Todo Monte inmunofluorescencia y cuantificación del folículo de los ovarios de ratón cultivadas

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de ovarios enteros cultivados que sean compatibles con la cuantificación automatizada de folículos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología reproductiva, como cómo las diferentes condiciones interfieren con la aptitud ovárica. La principal ventaja de esta técnica es que requiere menos mano de obra y mantiene la arquitectura tridimensional del órgano.

Aunque este método se ha optimizado para ovarios de ratón cultivados en el quinto día postnatal, también se puede aplicar a otras edades y tejidos, como gónadas embrionarias o testículos de ratones jóvenes. Comience con una superficie de trabajo limpia. Limpie con lejía al diez por ciento y deje que la lejía permanezca en la superficie del área de trabajo durante al menos cinco minutos.

Después de cinco minutos, retire el exceso de lejía con toallas de papel limpias y etanol al 70 por ciento. Limpie a fondo el microscopio de disección con etanol al 70 por ciento y coloque una toalla de papel seca sobre la plataforma. Envuelva las pinzas y tijeras limpias con una toalla de papel humedecida con etanol al 70 por ciento.

A continuación, prepare 50 mililitros de medio de cultivo de ovario en un tubo cónico y caliéntelo en un baño de agua a 37 grados centígrados. Después de que el medio se haya calentado, prepare las placas y los insertos agregando primero un mililitro de medio de cultivo de ovario a las placas de cultivo de tejidos de 35 milímetros. A continuación, añada aproximadamente 0,55 mililitros de medio a los pocillos de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos y coloque un inserto en cada pocillo que contenga el medio.

Asegúrese de que las membranas toquen el medio. Coloque las placas de 35 milímetros y la placa portadora de 24 pocillos en una incubadora de 37 grados Celsius, cinco por ciento de dióxido de carbono y oxígeno atmosférico. A continuación, coloque una placa calefactora junto al visor de disección y ajuste la temperatura a 37 grados centígrados.

Si la incubadora de cultivo de tejidos no está cerca del área de disección, coloque una de las placas de cultivo de tejidos de 35 milímetros que contienen medios de cultivo de ovarios en la placa caliente. Luego comience la disección rociando a la hembra recién sacrificada con etanol al 70 por ciento y colóquela encima de la toalla de papel seca bajo el microscopio de disección. Después de hacer una incisión en la cavidad abdominal, extruya los intestinos y localice los ovarios.

Extraiga los ovarios y colóquelos en el medio de cultivo en el plato de 35 milímetros. Una vez que se hayan diseccionado los ovarios, aumente el aumento del microscopio de disección para visualizar mejor los ovarios y cualquier tejido adherido. Con pinzas limpias de punta fina, extraiga todo el tejido no ovárico, como la bursa y el tejido graso, sin dañar los ovarios.

A continuación, coloque cada par de ovarios en un inserto de cultivo celular previamente empapado y ajuste el volumen del medio para asegurarse de que sea suficiente para mantener el órgano húmedo sin sumergirlo por completo. Coloque los órganos explantados en una incubadora de 37 grados centígrados, cinco por ciento de dióxido de carbono y oxígeno atmosférico. En el momento experimental deseado, retire el medio de cultivo de ovario de la placa y fije los ovarios cultivados en el inserto cubriendo el tejido con una solución de PFA al cuatro por ciento recién preparada.

Selle los bordes de la placa con una película de parafina para evitar la evaporación y coloque las muestras a cuatro grados centígrados durante la noche. Enjuague el pañuelo tres veces con etanol al 70 por ciento. Luego almacene en viales de centelleo llenos de etanol al 70 por ciento a cuatro grados Celsius hasta su posterior procesamiento.

Comience la tinción eliminando el etanol al 70 por ciento de los viales y lavando el tejido fijado con PBS a temperatura ambiente agitando durante un mínimo de cuatro horas. Después de retirar el PBS, agregue suficiente solución de permeabilización para sumergir completamente los ovarios. Coloque en un agitador orbital e incube a temperatura ambiente durante cuatro horas.

Reemplace la solución de permeabilización con suficiente solución de bloqueo para sumergir completamente los ovarios. A continuación, incubar los viales sellados a temperatura ambiente durante un mínimo de 12 horas en un agitador orbital. Después del bloqueo, coloque los insertos en una placa de 24 pocillos y agregue aproximadamente 750 microlitros de solución de anticuerpos primarios asegurándose de que los ovarios estén completamente sumergidos.

A continuación, coloque la placa sellada en el agitador orbital e incube durante cuatro días a temperatura ambiente. Después de cuatro días, retire el anticuerpo primario y agregue una cantidad generosa de solución de lavado. Lavar los ovarios durante la noche.

Al día siguiente, reemplácelo con una solución de lavado fresca e incube en el agitador orbital durante dos horas o más. Después de los lavados, agregue la solución de anticuerpos secundarios. Proteger las muestras de la luz e incubarlas en un agitador orbital a temperatura ambiente durante dos días.

Después de dos días, retire la solución de anticuerpos secundarios de las muestras y agregue la solución de lavado. Comience preparando la solución de limpieza ScaleS0. Mezclar la solución por inversión e incubar a 50 grados centígrados durante 30 minutos.

Desgasificación de la solución de limpieza ScaleS0. A continuación, retire la solución de lavado de los ovarios inmunoteñidos. Agregue la solución de compensación.

Cubra la placa con papel de aluminio y devuélvala al agitador orbital. Es extremadamente importante tener paciencia durante los pasos de tinción y limpieza. Una vez que el tejido se haya vuelto transparente, use un bisturí de punta fina para quitar cuidadosamente las membranas del inserto que contienen los ovarios cultivados.

Coloque la muestra en un portaobjetos de vidrio y cubra suavemente la muestra con un cubreobjetos. A continuación, se procede a obtener imágenes de las muestras en un microscopio capaz de realizar cortes ópticos. Esta imagen muestra un ovario postnatal del quinto día que no se ha limpiado.

Aquí, el ovario se muestra una hora después de la adición de la solución de aclaración. El ovario comenzará a volverse translúcido a los pocos minutos de sumergirse en la solución de limpieza. Es posible el corte óptico de los ovarios cultivados sin aclaramiento, pero las células profundas del tejido tienen una señal que es difícil de diferenciar del fondo, lo que impide la cuantificación adecuada de los ovocitos.

Por el contrario, esta imagen representativa muestra una muestra aclarada en la que es posible la cuantificación de ovocitos en todo el órgano. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los anticuerpos tienen que difundirse a través del tejido; Por lo tanto, los tejidos más gruesos requerirán un tiempo de incubación más largo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar, teñir e obtener imágenes de ovarios completos.

El texto describe el uso de un software libre, Fiji ImageJ, que se puede utilizar para la cuantificación sencilla de folículos. No olvide que trabajar con paraformaldehído y azida de sodio puede ser peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de campanas extractoras y equipo de protección personal al realizar este procedimiento.