Inyección de lipopolisacárido en ratones para imitar la entrada de productos derivados de microbios después de la ruptura de la barrera Intestinal

Aquí se presenta un protocolo para imitar la entrada de compuestos derivados de bacterias después de la ruptura de la barrera intestinal. Una baja dosis subletal de lipopolisacárido se inyectó sistémica en ratones, que fueron supervisados para la inyección después de 24 h. La expresión de citoquinas proinflamatorias se determinó en varios puntos del tiempo en bazo, hígado y colon.

El objetivo general de este experimento es presentar un modelo que imite la entrada de productos derivados de microbios después de una ruptura de la barrera intestinal. Este modelo se puede utilizar para investigar las respuestas inmunitarias tras la invasión de microorganismos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la enfermedad inflamatoria intestinal, como la inflamación no controlada, que se caracteriza por un aumento de la permeabilidad epitelial intestinal.

La principal ventaja de esta técnica es que no solo utiliza una bomba definida, sino que también es un enfoque sencillo que no requiere cirugía y se puede utilizar en todos los entornos de laboratorio. Rachel Mak'Anyengo, postdoctorada, y Berna Kaya, estudiante de doctorado, demostraremos el procedimiento. Manipule el ratón con suavidad pero con firmeza y sujete al animal con una mano.

Asegúrese de que el mouse esté bien sujeto y pueda respirar normalmente. Incline la nariz del ratón ligeramente hacia el suelo para exponer el abdomen para la inyección. Localice la línea media del abdomen e inyecte el volumen de LPS requerido en el lado inferior izquierdo o derecho.

Es muy importante asegurarse de que la aguja entra en la cavidad peritoneal para evitar inyecciones erróneas. La aguja tampoco debe penetrar demasiado en la cavidad peritoneal para evitar lesiones en los órganos internos. Regrese suavemente al animal a la jaula de la casa.

Monitorizar los ratones para determinar la incidencia y gravedad de la endotoxemia en el momento de la inyección y cada dos horas a partir de entonces durante ocho horas. Registre las observaciones en la hoja de puntuación adjunta. Prepare los tubos de recolección añadiendo un mililitro de reactivo de aislamiento de ARN de un solo paso a dos tubos de mililitros precargados con esferas cerámicas de 1,4 milímetros.

Después de sacrificar y anguinar al ratón, use un par de tijeras para cortar la piel y la capa muscular, exponiendo la cavidad abdominal con los órganos internos. Disecciona cuidadosamente el bazo, el hígado y el colon. Limpie la grasa de cada órgano, luego colóquela en PBS sobre hielo.

A continuación, utiliza unas tijeras o un bisturí para cortar un trozo de 0,5 centímetros de largo de cada órgano. Seque brevemente el tejido en un trozo de papel y colóquelo en el tubo de recolección, asegurándose de que esté completamente sumergido en el reactivo de aislamiento de ARN. A continuación, homogeneice el tejido en un homogeneizador de sobremesa de alta velocidad.

Para tejidos blandos como el bazo, el hígado y el colon, use un ciclo de homogeneización a alta velocidad durante 30 segundos. Después de la homogeneización, incubar las muestras durante cinco minutos a temperatura ambiente. Sumerja cuidadosamente los tubos en nitrógeno líquido para congelar el lisado de tejido.

Almacene el lisado congelado a menos 80 grados centígrados hasta el aislamiento del ARN. Comience el aislamiento del ARN descongelando el tejido lisado congelado en hielo. Una vez descongelada, centrifugar la muestra a 1000 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para granular las partículas de tejido restantes que puedan quedar.

Después de la centrifugación, transfiera los sobrenadantes a un nuevo tubo de 1,5 mililitros libre de nucleasas y agregue 200 microlitros de cloroformo helado por un mililitro de reactivo de aislamiento de ARN. Agite inmediatamente el cartílago durante 10 a 15 segundos. Después de incubar las muestras durante dos o tres minutos a temperatura ambiente, centrifugar a 12.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.

La muestra contendrá ahora tres fases, la fase inferior de cloroformo de fenol rojo, la interfase y la fase acuosa incolora superior. Recoja la fase acuosa superior que contiene ARN y transfiérala a un nuevo tubo de 1,5 mililitros sin nucleasa. Para precipitar el ARN, agregue 0,5 mililitros de isopropanol helado por un mililitro de reactivo de aislamiento de ARN y mezcle suavemente invirtiendo el tubo de cinco a seis veces.

Después de incubar durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente, centrifugar a 12.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, elimine completamente el sobrenadante que contiene el isopropanol sin alterar el pellet. A continuación, lavar los gránulos con un mililitro de etanol al 75% helado por un mililitro de reactivo de aislamiento de ARN utilizado para la lisis inicial y vortear la muestra brevemente.

Después de centrifugar la muestra a 7500 o 12.000 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, retire completamente el sobrenadante sin alterar el pellet. Deje los tubos abiertos debajo de la cubierta química durante tres a cinco minutos para que el pellet de ARN se seque al aire a temperatura ambiente. A continuación, disuelva el gránulo de ARN en 20 a 50 microlitros de agua libre de nucleasas pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo.

A continuación, incubar la muestra a 55 grados centígrados durante 10 a 15 minutos para mejorar aún más la solución del ARN. Digiera el ADN contaminante agregando primero agua libre de nucleasas hasta un máximo de 10 microgramos de ARN, de modo que el volumen final sea de 50 microlitros después de la adición de tampón y enzima. A continuación, añada cinco microlitros de tampón 10X DNasa 1 y un microlitro de DNasa 1 recombinante por muestra y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

Incubar a 37 grados centígrados durante 20 a 30 minutos. Después de la incubación, agite la DNasa en el reactivo de activación, luego agregue cinco microlitros a la muestra y mezcle bien. Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente, mezclando ocasionalmente con la mano.

Después de centrifugar a 10.000 veces G durante un minuto y medio, transfiera el sobrenadante que contiene el ARN libre de ADN a un nuevo tubo libre de nucleasa. Por último, mida la concentración y la calidad del ARN mediante espectrofotómetro. Después de la inyección de LPS, la puntuación de la enfermedad, que incluye evaluaciones de la apariencia y la actividad de los animales, la apertura de sus ojos y su tasa y calidad de la respiración, se trazó en el eje Y en comparación con el tiempo en el eje X.

La QPCR para cuantificar la expresión de citocinas reveló que Il6 alcanzó su punto máximo dos horas después de la inyección de LPS en el bazo y el colon, y cuatro horas después de la inyección en el hígado. La expresión de Il1 beta, Tnf alfa e Il10 alcanzó su punto máximo cuatro horas después de la inyección en todos los tejidos. En ocho horas, la expresión de Il6, Il1 beta, Tnf alfa e Il10 volvió a los niveles basales.

Al intentar el procedimiento, es importante recordar tener en cuenta la dosis de LPS, el estado de higiene de los ratones, el momento de finalización del experimento y, lo que es más importante, los antecedentes genéticos de la cepa de ratón. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo imitar la entrada de compuestos derivados de bacterias en un huésped después de una violación de la barrera. La dosis baja y subletal de LPS inyectada sistemáticamente en ratones induce una regulación positiva de las citocinas proinflamatorias, que se cuantifican mediante el análisis de PCR RGQ.