Detección de la pequeña GTPasa Prenilación y GTP obligatorio usar membrana fraccionamiento y GTPasa-linked Immunosorbent Assay
11 de noviembre de 2018
Aquí se describe un protocolo para investigar la Prenilación y guanosina-5'-trifosfato (GTP)-carga de la GTPasa Rho. Este protocolo consta de dos métodos detallados, es decir, ensayo de fraccionamiento de la membrana y un GTPasa-ligado del inmunosorbente. El protocolo puede ser usado para medir la Prenilación y GTP carga de diferentes otras GTPasas pequeñas.
La pequeña Rho GTPase es una proteína de una superfamilia con diversa función celular. Por ejemplo, estas proteínas están involucradas en la regulación del destino celular, la respuesta celular a un estrés, la motilidad celular y el ciclo celular. La actividad de una pequeña proteína Rho GTPase está regulada por modificación post-traduccional.
Estas modificaciones están implicadas en una estricta regulación de su actividad. Por ejemplo, la prenilación prometila y la unión GTP son la modificación post-traducción más importante de estas proteínas. Mi laboratorio ha modificado y desarrollado recientemente un método sencillo para investigar la modificación post-traduccional de estas proteínas superfamiliares.
Para ello, hemos utilizado 251 líneas celulares de glioblastoma, y dirigidos a ellas con simvastatina, y medido la modificación post-traduccional de estas proteínas. El método implica fraccionamiento subcelular y proteína unida a GTP a esta superfamilia de proteínas. Para este propósito, hemos utilizado la localización de RhoA, y GTP unido a RhoA para medir la modificación post-traduccional de esta proteína.
Retire las células de la incubadora de 37 grados. Mira las células bajo el microscopio para confirmar la confluencia. Las células deben estar entre el 70 y el 80 por ciento de confluencia.
Lave las células una vez con PBS frío. Agregue cinco mililitros de EDTA y vuelva a colocar las células en la incubadora de 37 grados durante cinco minutos. Después de cinco minutos de incubación, recoja EDTA con células en un tubo de 15 mil.
Coloque el tubo en una caja de hielo y proceda a la centrífuga. Configure la centrífuga a 1500 g a cuatro grados, y gire las celdas durante cinco minutos. Después del giro, retire el supernate y agregue un mililitro de PBS frío.
Triturar bien las células. Transfiera la mezcla celular a un nuevo tubo de 1,5 mililitros etiquetado. Después de la transferencia, proceda a la centrífuga.
Establezca la centrífuga en 1500 g a cuatro grados y gire las celdas durante cinco minutos. Compruebe el tamaño del pellet. Coloque las muestras en hielo.
Deseche el supernate por completo, sin alterar el pellet. Agregue el búfer uno. Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
Proceder a la sonicación. Ajuste el sonicador durante cinco ciclos, cinco segundos cada uno, y repita tres veces. La sonicación debe continuar sobre hielo, pero no se muestra en el video, con fines ilustrativos.
Proceda a la ultracentrífuga. Utilice una ultracentrífuga para separar los homogeneizas celulares en fracciones citoplasmáticas y de membrana. Ajuste la centrífuga a 100.000g durante 35 minutos, a cuatro grados.
Compruebe el tamaño del pellet. Separe el supernate. Recoger el supernado completamente, teniendo cuidado de no molestar el pellet.
El supernato es la fracción citosólica. Coloque el supernate en un tubo recién etiquetado. Añadir búfer dos al pellet.
Esta es la fracción de membrana. Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Proceda a la determinación de proteínas y a la preparación de la muestra Western blot.
Cargue las muestras en un SDS-PAGE usando un gel del 15%. Confirmar la transferencia de proteínas mediante la visualización del marcador de peso molecular, o utilizando una mancha De Ponceau. Añadir anticuerpos primarios para el análisis de inmunoblotting.
Usamos Rac1/2/3, Cdc42 y RhoA. Saque las placas de cultivo de la incubadora. Mira las células bajo el microscopio para confirmar la confluencia.
Las células deben ser de 70 a 80%confluentes. Coloque la placa de cultivo sobre hielo. Aspirar los medios y lavar las células con pH PBS frío al 7.2.
Aspirar el PBS. Incline las placas sobre hielo durante un minuto adicional para eliminar todos los restos de PBS. El PBS residual afecta negativamente a este ensayo.
Lisos las células en un volumen adecuado de tampón de lelisis helada que contiene proteasa e inhibidores de la fosfatasa. La célula de cosecha se elate con el rascador de células. Incline la placa de cultivo para esta técnica.
Transfiera el izado a un tubo crio de criolizado etiquetado y helado, y manténgalo en hielo. Mezclar bien con un vórtice. Conservar 10 microlitros del izado para un ensayo proteico.
Enganche congelar el izado de la célula restante en nitrógeno líquido. Transfiera los criotubos congelados a un congelador menos 80. Almacene estas muestras.
Tenga en cuenta que las muestras no deben almacenarse durante más de 14 días. Prepare los dosatos celulares de las otras placas de cultivo repitiendo los pasos uno a ocho, uno por uno. Trabaje rápidamente y nunca deje las muestras en hielo durante más de 10 minutos.
Nunca maneje todas las placas de cultivo simultáneamente. Mida la concentración de proteínas. Calcular el volumen de tampón de lelisis para normalizar la concentración de proteína entre las muestras.
Nota: un miligramo por mililitro es generalmente el mejor, sin embargo, 0.3 a dos miligramos por mililitro puede ser detectable. Prepare un control en blanco añadiendo 60 microlitros de búfer de lelisis y 60 microlitros de búfer de unión a un microtubo. Preparar un control positivo añadiendo 12 microlitros de proteína de control Rho, 48 microlitros de tampón de lysis y 60 microlitros de tampón de unión.
Saque la placa de afinidad Rho de su bolsa y colóquela sobre hielo. Disolver el polvo en los pozos con 100 microlitros de agua destilada helada. Mantén el plato sobre hielo.
Descongelar las líteos de la célula congelada en un baño de agua establecido a 25 grados centígrados. Agregue el volumen calculado de tampón de lyis fría a cada muestra para normalizar la concentración de proteínas. Transfiera 60 microlitros de muestras de hielo frío normalizadas a microtubos y agregue 60 microlitros de búfer de unión.
Mezcle bien y manténgase en hielo. Retire completamente el agua de la microplaca mediante un movimiento vigoroso, seguido de cinco a siete grifos duros en una estera de laboratorio. Agregue 50 microlitros de las muestras normalizadas, un control en blanco y un control positivo a los pozos por duplicado.
Coloque la placa sobre un agitador orbital durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Nota: la velocidad del agitador debe ajustarse a 300 rpm. Limpie las muestras de la placa parpadeando y lave dos veces con 200 microlitros de tampón de lavado a temperatura ambiente.
Retire vigorosamente el tampón de lavado de los pozos después de cada lavado parpadeando, seguido de tocar, y mantenga la placa en el banco a temperatura ambiente. Añadir 200 microlitros de tampón de antigen a temperatura ambiente en cada pozo, e incubar a temperatura ambiente durante dos minutos. Deslice la solución de los pozos y lave tres veces con 200 microlitros de tampón de lavado a temperatura ambiente.
Añadir 50 microlitros de uno a 250 anticuerpos primarios anti-RhoA a cada pozo. Coloque la placa en un agitador orbital durante 45 minutos a 300 rpm, ajustado a 25 grados Celsius. Deslice la solución de los pozos y lave tres veces con 200 microlitros de tampón de lavado a temperatura ambiente.
Añadir 50 microlitros de uno a 250 anticuerpos secundarios anti-RhoA a cada pozo. Coloque la placa encima de un agitador orbital durante 45 minutos, a 300 rpm, ajustado a 25 grados centígrados. Prepare el reactivo de detección HRP mezclando volúmenes iguales de Reactivo A y Reactivo B.Flick la solución de cada pozo, y lave tres veces con 200 microlitros de tampón de lavado a temperatura ambiente.
Agregue 50 microlitros de reactivo de detección de HRP recién preparado a cada pozo. Lea la señal de luminiscencia en un plazo de tres a cinco minutos para obtener una señal máxima. Analice los resultados utilizando un paquete de software adecuado.
Nuestros resultados muestran que la simvastatina disminuyó la localización de RhoA en la fracción de membrana. Lo que aumentó es la acumulación en la fracción citosólica. Curiosamente, simvastatina aumentó GTP ligado a la RhoA.Why?
Esperamos que la simvastatina disminuya esta actividad. Es muy importante que miden tanto la localización subcelular de esta proteína, y miden la unión GTP a esta proteína para tener una evaluación final de la actividad de los pequeños Rho GTPases.
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Resumen
Este artículo presenta un protocolo para investigar la prenilación y la carga de GTP de las proteínas GTPasa Rho. Los métodos descritos incluyen la fraccionación de membranas y un inmunoensayo ligado a inmunosorbente tipo ELISA para GTPasas, que puede aplicarse a diversas GTPasas pequeñas.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Celular
- Bioquímica
Antecedentes
- Las proteínas pequeñas GTPasas Rho forman parte de una superfamilia con diversas funciones celulares.
- Regulan el destino celular, las respuestas al estrés, la motilidad y el ciclo celular.
- Su actividad se regula estrechamente mediante modificaciones postraduccionales, como la prenilación y la unión de GTP.
- Comprender estas modificaciones es fundamental para elucidar sus funciones en los procesos celulares.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método sencillo para investigar las modificaciones postraduccionales de las proteínas pequeñas Rho GTPasas.
- Medir la prenilación y la carga de GTP en estas proteínas.
- Mejorar el entendimiento de los mecanismos reguladores que gobiernan la actividad de las Rho GTPasas.
Métodos Utilizados
- Fraccionamiento de membranas para aislar GTPasas.
- Ensayo inmunosorbente ligado a GTPasas para cuantificar la carga de GTP.
- Aplicación del protocolo a diversas GTPasas pequeñas.
- Análisis de modificaciones postraduccionales.
Resultados principales
- Aislamiento y análisis exitosos de las proteínas Rho GTPasa.
- Se demostró la eficacia de los métodos desarrollados.
- Proporcionó información sobre los procesos de prenilación y carga con GTP.
- Facilitó investigaciones adicionales sobre las GTPasas pequeñas en funciones celulares.
Conclusiones
- El protocolo ofrece un enfoque confiable para estudiar las modificaciones de las proteínas Rho GTPasa.
- Se puede adaptar para otras GTPasas pequeñas, ampliando así su aplicabilidad.
- Comprender estas modificaciones puede proporcionar conocimientos sobre sus funciones reguladoras en las células.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La detección precisa de la prenilación de las proteínas Rho GTPasa y la unión de GTP es fundamental para reducir riesgos en programas tempranos de descubrimiento dirigidos a la señalización celular y la regulación del citoesqueleto. Este protocolo permite la evaluación cuantitativa de modificaciones postraduccionales que impactan directamente la validación de dianas y la confianza mecanicista en modelos relevantes para la enfermedad. La integración de estos ensayos apoya una selección robusta de carteras y orienta las decisiones de avance o interrupción en las líneas de oncología y neurobiología.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de los estados de activación de las proteínas G de tipo Rho mediante el análisis de la prenilación y la unión a GTP.
- Apoya la desactivación mecanicista al distinguir entre proteínas asociadas a la membrana y las presentes en el citosol.
- Proporciona datos funcionales de validación del blanco para el descubrimiento de fármacos centrado en rutas metabólicas.
- Facilita la predicción confiable de la modulación de la señalización de las proteínas G pequeñas en modelos de enfermedades.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona lecturas cuantitativas validadas de la actividad de las GTPasas adecuadas para la selección de compuestos.
- Normaliza los procedimientos de fraccionamiento de membranas y de ensayos inmunosorbentes para garantizar la reproducibilidad.
- Permite formatos de ensayo escalables para la reutilización entre proyectos en una misma plataforma.
- Posibilita la evaluación confiable de los efectos de los compuestos sobre los estados de modificaciones postraduccionales.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con sistemas relevantes para la enfermedad mediante la medición de la actividad de las GTPasas en líneas celulares de glioblastoma.
- Proporciona continuidad traslacional desde modelos celulares hasta la validación preclínica de la modulación de rutas.
- Informa decisiones de avance ajustadas al riesgo al vincular resultados bioquímicos con puntos finales fenotípicos.
- Fortalece la desestimación predictiva para la selección de candidatos en investigación oncológica y del sistema nervioso central.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método conecta el descubrimiento inicial y la investigación preclínica al permitir lecturas cuantitativas y mecanicistas de la actividad de las proteínas GTPasas Rho. Está diseñado para su uso desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos líder y estudios traslacionales.
- Biología de Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre el impacto funcional de las modificaciones postraduccionales en modelos de enfermedades.
- Cribado: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles de la actividad de las GTPasas en respuesta a la modulación farmacológica.
- Análisis: Ofrece mediciones de localización en membrana frente a citosólica y de unión a GTP para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Permite la continuidad de conocimientos mecanicistas desde ensayos en células hasta modelos preclínicos.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un flujo de trabajo estandarizado y adaptable para diversos objetivos de pequeñas GTPasas en diferentes programas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, la reproducibilidad y la escalabilidad de los ensayos de modificaciones postraduccionales.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance/no avance y la eficiencia del capital al proporcionar puntos finales bioquímicos robustos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de programas dirigidos a vías de pequeñas GTPasas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en fraccionamiento celular, inmunotransferencia e inmunoensayos cuantitativos por inmunoadsorción.
- Necesita acceso a ultracentrífugas, lectores de placas y reactivos de anticuerpos validados.
- Exige una estandarización rigurosa entre equipos para obtener resultados reproducibles.
- Adaptable a diversas líneas celulares y miembros de la familia de proteínas G pequeñas con optimización del protocolo.
- Debe gestionarse la estabilidad y las limitaciones de almacenamiento de las muestras para garantizar la integridad de los datos.
