Análisis de Micro-CT cuantitativa de Aortopathy en un modelo murino de disección y aneurisma de la aorta inducida por β-oxidasa

Este método podría ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología vascular, como determinar cómo se ve afectado el tamaño de los vasos en diferentes modelos animales de enfermedad vascular. La principal ventaja de esta técnica es que la micro-TC permite obtener imágenes detalladas de vasos grandes y pequeños, tanto in vivo como ex vivo, que se pueden cuantificar con precisión. 24 horas antes del análisis de la TC, realizar los procedimientos quirúrgicos para preparar la muestra para una profusión intracardíaca postmortem.

Para la anestesia, use isoflurano al 3% y asegúrese de tener un eliminador de carbón a mano. Luego, mantenga la anestesia con dos a 2.5 por ciento de isoflurano de una mascarilla, también conectada a un carroñero con un litro de oxígeno por minuto. Antes de comenzar la cirugía, realice un pellizco en el dedo del pie para verificar la ausencia de un reflejo pedal.

Luego, establezca un campo operativo con instrumentos y así sucesivamente. A continuación, coloque al animal en decúbito dorsal y asegure las extremidades. Ahora, con unas tijeras, haga una incisión en la línea media a través de la piel y el tejido blando sobre el esternón entre la sínfisis púbica y la escotadura esternal.

A continuación, utilice las tijeras para crear un agujero en el diafragma en la apófisis xifoides para entrar en la cavidad torácica. Luego, continúe usando las tijeras para diseccionar el diafragma de la pared torácica ventral bilateralmente. Corte a través de los cartílagos costales para separar las costillas del esternón en el borde esternal derecho.

Ahora, aplique una pinza hemostática fina en la punta del esternón cerca de la apófisis xifoides y mueva el hemostático cranealmente para que quede colocado sobre la cabeza del ratón. Luego, disecciona bruscamente cualquier inserción entre el corazón y la pared torácica. Limite el número de vasos dañados durante la preparación del animal, ya que esto hará que el agente de contraste se escape de los vasos cortados, lo que cambiará el volumen requerido para un llenado completo e introducirá artefactos en la imagen final.

Ahora, conecte una aguja de catéter intravenoso de calibre 27 a una jeringa precargada con 10 mililitros de PBS heparinizado y llene todos los tubos con el tampón, eliminando todas las burbujas de aire. La eliminación de todas las burbujas de las líneas es esencial. Luego, incida inmediatamente el ventrículo derecho, o la vena cava inferior, para drenar la solución de heparina y la sangre.

Para continuar, use la cánula para perforar el ventrículo izquierdo, estabilizado por la pinza. Conduzca la profusión a una velocidad constante de dos mililitros por minuto utilizando una bomba de jeringa. Debe haber un blanqueamiento visible de los órganos.

En unos minutos, la circulación de la vena debería estar libre de sangre. Luego, detenga la bomba y desconecte el tubo del catéter de la jeringa, pero no mueva la aguja del catéter. Ahora, separe la solución de agente de contraste en alícuotas de cinco mililitros, agregue el agente de curado y mezcle bien.

Luego, cargue cinco mililitros de la mezcla en una jeringa de 10 mililitros y profundice el animal con el agente de contraste a una velocidad constante de dos mililitros por minuto. Mantenga la infusión más allá del punto en que se vea que el agente de fundición sale del animal. El agente de contraste se curará en 20 minutos.

Una vez curados, recoja los órganos de interés y fíjelos en formalina tamponada neutra al 10%. A continuación, si las muestras no se utilizan para la exploración micro-CT, fije toda la carcasa. De lo contrario, coloque la carcasa en una bandeja de metal y colóquela en un refrigerador a cuatro grados centígrados para que se cure durante la noche.

Al día siguiente, adquiera imágenes de tomografía computarizada de rayos X de cada ratón utilizando un escáner de micro-CT. Configure los parámetros del escáner de la siguiente manera; Un voltaje máximo de tubo de rayos X de 55 kilovoltios, una corriente de 150 microamperios, un factor de aumento del sistema de 2,19 y un factor de agrupación de píxeles de cámara CCD de dos. Este factor de agrupación producirá un tamaño de píxel efectivo de 29 micras.

A continuación, analice las imágenes para identificar los aneurismas mediante un enfoque estandarizado. Mida el diámetro del eje menor en el punto más ancho de tres ubicaciones; del arco aórtico, de la aorta torácica descendente y de la aorta abdominal. Lo ideal es que dos observadores, uno de los cuales esté ciego, analicen cada imagen.

Con las mediciones, identifique los aneurismas como dilataciones localizadas o difusas de los segmentos aórticos a diámetros superiores al 50% del diámetro de referencia. Se analizaron 20 ratones adultos machos de origen mixto y de 20 a 30 semanas de edad con o sin tratamiento con BAPN. Cada uno fue profundido con un caucho de silicona radiopaco a base de plomo.

El diámetro medio de la aorta ascendente en los ratones tratados con BAPN fue significativamente mayor que el de los controles de la misma edad no tratados. Los puntos de datos de los ratones que se determinó que tenían aneurismas están en rojo. Por el contrario, la inhibición de la lisil oxidasa con BAPN no tuvo un efecto significativo sobre el tórax medio descendente, ni este tratamiento afectó a los diámetros aórticos abdominales.

Un aneurisma se definió como 1,5 veces el diámetro medio del grupo no tratado. El tratamiento conduce a un aumento significativo de los aneurismas según esta definición. Los aneurismas en los ratones tratados con BAPN se identificaron exclusivamente en la aorta, y la mayoría se identificaron en la aorta torácica.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo profusar la vasculatura para la obtención de imágenes radiográficas. Una vez dominado, la profusión y el análisis de la imagen se pueden realizar en dos horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los protocolos de imágenes por TC se pueden ajustar con la ayuda del personal radiológico para optimizar la adquisición de imágenes para los fines específicos de los experimentos individuales.