Aislamiento de células madre intestinales y de la cultura en un modelo porcino de isquemia Intestinal pequeño segmentaria

El objetivo general de este procedimiento es evaluar los efectos de la isquemia intestinal sobre las células madre epiteliales intestinales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de las células madre, como la forma en que las células madre resisten las lesiones y contribuyen a la reparación después de una lesión isquémica. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de un modelo animal de gran tamaño que puede utilizarse para el estudio y la reparación de enfermedades intestinales clínicas.

Amy Stieler Stewart, estudiante de posgrado, y John Freund, especialista en investigación de mi laboratorio, harán una demostración del procedimiento. Comience usando una hoja de bisturí para hacer una incisión de ocho a 10 centímetros en la línea media ventral en el abdomen centrada en el ombligo de un cerdo cruzado Yorkshire de ocho a 10 semanas de edad. Localiza el yeyuno, aproximadamente 40 centímetros orales a la unión ileocecal.

Ligar circunferencialmente el intestino dos veces para delinear asas de yeyuno de 10 centímetros de largo con un centímetro entre cada ligadura. Cree dos bucles por punto de tiempo de isquemia adyacentes entre sí, uno para la isquemia y otro para la isquemia con una hora adicional de reperfusión. Para inducir isquemia completa reversible, use pinzas vasculares bulldog o hemostáticos para obstruir aproximadamente tres vasos mesentéricos por pinza durante el período de tiempo experimental apropiado.

Mantener el abdomen cubierto durante todo el período isquémico. Al final del experimento, use las tijeras de Metzenbaum para recolectar primero una pieza de control de yeyuno normal al menos de cinco a 10 centímetros proximales al último asa isquémica, seguida de la recolección del resto de los bucles. Guarde los bucles de cada punto de tiempo de lesión en pequeños recipientes de PBS helado hasta el aislamiento de la cripta.

Para aislar las células madre de la cripta, use un alambre de calibre 20 y pinzas de tejido para invertir cada asa del intestino delgado de modo que la superficie mucosa quede expuesta. Sutura la parte superior e inferior de cada bucle de forma segura al alambre y enjuaga cada bucle invertido con PBS helado. Cuando se hayan eliminado todos los restos luminales, coloque inmediatamente las muestras en tubos cónicos individuales de 50 mililitros que contengan 30 mililitros de reactivo de disociación número uno en hielo durante 30 minutos con agitación e inversión cada cinco minutos.

Al final del período de incubación, transfiera las muestras a los tubos correspondientes de 50 mililitros que contengan 30 mililitros de reactivo de disociación número dos y granule las muestras de bucle isquémico de dos a cuatro horas por centrifugación. Vuelva a suspender los gránulos en cinco mililitros de PBS y utilice una alícuota de 50 microlitros de cada muestra para comprobar el grado de asociación de la cripta y la cantidad de residuos mediante microscopía óptica. A continuación, coloque las muestras en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 10 minutos agitando o invirtiendo cada cinco minutos.

Luego, transfiera las muestras directamente a 25 mililitros de PBS helado sobre hielo en un agitador orbital ajustado a 60 RPM durante dos a cinco minutos de agitación con agitación manual adicional o inversión cada 30 segundos. Al final de la incubación por agitación, verifique el grado de asociación de la cripta y la cantidad de escombros y transfiera las muestras a nuevos tubos cónicos de 50 mililitros que contengan 25 mililitros de PBS frío para agitar hasta que las criptas intactas se aíslen con un mínimo de desechos y vellosidades. Cuando los bucles se hayan disociado por completo, retire el tejido restante, granule las muestras por centrifugación y vuelva a suspender los gránulos de cripta restantes en cinco mililitros de PBS fresco.

A continuación, alícuota de 150 criptas por tubo en tubos de microcentrífuga individuales y granular las criptas por microcentrifugación. Con una pipeta preenfriada, vuelva a suspender suavemente los gránulos con 50 microlitros de mezcla maestra por pocillo, seguido de un pipeteo rápido 15 veces para mezclar. A continuación, dispense una gota de cripta de 50 microlitros en el centro de cada pocillo de una placa de 24 pocillos predesparasitada y rejillada y coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados.

Después de 30 minutos, superponga cada hamburguesa de la matriz con 500 microlitros por pocillo de medio de células madre epiteliales intestinales, agregando 500 microlitros de PBS estéril a los pocillos no utilizados para mantener la humedad y contar el número de criptas plateadas del día cero. Agregue factores de crecimiento a cada pocillo cada 48 horas, reemplazando el sobrenadante cada 96 horas con 500 microlitros de medio fresco suplementado con factor de crecimiento. La isquemia intestinal completa se crea en asas del intestino delgado mediante la utilización de oclusión vascular con suturas o pinzas, como se muestra.

Si se realiza correctamente, la lesión isquémica comenzará en la punta de las vellosidades intestinales y migrará hacia abajo dentro de la cripta a medida que aumenta la duración de la isquemia. Un error común con la técnica quirúrgica puede ocurrir cuando los vasos sanguíneos no están ligados o pinzados de manera uniforme, lo que resulta en una isquemia hemorrágica en la que la vena de pared delgada colapsa antes de la arteria, lo que permite que sangre adicional se infiltre en los tejidos. Tras la extirpación de las asas intestinales isquémicas, las criptas intestinales pueden aislarse con éxito siguiendo el protocolo de disociación que se acaba de demostrar.

Las criptas de los puntos de tiempo más dañados a menudo están rotas y contienen más desechos celulares de fondo en comparación con las que no sufren daño o lo hacen levemente. Cuando las criptas intestinales normales y ligeramente dañadas se siembran en cultivo, las enterosferas se forman en un plazo de 24 a 48 horas. Con daño isquémico severo, las criptas intestinales sobreviven pero se dañan, lo que resulta en la formación de esferas mucho más pequeñas inicialmente.

A las 72 a 120 horas, los enteroides de todas las criptas se vuelven más complejos con lúmenes centrales obvios y estructuras en ciernes, y con una disminución general de la eficiencia del crecimiento de las criptas, así como una disminución del tamaño de los enteroides derivados del tejido intestinal gravemente dañado. Una vez dominados, los procedimientos de recubrimiento de aislamiento de criptas se pueden completar en aproximadamente dos o tres horas si se realizan correctamente. Es mejor que las criptas recolectadas para el recubrimiento se deriven de lavados, no de fracciones de disociación, debido a la mayor probabilidad de contaminación del cultivo en la fracción de disociación.

Este método también se puede utilizar para probar la eficacia de los fármacos para el tratamiento de las lesiones epiteliales resultantes de la isquemia más o menos reperfusión. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología gastrointestinal exploraran el impacto de la isquemia en el epitelio, específicamente en las células madre intestinales en un modelo animal grande traslacional y clínicamente relevante. Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de cómo crear isquemia intestinal con o sin reperfusión, así como de aislar las criptas intestinales para el cultivo en 3D después de una lesión in vivo.