Name: Visualización de depósitos β amiloide en el cerebro humano con desorción láser asistida por matriz/ionización del Spectrometry total de la proyección de imagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Aprenda a visualizar depósitos de β amiloide en tejido cerebral humano mediante espectrometría de masas por ionización y desorción láser asistida por matriz. Este protocolo mejora la resolución espacial para estudiar la patología de Alzheimer.

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Este trabajo fue apoyado en parte por las subvenciones para la investigación científica en áreas innovadoras (proteína cerebral envejecimiento y demencia Control 26117004; M.I. y T.M.). Esta investigación fue parcialmente financiada por el programa estratégico de investigación para las Ciencias del cerebro de la Agencia Japonesa para la investigación médica y desarrollo (AMED). Todos los experimentos se llevaron a cabo cumpliendo con las directrices de llegar.

Aquí, se colectaron muestras de tejido en el Tokio Metropolitan geriátrico Hospital, que brinda servicios médicos comunitarios a la población anciana en Japón. Las muestras de autopsia de cerebro utilizadas en el estudio se registraron en el Banco de cerebros para la investigación del envejecimiento (BBAR) con el consentimiento informado de los familiares del difunto. El BBAR es aprobado por el Comité de ética de la Tokyo Metropolitan Hospital geriátrico e Instituto de Gerontología. Para todos los cerebros registrados en el Banco de cerebros, obtuvimos escrito consentimiento informado para su utilización para la investigación médica de los pacientes o sus familias. Los pacientes fueron colocados en una habitación fría (4 ° C) en 2 h después de la muerte para reducir los cambios post mortem del cerebro. Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por la Universidad de Doshisha y el Banco de cerebros para la investigación envejecimiento, Tokio Metropolitan Hospital geriátrico e Instituto de Gerontología.
1. preparación de las secciones de tejido para IMS
<ol><li>Procesamiento de muestra de tejido del cerebro autopsied humana Nota: Asegúrese de que el paso de preparación de muestra para IMS conserva el estado original del tejido. Evitar la contaminación, cambios post-mortem. El siguiente paso es crucial.<ol>
<li>Obtener a muestras humanas corticales para IMS de cerebros que se quitan, procesados y almacenados a-80 ° C dentro de las 8 horas post mortem. Tomar a la muestra de cerebro de la corteza occipital de pacientes con EA y controles pareados por edad21.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de secciones congeladas del tejido
	<ol>
<li>Corte las secciones de tejido en un criostato. Coloque los conductores recubiertos de ITO vidrio portaobjetos dentro del criostato21.</li>
		<li>Calentar a la muestra de cerebro de la autopsia de-80 ° C a-22 ° C en el criostato.</li>
		<li>Coloque la cuchilla desechable nueva al criostato para cada experimento. Siempre trate de usar una parte limpia de la hoja.</li>
		<li>Poner los cerebros de autopsia congelados en el escenario junto con una pequeña cantidad de compuesto de OCT (suficiente para cubrir el área central de la etapa; véase Tabla de materiales).</li>
		<li>Seleccione las condiciones para secciones delgadas. Para IMS, utilizar un grosor de 10 – 12 μm para las secciones del cerebro humano. Para IMS y la IHC, cortar secciones de cinco a seis de cada muestra de tejido.</li>
		<li>Cuando la hoja está empezando a cortar el tejido, gire la rueda y la "cara" del bloque hasta que todo el tejido se expone. Si hay una pequeña raya o rasgar a través de la sección, esperar un poco más en el criostato el ajuste de temperatura automáticamente lo corrige. Unos segundos antes de abrir el anti-roll con un pañuelo debajo de la cuenta.</li>
		<li>Inmediatamente Coloque la rebanada de tejido en el lado recubierto ITO de lo portaobjetos de vidrio. Descongelar la rodaja de tejido introduciendo un dedo por debajo de la corredera en el lado no recubierto de ITO. El tejido se pegue a la diapositiva; Asegúrese de que el tejido es tan plano como sea posible con ninguna arruga. Realizar este paso a temperatura ambiente. Nota: Utilizar guantes, máscaras y una bata de laboratorio porque las muestras humanas pueden contener contaminantes biológicos. Cuando todas las secciones se han hecho para el día, limpie el criostato, cepillos y platos con toallitas laboratorio y 200 mL de etanol al 100%.</li>
	</ol></li>
	<li>Enjuague las secciones de tejido
	<ol>
<li>Sumergir las muestras en 40 – 100 mL de etanol al 70% durante 30 s para eliminar los lípidos endógenos y sales inorgánicas. Utilice un vaso jarra de tinción.</li>
		<li>Lavar las muestras con 40 – 100 mL de etanol al 100% durante 30 s, 40 – 100 mL de solución de Carnoy por 3 min, 40 – 100 mL de etanol al 100% durante 30 s, 40 – 100 mL de 0.1% de ácido trifluoroacético (TFA) durante 1 min y 40 – 100 mL de etanol al 100% para 30 s. uso un vaso jarra de tinción. Nota: Solución de Carnoy es un fijador compuesto por seis partes etanol, ácido acético de tres partes y una parte de cloroformo.</li>
		<li>Seco en el vacío durante 30 minutos.</li>
	</ol></li>
	<li>Tratamiento de las secciones de tejido con un vapor de ácido fórmico para una mejor ionización de las proteínas Aβ de tejidos de cerebro de la autopsia
	<ol>
<li>Preparar lo portaobjetos de vidrio horno e incubación para la posterior vaporización con 5 mL de 100% de ácido fórmico. Para lograr un tratamiento satisfactorio con ácido, mantener la humedad del aire en el recipiente de vidrio de incubación en el nivel de saturación a lo largo de este paso y mantener la temperatura a 60 ° C. Colocar los portaobjetos de tejido en el plato de vidrio de incubación evitando la inmersión en el ácido fórmico y tratar durante 6 minutos.</li>
		<li>Tomar una imagen óptica de las muestras usando un escáner de película, escáner de gel, o un microscopio digital, etc. realizar este paso a temperatura ambiente. La alineación de la imagen óptica de las muestras es necesaria cuando el objetivo de la muestra se coloca dentro del instrumento. Por lo general, no será posible reconocer la sección del tejido por debajo de la capa de matriz. Nota: La forma más conveniente para tomar una imagen óptica es utilizar un escáner de oficina. Es una buena idea para guardar la imagen en la carpeta de almacenamiento de datos de imágenes.</li>
		<li>Para correlacionar las imágenes ópticas con las muestras, hacer marcas de guía que son visibles en la imagen óptica y por debajo de la capa de la matriz en la óptica de la cámara. La forma más fácil es punto marcas líquido de corrección al menos tres alrededor de la muestra antes de tomar la imagen óptica.</li>
	</ol></li>
	<li>Aplicación de la matriz
	<ol>
<li>
Preparación de la solución de la matriz
		<ol>
<li>En un microtubo tolerancia a disolventes orgánico, preparar un 10 mg/mL solución SA 50% acetonitrilo (ACN) y 0.1% TFA. Disolver completamente la SA compuesto por Vortex o breve sonicación durante 10 minutos tienda la solución a temperatura ambiente hasta su uso. Nota: Hay tres opciones diferentes para pulverizar matriz: usando un aerógrafo, un atomizador ultrasónico o un rociador automático.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Pulverizar la matriz con un aerógrafo
		<ol>
<li>Realizar la operación a una temperatura constante (20-23 º C) y humedad (40% – 60%). Los parámetros a ajustar para pulverización óptima incluyen el tamaño de la gota, la cantidad de niebla, el ángulo y la distancia entre la boquilla y la sección del tejido y la temperatura de laboratorio y la humedad. Ajustar estas condiciones comprobando los resultados de la microscopia. Nota: Como factores limitantes son el tamaño de los cristales y la homogeneidad de la cobertura de la matriz y la indeseable migración, difusión de los analitos, más pequeño es mejor para el tamaño de la gota. Homogeneidad es también el punto de inspección.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Pulverizar la matriz con un atomizador ultrasónico
		<ol>
<li>Extirpar el tejido para rociar desde el desecador y colocar en la cámara. Asegúrese de que el tejido no está cubriendo la ventana del sensor.</li>
			<li>Iniciar la preparación presionando el botón Start ; tiempo de preparación es generalmente, alrededor de 90 minutos. La preparación se regulará automáticamente por el control del espesor de la capa de matriz y humedad. Una vez finalizada la preparación, quitar la corredera y guárdelo en el desecador durante 15 minutos antes de leer en el instrumento MALDI.</li>
			<li>Limpiar el pulverizador con 2 – 3 mL de MeOH hasta que aparece la cabeza de aerosol limpia el 100%. Nota: Una niebla fina de gotitas de matriz puede hundirse en el tejido por una hoja gravitacional. Se genera un tamaño de gota promedio de 20 μm; todos los diámetros de gota son menos de 50 μm.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Pulverizar la matriz con un rociador automático
		<ol>
<li>Rocíe la solución de la matriz en la superficie del tejido con un rociador automático. Un flujo constante de gas (N2, en 10 psi y de 75 ° C) de la envoltura caliente se entregará conjuntamente con el spray de solución de la matriz. Utilice un sistema de bomba disolvente (fijada en 10 psi y 0,15 mL/min) para ofrecer la solución de la matriz. Nota: Lo más importante, trabajar en un gabinete para evitar cualquier inhalación de aerosoles de la matriz de seguridad. Control de la temperatura y la humedad para reproducir la cristalización de la matriz homogénea.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. MALDI-IMS
<ol><li>
Realizar espectrometría de masas extraordinarias.
	<ol>
<li>Realizar experimentos de proyección de imagen de alto rendimiento y alta resolución espacial con MALDI-IMS equipado con un ND de 10 kHz (355 nm) láser.</li>
		<li>Para mediciones de espectrometría de masas, definir las áreas de tejido usando el software de control de MALDI y software de análisis de datos.</li>
		<li>Adquirir espectros en un modo lineal positivo con una gama total de m/z 2.000 – 20.000 y una resolución espacial de 20 y 100 μm.</li>
		<li>Para hacer la calibración estándar, disolver el estándar de la calibración del péptido y la calibración de proteína estándar con una relación de 1:4 con ácido alfa-ciano-4-hidroxil-cinámico (CHCA) en solución TA30 (TFA ACN:0.1% = 30:70) y luego diluirla 10 x. Coloque 1 μL de calibración estándar de la diapositiva en cuatro lugares diferentes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizando el software de histología molecular (véase Tabla de materiales), superposición de imágenes múltiples para encontrar la correlación espacial de señales diversas, como diversos péptidos Aβ colocalizing en SPs y paredes arteriales.</li>
</ol>3. procesamiento de datos
<ol><li>Alineación espectral, alinee todos los espectros a una lista seleccionada de m/z de una anterior publicación21.</li>
	<li>Importar el conjunto de datos de IMS MALDI en software de análisis estadístico (véase Tabla de materiales) con la resta de la base.</li>
	<li>
Seguimiento de las regiones de interés (ROIs) basada en el conocimiento histológico.
	<ol>
<li>Realizar un análisis univariado para las intensidades medias, desviaciones estándar, la destapadura de m/z-marcadores discriminativos (análisis de ROC), pruebas de hipótesis y el descubrimiento de colocalized valores de m/z.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Crear un mapa de segmentación.
	<ol>
<li>Realizar un análisis multivariante no supervisado para la segmentación espacial de grandes conjuntos de datos y un análisis de componentes para la extracción de las tendencias subyacentes.</li>
		<li>Seleccione ROIs anatómicos basados en las características histológicas, como el parénquima y el espacio subaracnoideo.</li>
		<li>Asignar estructuras como ROIs individuales y correlacionamos con los datos procesados de MS para la identificación de los péptidos asociados que permiten la segmentación de la imagen de la región.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Carlred, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+amyloid-b+pathology+in+transgenic+Alzheimer%E2%80%99s+disease+%28tgArcSwe%29+mice+using+MALDI+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Probing amyloid-b pathology in transgenic Alzheimer’s disease (tgArcSwe) mice using MALDI imaging mass spectrometry.</a> Journal of Neurochemistry. 138, 469-478 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí demostramos un protocolo detallado y los resultados de la visualización de Aβ y de sus isoformas de varios cerebros autopsied con AD y CAA con MALDI-IMS. El perfil de la deposición de Aβs fue cambiado drásticamente de Aβ1-42 a sus variaciones de N y C terminal. Aβ1-41 fue primero identificado y visualizado en los cerebros humanos con el protocolo actual y además se validó con IHC21. Teniendo en cuenta que la morfología de Aβ depositado por IMS con un análisis de alta resolución (20 μm) debe ser en acuerdo con IHC, IMS e IHC igualmente contribuyan a distinguir los depósitos Aβ, por su ubicación y contenido de proteína, así como por su morfología. Como todo el experimento descrito aquí se llevó a cabo en la corteza occipital, estudiando la localización de diferentes especies de beta-amiloide en todas las regiones del cerebro se puede generalizarse con futuros experimentos usando el protocolo actual.
Pasos críticos en el protocolo son los pasos de preparación del tejido para obtener una ionización efectiva de proteínas agregadas en los tejidos del cerebro humano. Una capa de matriz es necesaria para absorber la energía del láser e inducir la desorción y la ionización de los analitos. En este proceso, una sección de tejido entero es homogéneamente recubierta de pequeños cristales. Cocrystallization homogénea del analito con la matriz es crucial para la proyección de imagen de alta sensibilidad y libre de artefactos. Cada uno de los métodos de tres aspersión tiene sus propias ventajas. Capa de aerosol manual es uno de los métodos más frecuentemente utilizados. Un aerógrafo es conveniente; sin embargo, requiere operación experta. Como precisa y reproducible técnica experimental es esencial, utilizando un atomizador ultrasónico o un rociador automático como se describe en los protocolos actuales se recomienda. Con respecto a un atomizador ultrasónico, no se verá afectado por la humedad y la temperatura de la habitación porque se rocía en una cámara. Mientras tanto, con un rociador automático, se obtiene resolución espacial relativamente conservada con buena reproducibilidad. Generalmente, la resolución espacial obtenida con el aumento de tres métodos en el orden 1) aerógrafo, 2) automático y rociador 3) ultrasónico.
Lo más importante, este protocolo fue originalmente generado para detectar y visualizar Aβs en muestras de cerebro humano autopsied. La visualización de Aβs con MALDI-IMS para los ratones de APP23, que se genera como un modelo animal de anuncio basado en la mutación de tipo sueco de aplicación humana, se ha reportado anteriormente por otros con un método existente18,19. Sin embargo, el protocolo anterior aplicado a APP23 no fue suficiente para visualizar Aß en su resolución lateral y sensibilidad. Trabajos anteriores discuten que altas concentraciones de Aβ fuera de los límites de tejido claramente son artefactos en APP23 proyección de imagen con su protocolo18,19. Eso significa que el supuesto 'blur' entre SPs real y IMS imágenes por el paso de extracción de la matriz era inevitable con la proyección de imagen de tipo MALDI. Sin embargo, en el protocolo actual, el desenfoque desapareció y cada espectro había representado cada SP único en el parénquima cerebral.
Como se muestra aquí, podemos rastrear Aβ1-41 por primera vez en anuncio y CAA con MALDI-IMS, así como con IHC, con un anticuerpo específico de nuestra propia generación21. Según el modelo de procesamiento de Aβ, Aβ1-38 deriva Aβ1-45 via Aβ1-42, mientras que la Aβ1-41 deriva de Aβ1-45 por la γ-secretasa escote paso a paso27,28,29,30,31 . Esto significa que el protocolo actual es compatible con este modelo. En cuanto a las limitaciones de esta técnica, debemos tener en cuenta la heterogeneidad de las muestras de cerebro humano autopsia. El paso más crítico, en cierto sentido, es evaluar la autopsia calificado tejido cerebral con la prueba ética. Con el protocolo actual en los tejidos de cerebro autopsia calificado, MALDI-IMS puede seguir individualmente la entera distribución de las moléculas complejas con múltiples modificaciones, así como desconocido factor regula la patogenia de la EA, que están aún por ser define. Además, en la comprensión de la patogenia general de neuropatología diferentes en los cerebros humanos envejecidos, debe ser factible de adoptar MALDI-IMS como un enfoque estándar, en combinación con observaciones clínicas, genéticas y patológicas en enfermedades neurológicas .
Otro paso importante de MALDI-IMS es el proceso de minería de datos desde el conjunto de datos obtenido, que siempre es mucho tiempo. Minería de datos manual de cada distribución pico requiere de los usuarios hacer clic en cada imagen y las distribuciones que se pueden correlacionar a la morfología de la muestra analizada. Segmentación espacial automática puede utilizarse como un primer paso de la minería de datos, proporcionando una visión general del conjunto de datos y permitiendo la rápida detección de características prominentes. En este enfoque, las similitudes entre los espectros de una región dada se determinan estadísticamente y espectros similares se agrupan en un cluster. Todos los píxeles están codificados por colores según su asignación de racimo (figura 5). En el presente estudio de AD/CAA, el área de interés es el espacio de los depósitos de Aβ en placa parenquimal y las estructuras vasculares parenquimatosas y subaracnoideas. Los dos picos distintivos que más validaron con IHC fueron los valores de m/z de Aβ1-40 y Aβ1-4221. Por lo tanto, es fácil encontrar m/z colocalized con Aβ1-40 y Aβ1-42, que ya estaba anotada al N - y c-terminal truncado Aβ, así como péptidos desconocidos, para su posterior análisis.
Weller y sus colegas han reportado que la Aβ se acumula en las paredes de los vasos, más alrededor de las arterias que en venas21. Por otra parte, se ha propuesto que el líquido intersticial (ISF) incluye Aβs excretadas el parénquima cerebral a del nodo de linfa vía un perivasculario drenaje vía22,23,24,25 ,26. El protocolo actual para generar un mapa de segmentación basado en un conjunto de datos de MALDI-IMS en una 20 μm de resolución admite la posible existencia de vías de drenaje perivascularia del cerebro (figura 5), que contribuyen significativamente a la CAA en el anuncio21 , 32. Además, podemos descubrir proteínas marcadoras colocalized con placa y vasculatura subaracnoidea mediante el cálculo de la correlación de los valores de cada m/z. En la comprensión de la patogenia general de neuropatología diferentes en los cerebros humanos envejecidos, debe ser factible adoptar MALDI-IMS como un enfoque de gran alcance en combinación con datos IHC establecidos de clínicos, genéticos y observaciones patológicas neurológicas enfermedades.

Para hacer el diagnóstico y entender la patogenesia de desórdenes neurodegenerativos, identificación molecular precisa de depósitos patológicos es esencial1. En el curso de AD, Aβ se produce para hacer SPs en el parénquima cerebral y depositado en los recipientes antes de la enfermedad Inicio2,3,4,5,6. Mientras Aβ1-42 es el péptido predominante en el SP de cerebros AD, otras variantes Aβ, como N-terminal o c-terminal truncarán o modificación Aβs, también se identifican en afectados AD cerebros7,8,9, 10. Un cuadro completo de las especies de amplia gama de Aß en el cerebro humano, especialmente con el anuncio y cerebral angiopathy amiloideo (CAA)11, ayudará a los científicos entender producción de Aß, metabolismo y depósito.
Como el enfoque clásico de la neuropatología, inmunohistoquímica (IHQ) ha sido el método más concluyente para determinar la ubicación de Aβs en el cerebro tejidos12,13,14,15. En general, IHC no puede distinguir moléculas cuando varios epitopos coexisten simultáneamente. Por el contrario, un análisis proteómico basados en espectrometría de masa emergente es un enfoque valioso especialmente para el análisis de una variedad de especies de Aß en los tejidos del cerebro, que no pueden ser distinguidos con anticuerpos16,17. El análisis convencional basada en espectrometría de masa de muestras de inmuno-precipitado y lisados cerebro es incapaz de detectar pequeños péptidos Aβ y pierde información de distribución de Aβ en el tejido cerebral.
En trabajos anteriores, ha tenido éxito usando un modelo animal transgénico de AD, como APP23 visualización de depósitos Aβ en el cerebro de ratón. Sin embargo, este proceso queda por los adelantos técnicos para comparar IMS e IHC con respecto a la sensibilidad y resolución18,19,20. Neuropatología del anuncio debe ser estudiado en cerebros humanos, y utilizamos tecnología MALDI-IMS en los tejidos del cerebro humano autopsia para obtener proteína completa cartografía21. Para ello, hemos desarrollado un protocolo para un tipo avanzado de espectrometría de masas que tiene ventajas en su rapidez, sensibilidad y reproducibilidad.

<table><tbody><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio para microscopio recubierto de óxido de indio y estaño (ITO)</td><td>Bruker Daltonics</td><td>#237001</td><td></td></tr><tr><td>Blade (desechable)</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania</td><td>#117394</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compound</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania</td><td>FSC 22 Blue</td><td></td></tr><tr><td>Scanner</td><td>EPSON</td><td>GT-980</td><td></td></tr><tr><td>Aerógrafo</td><td>GSI Creos</td><td>PS274</td><td></td></tr><tr><td>Compresor</td><td>MRHOBBY</td><td>Mr.Linear Compresor L5</td><td></td></tr><tr><td>Pulverizador ultrasónico</td><td>Bruker Daltonics</td><td>ImagePrep</td><td></td></tr><tr><td>Pulverizador automático</td><td>HTX Technologies</td><td>TM Pulverizador</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de escaneo láser confocal</td><td>Carl Zeiss Inc.</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento MALDI de ultra alta velocidad</td><td>Bruker Daltonics</td><td>rapifleX MALDI Tissuetyper</td><td></td></tr><tr><td>MALDI software de control Bruker</td><td>Daltonics</td><td>FlexControl 3.8</td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis de datos</td><td>Bruker Daltonics</td><td>FlexImaging 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Software de histología molecular</td><td>SCiLS, Bremen, Alemania</td><td>SciLS Lab 2016a</td><td></td></tr><tr><td>Software estadístico</td><td>SCiLS, Bremen, Alemania</td><td>SciLS Lab 2016a</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sinapínico (SA)</td><td>Nacalai tesque</td><td>30494-91</td><td></td></tr><tr><td>Ácido alfa-ciano-4-hidroxi-cinámico (CHCA)</td><td>Wako</td><td>037-19261</td><td></td></tr><tr><td>Estándar de calibración</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos IgG anti-ratón biotinilados</td><td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos IgG anti-conejo biotinilados</td><td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avidina y complejo HRP biotinilado.</td><td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td> Kit <td></td><td>Vectastain Elite ABC</td></tr><tr><td>3,3-diaminobenzidina (DAB)</td><td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td><td>Kit</td><td></td> Vectastain Elite ABC</tr></tbody></table>

visualización de depósitos β amiloide en el cerebro humano con desorción láser asistida por matriz/ionización del spectrometry total de la proyección de imagen

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

La neuropatología de la enfermedad de Alzheimer (EA) se caracteriza por la acumulación y agregación de los péptidos β amiloide (Aß) en placas extracelulares del cerebro. Los péptidos Aß, compuestos de 40 aminoácidos, se generan a partir de proteínas precursoras del amiloide (APP) por β - y γ-secretases. Aβ se deposita no sólo en el parénquima cerebral, sino también en leptomeningeal y paredes de los vasos cerebrales, conocidas como angiopathy amiloideo cerebral (CAA). Mientras que se identificaron una gran variedad de péptidos Aβ, detallada de la producción y distribución de los péptidos Aβ en tejidos patológicos de la EA y CAA no han sido totalmente abordadas. Aquí, desarrollamos un protocolo de láser asistida por matriz desorción/ionización-basado proyección de imagen espectrometría de masas (MALDI-IMS) en tejidos de cerebro humano autopsia para obtener cartografía de proteína completa. Para este propósito, se obtuvieron especímenes humanos corticales desde el Banco de cerebros en el Instituto Metropolitano de Gerontología de Tokio. Cryosections congelados se cortan y transferidos al óxido de estaño indio (ITO)-cubierto de laminas de vidrio. Espectros son adquiridos mediante el sistema MALDI con una resolución espacial de hasta 20 μm. ácido Sinapinic (SA) es uniformemente depositada en la diapositiva usando un rociador manual o automático. Con las ventajas técnicas actuales de MALDI-IMS, se puede obtener un conjunto de datos típico de varias especies de Aß en las mismas secciones de cerebros autopsied humanos sin sondas específicas. Además, alta resolución (20 μm) proyección de imagen de un cerebro de AD y severa muestra de CAA muestra claramente que Aβ1-36 Aβ1-41 fueron depositados en los vasos de leptomeningeal, mientras Aβ1-42 y Aβ1-43 fueron depositados en el parénquima cerebral como la placa senil (SP). Es factible adoptar un enfoque estándar en combinación con observaciones clínicas, genéticas y patológicas en la comprensión de la patología de la EA, CAA, MALDI-IMS y otras enfermedades neurológicas basan en la estrategia actual.

Pacientes con EA esporádicos con CAA (n = 5; edad media = 83,2 y) y de sujetos con placa senil gratis (O SP) y CAA (n = 5; edad media = 77.2 y) fueron analizados (tabla 1). Los fenotipos de la CAA de paciente #3 eran más prominentes en este estudio. Distribuciones de Aβ1-40 y Aβ1-42 depósitos en el tejido cerebral del paciente #3 fueron visualizadas con MALDI-IMS (figura 1). No había ninguna señal significativa en cerebros de control nonpathological (pacientes #9 y #10), como se muestra en la figura 1. Aquí, MALDI-IMS claramente había visualizado que Aβ1-42 preferencial fue depositado como SPs en el parénquima cerebral. Por el contrario, Aβs más cortos, como Aβ1-36 1-41, fueron depositados preferentemente en las áreas vascular leptomeníngea (figura 1).
Distribuciones de Aβ40 y Aβ42 más fueron validadas con IHC usando secciones congeladas adyacentes de los tejidos. El anticuerpo anti-Aβ40 etiquetado CAA (flechas en la figura 2B), que está en claro contraste con la distribución de Aβ42 en el parénquima cerebral como SPs. Para Aβ1-41, son los primeros en detectar este fragmento en cerebros humanos, y hemos generado anticuerpos específicos que pueden distinguir Aβ41 de Aβ40 andAβ4221.
La resolución espacial de la MALDI-IMS es generalmente el factor más importante para mejorarse. En la figura 1 y figura 2 muestran MALDI-IMS con resolución de pitch de 100 μm y obtener un perfil general de distribución para un área relativamente amplia21. Es difícil definir la deposición amiloidea en el espacio subaracnoideo, incluyendo la estructura vascular. Estructuras del tejido fino de vasos subaracnoideas y la superficie de la corteza, proyección de imagen de alta resolución MALDI (40 μm: figura 3; 20 μm: figura 4 y figura 5) se llevó a cabo. Como resultado, MALDI-IMS demostró claramente que Aβs más cortos, como Aβ1-36 1-41, se distribuyen en las paredes de las arterias, que es comparable con IHC.
MALDI-IMS demostró la distribución detallada de Aβx-40 y Aβx-42 (x = 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 11pE) en AD con cerebro de CAA moderada. Por ejemplo, mientras Aβx-40 especies mostraron un perfil similar de distribución Aβ1-40, Aβx-42 especies mostraron un patrón de distribución diferente con Aβ1-4221. El protocolo actual, imágenes de ion sola de los péptidos Aβ individuales observados con MALDI-IMS se asignan a especies Aβ. Por el contrario, adquirió la imagen de datos pueden ser investigados utilizando estadísticas multivariadas sin supervisión con el fin de obtener la segmentación de regiones anatómicas de interés para el análisis posterior de las proteínas. Figura 5 muestra un mapa de segmentación obtenido bisecting k-means análisis aplicado a la misma sección del paciente #321. Este método de agrupamiento identificó con éxito placa-como las estructuras en el parénquima (azul en la figura 5) y estructuras vasculares en el espacio subaracnoideo (verde en la figura 5). Es interesante encontrar una pequeña área circular en el parénquima, que se detecta sólo en una pequeña arteriola en el parénquima, así como en el espacio subaracnoideo (púrpura en la figura 5). Esto se verifica por imágenes solo iones de estos péptidos Aβ individuales en la figura 5-5F.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig1.jpg"> Figura 1: sección del cerebro MALDI-IMS de un anuncio/CAA congelado. Varios c-terminal truncado Aβ péptidos en el anuncio que acompaña a CAA severa (paciente #3) se visualizan en el panel de la izquierda y los controles (paciente #9 a la derecha y el paciente #10 a la izquierda en todas las imágenes) en el panel derecho. Aβ1-36 Aβ1-41 preferencial se depositan en los vasos sanguíneos de leptomeningeal, mientras Aβ1-42 y Aβ1-43 se depositan en el parénquima cerebral como placas seniles en el caso de los cerebros de la #3, mientras que no hay señal en los pacientes control (casos #9 y #10). Resolución = 100 μm. Barra de escala = 5 mm. Esta figura se ha modificado con permiso de Kakuda et al21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig2.jpg"> Figura 2: MALDI-IMS de congelados AD/CAA del cerebro las secciones y las secciones adyacentes de la corteza occipital de cerebro AD. (A - C) el congelados secciones del cerebro AD/CAA (D y E) las secciones adyacentes de la corteza occipital de cerebro AD fueron manchados inmune y centradas en arteriola y parénquima cerebral, usando los anticuerpos contra Aβ40 (D: BA27) o Aβ42 (E: anti-Aβ42 policlonal). Ambos análisis demostraron que Aβ40 se deposita preferentemente en leptomeningeal vasos sanguíneos (flechas en el panel D) y arteriolas en el espacio subaracnoideo y al parénquima cerebral formando CAA. Por el contrario, Aβ42 se deposita principalmente en SPs. Para IMS, resolución = 100 μm. Barra de escala = 5 mm (A, By C) = 5 mm, 500 (D y E). Esta figura se ha modificado con permiso de Kakuda et al21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig3.jpg"> Figura 3: Maestría-IMS de congelados AD/CAA cerebro secciones (paciente #3) con una resolución de 40 μm. Varios c-terminal y N-terminal truncarán y modificación péptidos Aβ en AD acompañando a CAA severa (paciente #3). Aβ1-36 Aβ1-41 preferencial se depositan en los vasos sanguíneos de leptomeningeal, mientras Aβ1-42 y Aβ1-43 se depositan en el parénquima cerebral como placas seniles. Barras de escala = 1 mm (A-B), 2 mm (parte superior izquierda). Resolución = 40 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig4.jpg"> Figura 4: MALDI-IMS de congelados AD/CAA cerebro secciones (paciente #3) con una resolución de 20 μm. Este panel muestra varios c-terminal y N-terminal truncarán y modificación péptidos Aβ en AD acompañando a CAA severa (paciente #3). Aβ1-36 Aβ1-41 preferencial se depositan en los vasos sanguíneos de leptomeningeal, mientras Aβ1-42 y Aβ1-43 se depositan en el parénquima cerebral como placas seniles. Barras de escala = 200 μm (a, b, c), 1 mm (parte superior izquierda). Resolución = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig5.jpg"> Figura 5: mapa de segmentación, obtenido por MALDI-IMS de una sección congelada de cerebro AD, revela supuesta placa senil, estructuras de grandes vasos subaracnoidea y pequeñas arteriolas parenquimales. (A) mapa de segmentación obtenida de un análisis multivariante de la imagen de datos de MALDI-IMS. (B) Bisecting k-significa Análisis de clustering basado en identificaron placa-como y buque-como las estructuras en la corteza occipital. Los clusters y subestructuras y sus relaciones se muestran como nodos (e.g.,1-0-0). (C) Aβ distinto patrones de localización de péptido parecido a placas (azul), los vasos subaracnoideos (verde) y estructuras de arteriola (rojo). Tenga en cuenta que unos racimos de rojo también se distribuyen en el espacio subaracnoideo. Esto se verifica por imágenes solo iones de estos péptidos Aβ individuales con una resolución de 20 μm: (D) Aβ 1-40, (E) Aβ 1-41 y (F) Aβ 1-42. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Caso</td>
			<td>Género</td>
			<td>Edad a la muerte</td>
			<td>Braak SP</td>
			<td>CAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>M</td>
			<td>83</td>
			<td>C</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>M</td>
			<td>88</td>
			<td>C</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>M</td>
			<td>84</td>
			<td>C</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>M</td>
			<td>78</td>
			<td>C</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>M</td>
			<td>83</td>
			<td>C</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>M</td>
			<td>84</td>
			<td>O</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>M</td>
			<td>78</td>
			<td>O</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>M</td>
			<td>70</td>
			<td>O</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>M</td>
			<td>73</td>
			<td>O</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>M</td>
			<td>81</td>
			<td>O</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: datos clínicos y patológicos de AD con CAA casos y temas de SP O de. Especímenes humanos corticales para IMS y la IHC se obtuvieron en el Banco de cerebros en el Instituto Metropolitano de Gerontología de Tokio. Cada muestra de cerebro fue sacado de la corteza occipital de pacientes con EA cinco y cinco controles de edad comparable. La extensión de la deposición amiloidea como muestra de un anticuerpo monoclonal Aβ se definió por etapas Braak SP (amiloide). En fase O, no hay casi placas seniles en el isocortex. En etapa C, prácticamente todas las áreas de isocortical son afectadas. Cerebros de AD son invariables en etapa C. Esta tabla ha sido modificada con permiso de Kakuda et al21.

La proyección de imagen molecular con láser asistida por matriz basada en desorción/ionización de espectrometría de masas (MALDI-IMS) permite la asignación simultánea de múltiples analitos en muestras biológicas. Aquí, presentamos un protocolo para la detección y visualización de la proteína β amiloide en los tejidos cerebrales de la enfermedad de Alzheimer y las muestras de la Angiopatía amiloide cerebral usando MALDI-IMS.

Visualización de depósitos β amiloide en el cerebro humano con desorción láser asistida por matriz/ionización del Spectrometry total de la proyección de imagen

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

La principal contribución de nuestro artículo es que hemos explorado un paisaje preciso y fino de patología beta amiloide del cerebro de la enfermedad de Alzheimer con la tecnología de imagen de la espectrometría de masas por imágenes MALDI. Logramos avances tecnológicos mediante la generación de un protocolo especial con pretratamiento de ácido fórmico de los portaobjetos tisulares. Después de MALDI-IMS, se generan mapas de segmentación y se realizan cálculos para descubrir nuevas proteínas marcadoras o péptidos colocados con placa y vasculatura subaracnoidea.Obtener especímenes corticales humanos para IMS de cerebros que fueron removidos, procesados y almacenados a menos 80 grados Celsius dentro de las ocho horas post-mortem. Tome el espécimen cerebral de la corteza occipital de los pacientes con AD y controles anticuados. Para cortar las secciones de tejido en un criostato, en primer lugar el óxido de estaño de indio conductor o el vidrio del microscopio recubierto de ITO se desliza dentro del criostato.Caliente el espécimen cerebral de la autopsia de menos 80 grados Celsius a menos 22 grados Celsius dentro del criostato. Adjunte una nueva cuchilla desechable al criostato para cada experimento. Siempre trate de usar una parte limpia de la cuchilla.Ponga los cerebros de la autopsia congelada en el escenario junto con una pequeña cantidad de compuesto óptimo de temperatura de corte. Para ims e inmunohistoquímica, corte de cinco a seis secciones de cada muestra de tejido. Cuando la hoja está empezando a cortar el tejido, gire la rueda y dé la cara al bloque hasta que todo el tejido quede expuesto.Si hay una pequeña raya o desgarro en la sección, espere en el criostato hasta que el ajuste de temperatura lo arregle automáticamente. Cuente unos segundos antes de abrir el anti-roll con un tejido debajo. Coloque inmediatamente la rebanada de tejido en el lado recubierto de ITO del portaobjetos de vidrio.Descongele la rebanada de tejido colocando un dedo debajo de la diapositiva en el lado no recubierto de ITO. El tejido se pegará a la diapositiva. Asegúrese de que el tejido sea lo más plano posible sin arrugas.Para enjuagar las secciones de tejido, sumerja las muestras en 40 a 100 mililitros de 70%etanol en un frasco de tinción de vidrio durante 30 segundos para eliminar los lípidos endógenos y las sales inorgánicas. Lave las muestras utilizando la secuencia de lavado enumerada en el protocolo de texto. A continuación, seque las muestras al vacío durante 30 minutos.Ahora, tratar las secciones del tejido con un vapor de ácido fórmico para una mejor ionización de las proteínas beta amiloide a partir del tejido cerebral de la autopsia. Para ello, preparar el horno a 60 grados centígrados y un plato de vidrio de incubación con cinco mililitros de ácido 100% formético. Mantenga la humedad del aire en el plato de vidrio de incubación a nivel de saturación.Coloque los portaobjetos en el plato de vidrio de incubación mientras evita la inmersión en el ácido fórmico y tratar durante seis minutos. Tome una imagen óptica de las muestras utilizando un escáner de película fotográfica, un escáner de gel o un microscopio digital. Realice este paso a temperatura ambiente.La alineación de la imagen óptica de las muestras es necesaria cuando el objetivo de la muestra se coloca dentro del instrumento. Por lo general, no será posible reconocer la sección de tejido debajo de la capa de matriz. Para correlacionar las imágenes ópticas con las muestras, haga marcas de guía que sean visibles tanto en la imagen óptica como debajo de la capa de matriz en la óptica de la cámara.La forma más fácil es detectar al menos tres marcas de fluido de corrección alrededor de la muestra antes de tomar la imagen óptica. Para rociar la matriz con un pulverizador ultrasónico, retire el tejido que se va a rociar del desecador y colóquelo en la cámara. Asegúrese de que el tejido no cubra la ventana del sensor.Inicie la preparación pulsando el botón Inicio. Por lo general, el tiempo de preparación es de alrededor de 90 minutos. La preparación se regulará automáticamente mediante el control del espesor y la humedad de la capa de matriz.Alternativamente, para pulverizar la solución de matriz en la superficie del tejido con un pulverizador automático, utilice un sistema de bomba de disolvente establecido en 10 psi y 0,15 mililitros por minuto para entregar la solución de matriz. Un flujo constante de gas de vaina calentada se entregará conjuntamente con el spray de solución de matriz. Realice experimentos de imágenes de alto rendimiento y alta resolución espacial con MALDI-IMS.Para la medición de espectrometría de masas, defina las áreas de tejido utilizando el software de control MALDI y el software de análisis de datos. Adquiera espectros en un modo lineal positivo con un rango de relación entre masa y carga de 2.000 a 20.000 y una resolución espacial de 20 y 100 micras. Para hacer el estándar de calibración, disuelva el estándar de calibración de péptidos y el estándar de calibración de proteínas en una proporción de uno a cuatro con la solución CHCA y TA30 y luego diluya 10 veces.Coloque un microlitro de calibración estándar en la diapositiva en cuatro ubicaciones diferentes. Usando software de histología molecular, superponga múltiples imágenes de señal para encontrar la correlación espacial de varias señales tales como diferentes péptidos beta amiloidees colocando en placas seniles y paredes arteriales. La angiopatía amiloide cerebral o fenotipos CAA del paciente número tres fueron los más prominentes en este estudio.MALDI-IMS del tejido cerebral de este paciente visualizó claramente que el amiloide beta 1-42 y el amiloide beta 1-43 fueron depositados preferentemente como placas seniles en el parénquima cerebral. Por el contrario, betas amiloide más cortas como el amiloide beta 1-36 a 1-41 se depositaron preferentemente en las áreas vasculares leptomeningeales. No hubo señales significativas en el control no patológico.Las distribuciones de amiloide beta 1-40 y amiloide beta 1-42 se validaron aún más con inmunohistoquímica utilizando secciones congeladas adyacentes de los tejidos. El anticuerpo antiamimoides beta 1-40 etiquetado COMO AA y el amiloide beta 1-40 revelado se deposita preferentemente en los vasos sanguíneos leptomeningeales, lo que contrasta claramente con la distribución de amiloide beta 1-42 en el parénquima cerebral como placas seniles. Aquí se muestra un mapa de segmentación obtenido con un análisis k-means bisectriz aplicado a la misma sección del paciente número tres.Este método de agrupamiento identificó con éxito estructuras similares a placas en el parénquima y estructuras vasculares en el espacio subaracnoideo. Es interesante encontrar una pequeña zona circular en el parénquima que se detecta justo alrededor de una pequeña arteriola en el parénquima, así como en el espacio subaracnoideo. Esto es verificado por imágenes de iones individuales de estos péptidos beta amiloide individuales.Hay un límite para rastrear una amplia gama de betas amiloideas simultáneamente incluso si se utilizan los anticuerpos específicos. Aquí, mostramos la distribución de beta amiloide en cerebros humanos mediante el método de espectrometría de masas de imágenes MALDI de vanguardia. Creemos que esta contribución hace un avance en la investigación de la enfermedad de Alzheimer porque este informe ofrece la caracterización del conjunto completo de proteínas beta amiloideas en cerebros autopsiados humanos.El hallazgo más impresionante es que sólo una sola alteración de aminoácidos en el terminal C de la proteína beta amiloide hace un cambio drástico en su distribución. Los pasos de preparación del tejido son críticos para obtener una ionización efectiva de las proteínas agregadas en el tejido cerebral humano. Cocrystallización homogénea del analito con matrices cruciales para la alta sensibilidad y la imagen sin artefactos.

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Visualización de depósitos β amiloide en el cerebro humano con desorción láser asistida por matriz/ionización del Spectrometry total de la proyección de imagen (Video) | JoVE Journal

Visualización de depósitos β amiloide en el cerebro humano con desorción láser asistida por matriz/ionización del Spectrometry total de la proyección de imagen

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