje máximo de tubo de rayos X de 55 kilovoltios, una corriente de 150 microamperios, un factor de aumento del sistema de 2,19 y un factor de agrupación de píxeles de cámara CCD de dos. Este factor de agrupación producirá un tamaño de píxel efectivo de 29 micras.A continuación, analice las imágenes para identificar los aneurismas mediante un enfoque estandarizado. Mida el diámetro del eje menor en el punto más ancho de tres ubicaciones; del arco aórtico, de la aorta torácica descendente y de la aorta abdominal. Lo ideal es que dos observadores, uno de los cuales esté ciego, analicen cada imagen.Con las mediciones, identifique los aneurismas como dilataciones localizadas o difusas de los segmentos aórticos a diámetros superiores al 50% del diámetro de referencia. Se analizaron 20 ratones adultos machos de origen mixto y de 20 a 30 semanas de edad con o sin tratamiento con BAPN. Cada uno fue profundido con un caucho de silicona radiopaco a base de plomo.El diámetro medio de la aorta ascendente en los ratones tratados con BAPN fue significativamente mayor que el de los controles de la misma edad no tratados. Los puntos de datos de los ratones que se determinó que tenían aneurismas están en rojo. Por el contrario, la inhibición de la lisil oxidasa con BAPN no tuvo un efecto significativo sobre el tórax medio descendente, ni este tratamiento afectó a los diámetros aórticos abdominales.Un aneurisma se definió como 1,5 veces el diámetro medio del grupo no tratado. El tratamiento conduce a un aumento significativo de los aneurismas según esta definición. Los aneurismas en los ratones tratados con BAPN se identificaron exclusivamente en la aorta, y la mayoría se identificaron en la aorta torácica.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo profusar la vasculatura para la obtención de imágenes radiográficas. Una vez dominado, la profusión y el análisis de la imagen se pueden realizar en dos horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los protocolos de imágenes por TC se pueden ajustar con la ayuda del personal radiológico para optimizar la adquisición de imágenes para los fines específicos de los experimentos individuales.

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