Name: Todo Monte inmunofluorescencia y cuantificación del folículo de los ovarios de ratón cultivadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprende inmunofluorescencia de órgano completo y aclarado tisular para cuantificar folículos en ovarios de ratón cultivados. Esta técnica preserva la arquitectura tridimensional y permite la cuantificación automatizada en estudios de biología reproductiva.

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Agradecemos a Rebecca Williams y Johanna Dela Cruz de la imagen de BRC de Cornell y Andrew Recknagel para sugerencias y asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado a institutos nacionales de la subvención de salud S10-OD018516 (al centro de la proyección de imagen de Cornell), T32HD057854 a J.C.B. y R01-GM45415 a J.C.S.

Institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Cornell ha aprobado todos los métodos descritos aquí, bajo protocolo 2004-0038 JCS.
1. elaboración de instrumentos y medios de cultivo
<ol><li>Limpie el área de trabajo con 10% bleach y deje que el blanqueador en la superficie del área de trabajo durante al menos 5 minutos. Después de 5 minutos, quitar el exceso cloro con toallas de papel limpias y 70% de etanol (EtOH). Limpiar el microscopio de disección con el 70% EtOH. Nota: Es importante que el área de trabajo al menos semi estéril para evitar la contaminación de cultivos de órganos.</li>
	<li>Wrap limpieza pinzas y las tijeras con una toalla de papel humedecida con 70% EtOH hasta el tiempo de uso. Nota: Las herramientas de disección ideal pueden variar según el edad/tamaño del ovario. Mejores resultados se obtienen utilizando la tijera de disección micro aguda uno, dos pinzas de punta fina (o número 5 o 55) y un micro disección tijera de iris.</li>
	<li>En un tubo cónico, hacer 50 mL de medio de cultivo de ovario y caliente en un baño de agua de 37 ° C.<ol>
<li>Realizar medio de cultivo de ovario4suplemento 1 x medio esencial mínimo (MEM) con 10% suero bovino Fetal (FBS), 25 mM (ácido-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido 4 (HEPES), 100 unidades/mL de penicilina, estreptomicina 100 de μg/mL, 0.25 μg/mL Anfotericina B (p. ej., 45 mL de MEM, 5 mL de calor inactiva FBS, 1,25 mL de HEPES y 0,5 mL de 100 acciones de x de la penicilina, estreptomicina y anfotericina B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar las placas y los partes movibles antes la cultura de ovario.<ol>
<li>En una campana de cultivo de tejidos, añadir 1 mL de medio de cultivo de ovario a una placa de cultivo de tejidos de 35 mm.</li>
		<li>Remojo previo colocar membrana con medio de cultivo. Añadir suficiente medios de comunicación, generalmente alrededor de 0,55 mL por bien, a la placa de cultivo de tejidos de portadora de 24 pocillos y coloque un cultivo celular introducir en el pozo. Asegúrese de que la membrana del inserto toca los medios de comunicación.</li>
		<li>Preparar el número de placas de 35 mm y los pozos con células cultura insertos según el número esperado de ovarios en el experimento. Coloque las placas de 35 mm que contiene 1 mL de medio de cultivo y la placa de 24 pocillos portadora que contienen medios de cultivo y los partes movibles en 37 ° C, 5% CO2y atmosférica O2 la incubadora.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Arreglar una placa junto a la alcance de disección y ajustar la temperatura a 37 ° C. Mantenga a 37 ° C, 5% CO2 y la atmosférica O2 la incubadora está cerca de la sala de disección.</li>
</ol>2. ovario disección y cultivo
Nota: Los ovarios pueden disecar a temperatura ambiente como la exposición a la temperatura ideal no es mínima.
<ol><li>Eutanasia a los ratones hembra en día postnatal 5, por decapitación, uno a la vez. Nota: Eutanasia debe realizarse según las pautas IACUC presentes en las instalaciones donde se realiza la investigación.</li>
	<li>Rociar al animal con el 70% EtOH. Coloque el animal en la parte superior de la toalla de papel bajo el microscopio de disección. Colocar un plato de cultivo de tejidos de 35 mm que contienen medios de cultivo de ovario cerca del microscopio de disección.</li>
	<li>Con pinzas o con una tijera de iris de micro disección, hacer una incisión a través de la piel del animal y en la cavidad abdominal, con precaución de no para cortar los intestinos. Empujar los intestinos fuera de la cavidad abdominal y localice los ovarios. Extraer los ovarios y colocarlos en el plato de cultivo de tejidos de 35 mm que contienen medios de cultivo.</li>
	<li>Una vez los ovarios han sido disecados del animal, aumentar la magnificación del microscopio de disección para visualizar mejor los ovarios y los tejidos adjuntos. Con limpiar pinzas de punta fina, quitar todo el tejido no ovárico, como bursa y tejido graso. Tenga cuidado de mantener los ovarios intactos al retirar el tejido no ovárico adjunto.</li>
	<li>Una vez que los ovarios están aislados, coloque el par en los insertos de cultura celular previamente remojadas de la placa de 24 pocillos de portadora (consulte los pasos 1.4.2 y 1.4.3) y ajustar el volumen del medio para que sea suficiente para mantener el órgano húmedo (sin completamente sumergiéndola). PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de no meter un agujero en la membrana de la célula cultura insertar al transferir los ovarios.</li>
	<li>Lugar explantados órganos en 37 ° C, 5% CO2y atmosférica O2 la incubadora.</li>
	<li>Repita los pasos insertar 2.1-2.6 hasta los ovarios de cada animal disecados y puestos en cultivo celular de la placa de 24 pocillos que contienen el medio de cultivo de ovario.</li>
	<li>Cambio el medio de cultivo de ovario cada 2 días, utilizando calentado alícuotas de los medios de comunicación de ovario de un baño de agua de 37 ° C y proceder a 3 parte del protocolo en el deseado momento experimental.</li>
</ol>3. tejido fijación
<ol><li>En un tubo cónico de 15 mL, preparar 4% paraformaldehido (PFA) en 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS) (p. ej., añadir 2 mL de grado de la microscopia electrónica PFA 16% 6 mL de PBS 1 x). PRECAUCIÓN: PFA es una sustancia peligrosa y debe ser manejado bajo una campana química.</li>
	<li>Fijar los ovarios cultivados, sin quitar el tejido de la inserción de la cultura, cubriendo el tejido con la solución recién preparada de PFA 4%. Sellar los bordes de la placa con plástico adhesivo (para evitar la evaporación) y las muestras a 4 ° C durante la noche. Nota: Para facilitar la manipulación y la integridad de tejidos, evite desplazar los ovarios de la inserción de la cultura de célula a lo largo de todo el procedimiento. Cultivadas ovarios atados a la superficie de la pieza de inserción son ventajosos para el manejo sin dañar o perder el órgano.</li>
	<li>Enjuague el tejido 3 x con el 70% EtOH y tampoco proceda al paso 4.1 o tienda en viales de centelleo llenó de 70% EtOH a 4 ° C hasta más de procesamiento. Nota: Si se utiliza tejido endógeno expresan proteínas fluorescentes, almacenamiento de las muestras con el 70% EtOH puede reducir grandemente la señal. Alternativamente, tejido puede enjuagarse y almacenado en PBS con azida de sodio 0.2% (NaN3). NaN3 es, sin embargo, altamente tóxico y representa un peligro para la inhalación grave. La solución en la campana y manejar usando equipo de protección personal como los guantes de capa y nitrilo de un laboratorio.</li>
</ol>4. todo montaje inmunofluorescencia
<ol><li>Coloque el tejido fijo en 1 x PBS a temperatura ambiente durante un mínimo de 4 h antes del paso de permeabilización 4.3.</li>
	<li>Preparar solución de permeabilización y bloqueo.<ol>
<li>Preparar solución de permeabilización como se describe. A PBS 1 x, agregue 0.2% alcohol polivinílico (PVA), solución al 0.1% Sodio borohidruro (NaBH4) (de 12 wt.% en solución de hidróxido de sodio (NaOH) de 14 M) y 1,5% terc -Octylpheny éter de polietilenglicol (detergente tensioactivo no iónico). En un tubo cónico de 50 mL, agregar 5 mL de 10 x PBS, 0,1 g de PVA, 50 μl de NaBH4y 750 μl de detergente tensioactivo no iónico y, a continuación, añadir ultrapura hasta 50 mL de agua y agite bien a temperatura ambiente hasta que la mezcla esté completamente en solución.</li>
		<li>Preparar solución de bloqueo como se describe. PBS 1 x, agregar surfactante no iónico 0,1% detergente, 0.15% de 2, 5 M pH de glicina 7.4, suero de cabra normal 10% 3% albúmina de suero bovino (BSA), 0.2% NaN3, 100 unidades/mL de penicilina, estreptomicina 100 de μg/mL y 0,25 μg/mL de anfotericina B. preparan una solución de 2.5 M glicina disolviendo 93,8 g de glicina en agua ultrapura hasta un volumen final de 500 mL (pH 7.4) y una solución de 10% NaN3 disolviendo 5 g en 50 mL de agua ultrapura; Luego, en un tubo cónico de 50 mL preparar la solución de bloqueo añadiendo 5 mL de PBS de x 10, 50 μl de un detergente tensioactivo no iónico, 750 μl de la solución madre de glicina, 5 mL de suero de cabra, 1,5 g de BSA, 1 mL de solución NaN3 y 0,5 mL de 100 acciones de x de la penicilina, estreptomicina y anfotericina B. Añadir agua ultrapura hasta un volumen final de 50 mL y jeringa de filtro de la solución final.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quitar y descartar el PBS 1 x del frasco y luego agregar suficiente solución de permeabilización para sumergir completamente los ovarios. Colocar la muestra en solución de permeabilización en un agitador orbital (por ejemplo, nutator) a temperatura ambiente durante 4 horas. Nota: El tiempo de incubación puede variar según el grosor del órgano.</li>
	<li>Reemplazar la solución de permeabilización con suficiente solución de bloqueo para sumergir completamente los ovarios. Sellar el frasco con el plástico adhesivo y dejar el tejido incubando durante un mínimo de 12 h a temperatura ambiente en un agitador orbital.</li>
	<li>Preparar la dilución del anticuerpo primario en solución de bloqueo según el datasheet del fabricante. Nota: Tenga en cuenta que no todos los anticuerpos son compatibles con el agente de claro. El volumen promedio necesario por muestra es aproximadamente 750 μl.<ol>
<li>Para la cuantificación del ovocito, utilice TAp63 (marcador nuclear del ovocito) y MVH (marcador citoplasmáticos célula de germen). Nota: Los anticuerpos utilizados en las imágenes de inmunofluorescencia son ratón anti-p63 y conejo anti-MVH). La solución del anticuerpo primario puede ser reutilizados 2 x o más si se almacena a 4 ° C entre protocolos de tinción y maneja correctamente para evitar el crecimiento bacteriano.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque el inserto que contiene el tejido en una placa de 24 pocillos y añadir unos 750 μl de solución de anticuerpo primario. Asegúrese de que los ovarios estén completamente sumergidos. Selle la placa con plástico adhesivo para minimizar la evaporación y dejar el tejido incubar durante 4 días a temperatura ambiente en un agitador orbital.</li>
	<li>Preparar solución de lavado.<ol>
<li>Preparar solución de lavado como se describe. Hacer 1 x PBS, agregar 0.2% PVA 0.15% tensioactivo no iónico, detergente. En un tubo cónico de 50 mL, agregar 5 mL de 10 x PBS, 0,1 g de PVA, 75 μl de tensioactivo no iónico, detergente y agua ultrapura hasta un volumen final de 50 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eliminar la dilución del anticuerpo primario y agregue una generosa cantidad de solución de lavado. Asegúrese siempre de sumergir los ovarios. Permiten que los ovarios se sumerja en la solución durante la noche a temperatura ambiente en el agitador orbital.</li>
	<li>Reemplazar la solución de lavado e incubar en Agitador orbital durante 2 h o más.</li>
	<li>Repita el paso 4.9 un tiempo adicional.</li>
	<li>Preparar la dilución del anticuerpo secundario en solución de bloqueo. Nota: Los anticuerpos secundarios utilizados son colorante fluorescente 488 anti-ratón planteado en cabra y anti-conejo 594 colorante fluorescente en cabra. Consulte el paso 4.5. el volumen promedio necesita por ejemplo.</li>
	<li>Retire la solución de lavado de los ovarios y añadir solución de anticuerpo secundario. Proteger las muestras de la luz (placa de envolver con papel de aluminio) y sellar la placa con plástico adhesivo para minimizar la evaporación. Incubar las muestras en un agitador orbital a temperatura ambiente durante 2 días. Nota: Seguir protegiendo las muestras de la luz con papel de aluminio durante todos los pasos de incubación posterior.</li>
	<li>Retire la solución de anticuerpo secundario de las muestras y agregue solución de lavado. Incubar en un agitador orbital durante 8 h. Nota: Si desea tinción de 4, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI), añadir 50 ng/mL de DAPI a la primera etapa de lavado (~ 8 h de incubación).</li>
	<li>Reemplazar la solución de lavado para un lavado durante la noche.</li>
	<li>Mientras se prepara la solución de claro (ver sección 5), reemplazar la solución con solución fresca de lavado durante la noche y mantener las muestras en el agitador orbital a temperatura ambiente.</li>
</ol>5. ovario claro y la proyección de imagen
<ol><li>Preparar ScaleS(0) solución de limpieza.<ol>
<li>Preparar ScaleS(0) claro solución10 mediante la adición de reactivos en la proporción dada: 40% D-(-) sorbitol (w/v), 10% glicerol, urea de 4,3 M y 20% de dimetilsulfóxido (DMSO), pH 8.1 (p. ej. en un tubo cónico de 50 mL, agregar 2,5 mL de glicerol, 10 g de sorbitol , 5 mL de DMSO y 12 mL de urea de 9 M para un volumen total de 25 mL. Mezcle la solución por inversión a 50 ° C por 30 min y desgasificar antes del uso.)</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire la solución de lavado y sumergir las muestras en la solución de limpieza. Para obtener mejores resultados, mantener las muestras en el agitador orbital.</li>
	<li>Reemplazar la solución de limpieza 2 veces al día hasta que el tejido se vuelve transparentes (aproximadamente 2 días).</li>
	<li>Una vez que el tejido se borra, preparar la muestra para la proyección de imagen retirando cuidadosamente la membrana de insertar que contiene los ovarios cultivados con una fina punta de bisturí y colocar la muestra en un portaobjetos de vidrio.</li>
	<li>Proceder a las muestras en un microscopio capaz de seccionar óptico de la imagen.</li>
</ol>6. ovocito cuantificación
Nota: Hay muchos programas diferentes que son capaces de cuantificar las células. Se describe a continuación es un protocolo para la cuantificación de ovocitos utilizando el paquete de procesamiento de imagen no-comercial, ImageJ FIJI14.
<ol><li>Usando una proyección de intensidad máxima aplanado de la serie de imagen Z -stack para los marcadores celulares específicos de interés (sin el canal DAPI), convertir la imagen en una imagen de 8 bits blanco y negro en tipo en el desplegable de la imagen menú.</li>
	<li>En el menú desplegable de imagen , resaltar la ficha ajuste y seleccione umbral.</li>
	<li>Ajuste el umbral a un nivel que mejor identifica cada ovocito individual. Una vez que se determina el nivel, haga clic en aplicar para generar una imagen en blanco y negro. Una vez completado, cuantificar la muestra delimitación utilizando el icono ovalado o Freehand . Nota: FIJI-ImageJ tiene diferentes opciones para ajustar la imagen que se utilizarán para la cuantificación de partículas. Por ejemplo, en proceso | Binario pestaña, hay diferentes opciones que pueden utilizarse para mejorar la detección de lo que se contará. En la figura 4, las opciones utilizadas para individualizar mejor los folículos fue Erode, seguido por tapar agujerosy por último cuenca.</li>
	<li>En el menú analizar , seleccione analizar partículas. Configurar los parámetros de acuerdo a la resolución deseada.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El estudio de mamífero reproducción requiere utilizar y cuantificar las células especializadas que no son habitualmente susceptibles de cultivo celular. Sin embargo, sistemas de cultivo ex vivo son efectivos en mantener ovario folículo viabilidad1,15. Durante cultura de ovario, el tejido requiere una mayor superficie para el intercambio de nutrientes a través de la difusión. Por lo tanto, 5 - viejo ratón ovarios son ideales en tamaño y forma de cultivo. ...

Para estudiar la composición celular y las características morfológicas de los ovarios mamíferos, los científicos a menudo confían en vivo experimentos, seguidos por la coloración de immunohistological de los ovarios de embebido de parafina. Más recientemente sin embargo, cultura de órgano entero ovario ha demostrado para ser una alternativa eficaz para el estudio de la función ovárica1,2,3,4 porque la técnica puede combinarse con mejor visualización y herramientas de cuantificación. Tradicionalmente, el análisis de la morfología ovárica depende de reconstrucción tridimensional arquitectura ovárica de embebido de parafina secciones seriales, pero, además de ser laborioso y desperdiciador de tiempo, en serie Seccionando tejido embebido de parafina no garantía de reconstrucción adecuada del órgano y secciones a menudo se pierden o mal ordenadas en el proceso.
Además de los desafíos técnicos asociados con el seccionamiento serial, también hay variaciones en los métodos habitualmente utilizados para cuantificar el número de folículos por ovario de5,6. La variabilidad metodológica utilizada actualmente deteriora metanálisis de reserva ovárica a través de estudios5,7. Por ejemplo, números de folículos de diferentes artículos pueden variar en 10 veces o más entre las edades del desarrollo similares dentro de una cepa específica6. Estas grandes diferencias en la cuantificación reportados del folículo pueden conducir a la confusión y han obstaculizado las comparaciones Cruz-estudio. Experimentalmente, los enfoques tradicionales para cuantificación de folículo de secciones seriales realizan recuento de folículos de un número predefinido de secciones (por ejemplo, cada quinto, décimo, u otra sección). Variabilidad en folículo cuenta con este enfoque surge no sólo de la periodicidad en que secciones se cuentan sino también de las variaciones en el grosor de la sección y experiencia técnica en la generación de secciones seriadas de5,6. Además de su variabilidad, otra desventaja de seccionamiento de tejidos tradicionales es que el seccionamiento de ovarios pequeños de animales jóvenes es especialmente difícil y depende en gran medida de tejido orientación8.
El protocolo a continuación describe un ovario rutinariamente usada cultura técnica1 pero mejora grandemente sobre cuantificación de folículo tradicional mediante la sustitución física de seccionamiento con tejido claro y seccionamiento óptico usando microscopia confocal8 ,9. Mediante inmersión del tejido (sin la necesidad de perfusión de transcranial o electroforesis) en una urea y sorbitol basado en solución (por ejemplo, ScaleS(0)10) resultó compatible con la inmunotinción y permitió la reducción de tiempo de limpieza sin comprometer la profundidad de la proyección de imagen. Otros métodos reportados (p. ej., ScaleA28,10, SeeDB11, Clear12y ClearT212) están más tiempo consumiendo o no permite profundidad resolución óptica de la muestra. Seccionamiento óptico es ventajoso porque es menos mano de obra y mantiene arquitectura tridimensional7,8 el órgano. Otra ventaja de este enfoque es que la preparación de las muestras no requiere de costosos reactivos para eliminar el tejido y puede llevarse a cabo con relativa facilidad.
Específicamente, el protocolo descrito ha sido optimizado para los ovarios de ratón cultivadas en día postnatal cinco pero se ha realizado en los ovarios desde día postnatal 0 - 10. El método hace uso de un sistema de cultivo de ovario en el que el tejido naturalmente se une a la membrana en la que se cultiva, facilitando el manejo del órgano y manipulación. El sistema de cultivo descrito puede utilizarse para mantener explanted ovarios hasta por 10 días y evaluar cómo las diferentes condiciones experimentales pueden interferir con el oocyte supervivencia13. El procedimiento de cuantificación descrito se realiza utilizando el paquete ImageJ FIJI14 de procesamiento de imágenes no comerciales y puede llevarse a cabo en la mayoría de los ordenadores personales. Además, las imágenes utilizadas para la cuantificación es posible disponibles para la comunidad científica, permitiendo así futuros metanálisis.

<table><tbody><tr><td>Micro tijera de disección 4.5", recta, puntas afiladas</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td>Micro tijera de disección</td></tr><tr><td>Pinzas estilo joyero 4-3/8", estilo 5</td><td>Integra Miltex</td><td>17-305X</td><td>Pinzas de punta fina</td></tr><tr><td>Micro Tijeras de Iris 4", rectas, puntas afiladas</td><td>Integra Miltex</td><td>18-1618</td><td>Micro tijera de disección de iris o micro tijera de disección de resorte</td></tr><tr><td>1X Minimal Medios esenciales (MEM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11090-081</td><td></td></tr><tr><td>Serium bovino fetal</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>antibiótico-antimicótico (100X)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>utilizado en el paso 1.3.1</td></tr><tr><td>Placa tratada con cultivo de tejidos de 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&comercio; Placa portadora de 24 pocillos para insertos de cultivo celular</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>141006</td><td>Tamaño de poro: 8&mu; m</td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>15710</td><td>Solución al 16%</td></tr><tr><td>1X Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador Nutator GyroTwister&trade;</td><td>Labnet</td><td>S1000-A-B</td><td>agitador tridimensional</td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>VWR</td><td>103219-578</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de suero bovino (BSA)</td><td>VWR</td><td>97061-416</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td></td></tr><tr><td>Solución de borohidruro de sodio (NaBH4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452904-25ML</td><td>Utilice la solución, en lugar de la en forma de tableta o polvo&nbsp;</td></tr><tr><td>Alcohol polivinílico (PVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136-250G</td><td>Soluble en agua fría</td></tr><tr><td>Triton&trade; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443-100ML</td><td>polietilenglicol terc-octilfenil</td></tr><tr><td>éter Filtros de jeringa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>725-2520</td><td>25mm</td></tr><tr><td>10mL Jeringas</td><td>BD</td><td>309695</td><td></td></tr><tr><td>Ratón anticuerpo anti-p63 (4A4)</td><td>Biocare Medical</td><td>CM 163A</td><td>Dilución 1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-MVH de conejo</td><td>Abcam</td><td>ab13840</td><td>Dilución 1:600</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; anti-ratón de cabra 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11032</td><td>Dilución 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; anti-conejo de cabra 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>Dilución 1:1000</td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI)&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)sorbitol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240850-100G</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>FIJI-ImageJ</td><td></td><td></td><td>Software de procesamiento de imágenes</td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia de plástico desechables</td><td>VWR</td><td>414044-034</td><td></td></tr></tbody></table>

todo monte inmunofluorescencia y cuantificación del folículo de los ovarios de ratón cultivadas

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Investigación en el campo de la biología reproductiva de mamífero a menudo implica evaluar la salud general de los ovarios y los testículos. Específicamente, en las mujeres, fitness ovárico a menudo es evaluado por visualización y cuantificación de los folículos y ovocitos. Porque el ovario es un opaco tejido tridimensional, los enfoques tradicionales requieren laborioso cortar el tejido en numerosas secciones seriadas para poder visualizar las células en el órgano entero. Además, porque la cuantificación por este método típicamente conlleva puntuación sólo un subconjunto de las secciones separadas por el diámetro aproximado de un ovocito, es propensa a la inexactitud. Aquí, se describe un protocolo que utiliza en su lugar claro de tejido órgano entero y tinción de inmunofluorescencia de ovarios de ratón para visualizar los folículos y ovocitos. En comparación con los enfoques más tradicionales, este protocolo es ventajoso para la visualización de las células en el ovario por muchas razones: 1) el ovario se mantiene intacto a lo largo de la preparación de la muestra y el procesamiento; 2) ovarios pequeños, que son difíciles de sección, pueden examinarse con facilidad; 3) celular cuantificación se logra más fácilmente y con precisión; y 4) el órgano entero reflejado.

Este protocolo incluye 6 pasos principales tras disección de ovarios, como se indica en la figura 1. Figura 2 , Figura 3 , Figura 4 destacar las características más novedosas de este protocolo, que incluyen optimización de tejido para los ovarios y todo tejido cuantificación de ovocitos con ImageJ de FIJI. <strong cla...

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar los folículos en los ovarios cultivados de ratones jóvenes sin seccionamiento serial. Con inmunofluorescencia de todo órgano y tejido claro, seccionar físico se sustituye por seccionamiento óptico. Este método de preparación de la muestra y visualización mantiene la integridad de órganos y facilita la cuantificación automática de células específicas.

Todo Monte inmunofluorescencia y cuantificación del folículo de los ovarios de ratón cultivadas

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de ovarios enteros cultivados que sean compatibles con la cuantificación automatizada de folículos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología reproductiva, como cómo las diferentes condiciones interfieren con la aptitud ovárica. La principal ventaja de esta técnica es que requiere menos mano de obra y mantiene la arquitectura tridimensional del órgano.Aunque este método se ha optimizado para ovarios de ratón cultivados en el quinto día postnatal, también se puede aplicar a otras edades y tejidos, como gónadas embrionarias o testículos de ratones jóvenes. Comience con una superficie de trabajo limpia. Limpie con lejía al diez por ciento y deje que la lejía permanezca en la superficie del área de trabajo durante al menos cinco minutos.Después de cinco minutos, retire el exceso de lejía con toallas de papel limpias y etanol al 70 por ciento. Limpie a fondo el microscopio de disección con etanol al 70 por ciento y coloque una toalla de papel seca sobre la plataforma. Envuelva las pinzas y tijeras limpias con una toalla de papel humedecida con etanol al 70 por ciento.A continuación, prepare 50 mililitros de medio de cultivo de ovario en un tubo cónico y caliéntelo en un baño de agua a 37 grados centígrados. Después de que el medio se haya calentado, prepare las placas y los insertos agregando primero un mililitro de medio de cultivo de ovario a las placas de cultivo de tejidos de 35 milímetros. A continuación, añada aproximadamente 0,55 mililitros de medio a los pocillos de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos y coloque un inserto en cada pocillo que contenga el medio.Asegúrese de que las membranas toquen el medio. Coloque las placas de 35 milímetros y la placa portadora de 24 pocillos en una incubadora de 37 grados Celsius, cinco por ciento de dióxido de carbono y oxígeno atmosférico. A continuación, coloque una placa calefactora junto al visor de disección y ajuste la temperatura a 37 grados centígrados.Si la incubadora de cultivo de tejidos no está cerca del área de disección, coloque una de las placas de cultivo de tejidos de 35 milímetros que contienen medios de cultivo de ovarios en la placa caliente. Luego comience la disección rociando a la hembra recién sacrificada con etanol al 70 por ciento y colóquela encima de la toalla de papel seca bajo el microscopio de disección. Después de hacer una incisión en la cavidad abdominal, extruya los intestinos y localice los ovarios.Extraiga los ovarios y colóquelos en el medio de cultivo en el plato de 35 milímetros. Una vez que se hayan diseccionado los ovarios, aumente el aumento del microscopio de disección para visualizar mejor los ovarios y cualquier tejido adherido. Con pinzas limpias de punta fina, extraiga todo el tejido no ovárico, como la bursa y el tejido graso, sin dañar los ovarios.A continuación, coloque cada par de ovarios en un inserto de cultivo celular previamente empapado y ajuste el volumen del medio para asegurarse de que sea suficiente para mantener el órgano húmedo sin sumergirlo por completo. Coloque los órganos explantados en una incubadora de 37 grados centígrados, cinco por ciento de dióxido de carbono y oxígeno atmosférico. En el momento experimental deseado, retire el medio de cultivo de ovario de la placa y fije los ovarios cultivados en el inserto cubriendo el tejido con una solución de PFA al cuatro por ciento recién preparada.Selle los bordes de la placa con una película de parafina para evitar la evaporación y coloque las muestras a cuatro grados centígrados durante la noche. Enjuague el pañuelo tres veces con etanol al 70 por ciento. Luego almacene en viales de centelleo llenos de etanol al 70 por ciento a cuatro grados Celsius hasta su posterior procesamiento.Comience la tinción eliminando el etanol al 70 por ciento de los viales y lavando el tejido fijado con PBS a temperatura ambiente agitando durante un mínimo de cuatro horas. Después de retirar el PBS, agregue suficiente solución de permeabilización para sumergir completamente los ovarios. Coloque en un agitador orbital e incube a temperatura ambiente durante cuatro horas.Reemplace la solución de permeabilización con suficiente solución de bloqueo para sumergir completamente los ovarios. A continuación, incubar los viales sellados a temperatura ambiente durante un mínimo de 12 horas en un agitador orbital. Después del bloqueo, coloque los insertos en una placa de 24 pocillos y agregue aproximadamente 750 microlitros de solución de anticuerpos primarios asegurándose de que los ovarios estén completamente sumergidos.A continuación, coloque la placa sellada en el agitador orbital e incube durante cuatro días a temperatura ambiente. Después de cuatro días, retire el anticuerpo primario y agregue una cantidad generosa de solución de lavado. Lavar los ovarios durante la noche.Al día siguiente, reemplácelo con una solución de lavado fresca e incube en el agitador orbital durante dos horas o más. Después de los lavados, agregue la solución de anticuerpos secundarios. Proteger las muestras de la luz e incubarlas en un agitador orbital a temperatura ambiente durante dos días.Después de dos días, retire la solución de anticuerpos secundarios de las muestras y agregue la solución de lavado. Comience preparando la solución de limpieza ScaleS0. Mezclar la solución por inversión e incubar a 50 grados centígrados durante 30 minutos.Desgasificación de la solución de limpieza ScaleS0. A continuación, retire la solución de lavado de los ovarios inmunoteñidos. Agregue la solución de compensación.Cubra la placa con papel de aluminio y devuélvala al agitador orbital. Es extremadamente importante tener paciencia durante los pasos de tinción y limpieza. Una vez que el tejido se haya vuelto transparente, use un bisturí de punta fina para quitar cuidadosamente las membranas del inserto que contienen los ovarios cultivados.Coloque la muestra en un portaobjetos de vidrio y cubra suavemente la muestra con un cubreobjetos. A continuación, se procede a obtener imágenes de las muestras en un microscopio capaz de realizar cortes ópticos. Esta imagen muestra un ovario postnatal del quinto día que no se ha limpiado.Aquí, el ovario se muestra una hora después de la adición de la solución de aclaración. El ovario comenzará a volverse translúcido a los pocos minutos de sumergirse en la solución de limpieza. Es posible el corte óptico de los ovarios cultivados sin aclaramiento, pero las células profundas del tejido tienen una señal que es difícil de diferenciar del fondo, lo que impide la cuantificación adecuada de los ovocitos.Por el contrario, esta imagen representativa muestra una muestra aclarada en la que es posible la cuantificación de ovocitos en todo el órgano. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los anticuerpos tienen que difundirse a través del tejido; Por lo tanto, los tejidos más gruesos requerirán un tiempo de incubación más largo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar, teñir e obtener imágenes de ovarios completos.El texto describe el uso de un software libre, Fiji ImageJ, que se puede utilizar para la cuantificación sencilla de folículos. No olvide que trabajar con paraformaldehído y azida de sodio puede ser peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de campanas extractoras y equipo de protección personal al realizar este procedimiento.

whole-mount-immunofluorescence-follicle-quantification-cultured-mouse

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este protocolo describe el cultivo primario / co-cultivo de tejido ovárico ratón, utilizando los ovarios de ratones recién nacidos y los folículos ováricos individuales de ratones prepúberes. Las técnicas de cultivo de apoyar el desarrollo de una manera altamente fisiológica, lo que permite la investigación del efecto de los agentes extrínsecos en el ovario, y de las interacciones entre los folículos ováricos.

Cultura y Co-cultura de ratón ovarios y los folículos ováricos

Cultivos de tejido ováricos se puede utilizar como modelos de la atresia de desarrollo, la ovulación y el folículo folículo e indicar mecanismos reguladores de procesos dinámicos de ovarianos.

Cultivo de tejido ovárico para visualizar fenómenos en ovario de ratón

Aquí, describimos, comparamos, y ponemos en contraste dos diversas técnicas para la cuenta exacta del folículo de tejidos ováricos fijos del ratón.

Enumeración exacta del folículo en ovarios adultos del ratón

Aquí, presentamos un protocolo optimizado para obtener imágenes de ovarios enteros para análisis cuantitativos y cualitativos utilizando inmunotinción de montaje completo, microscopía multifotónica y visualización y análisis 3D. Este protocolo se adapta al procesamiento de alto rendimiento, confiable y repetible que es aplicable para toxicología, diagnóstico clínico y ensayos genómicos de la función ovárica.

Inmunofluorescencia de ovario completo, limpieza y microscopía multifotónica para el análisis cuantitativo en 3D de la reserva ovárica en desarrollo en ratones

El protocolo descrito aquí detalla la inducción de un programa hemogénico en fibroblastos embrionarios de ratón a través de la sobreexpresión de un conjunto mínimo de factores de transcripción. Esta tecnología puede trasladarse al sistema humano para proporcionar plataformas para futuros estudios de la hematopoyesis, la enfermedad hematológica y el trasplante de células madre hematopoyéticas.

La reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con factores de transcripción para inducir un programa Hemogenic

Se presenta un método para el aislamiento y cultivo de conducto de Wolff ratón (WD). También demostramos un procedimiento detallado para toda la inmunotinción monte de WDS cultivadas / recién aisladas con anticuerpos marcados con fluorescencia. En conjunto, estas técnicas permiten el estudio del desarrollo de WD, bobinado, y la diferenciación.

Cultura de órganos y todo el montaje Inmunofluorescencia La tinción de mouse de Wolff Conductos

Desarrollo de cilios es vital para la correcta organogénesis. Este protocolo describe un método optimizado para la etiqueta y visualizar las células ciliadas del pez cebra.

Visualización de las células Multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo Monte fluorescente In Situ hibridación e inmunofluorescencia

En este protocolo, describimos las técnicas para la adecuada disección de flores de Arabidopsis y silicuas, algunas técnicas de compensación básica y seleccionado procedimientos de observaciones del conjunto de montaje de estructuras reproductivas de tinción.

Whole-mount y coloración de silicuas y órganos flor de Arabidopsis

Aquí, describimos un protocolo para montaje entero de la inmunofluorescencia y análisis volumétrico cuantitativo basado en imágenes de embriones de ratón de etapa temprana. Presentamos esta técnica como un potente enfoque cualitativa y cuantitativamente evaluar estructuras cardiacas durante el desarrollo, y proponer que sea ampliamente adaptable a otros sistemas del órgano.

Análisis de la inmunofluorescencia de Whole-mount cuantitativa de las poblaciones progenitoras cardiacas en embriones de ratón

El ovario del Drosophila es un sistema modelo excelente para estudiar el desarrollo del nicho de células madre. Aunque se han publicado métodos para disecar larvarios y adultos de los ovarios, disecciones de ovario pupa requieren técnicas diferentes que no han sido publicadas en detalle. Aquí describiremos un protocolo de disección, tinción y montaje pupas ovarios.

Disección y la coloración de los ovarios Pupal de Drosophila

Aprende inmunofluorescencia de órgano completo y aclarado tisular para cuantificar folículos en ovarios de ratón cultivados. Esta técnica preserva la arquitectura tridimensional y permite la cuantificación automatizada en estudios de biología reproductiva.

Todo Monte inmunofluorescencia y cuantificación del folículo de los ovarios de ratón cultivadas

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