Novedoso método de plásmido ADN entrega al urotelio de la vejiga de ratón por electroporación
3 de mayo de 2018
Se describe un método novedoso para la entrega de plásmido de DNA en las células uroteliales del ratón vejiga en vivo a través de la cateterización de la uretra y electroporación. Ofrece una manera rápida y conveniente para la generación de modelos de ratón autóctonas de enfermedades de la vejiga.
El objetivo general de este método es introducir plásmidos de ADN en el urotelio de la vejiga de ratones vivos in vivo para la sobreexpresión de genes o la edición del genoma. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer de vejiga, como ¿cómo las diferentes mutaciones genéticas promueven la progresión del cáncer de vejiga? La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una forma rápida y conveniente de administrar genes a la vejiga sin los problemas de seguridad y las barreras técnicas asociadas con los vectores virales.
Primero tuve la idea de este método de tratar de usar cualquier virus asociado modificado para la entrega de ADN, lo que no funcionó bien en la vejiga. La implicación de esta técnica también puede extenderse hacia la terapia génica porque la electroporación puede lograr una entrega eficiente de plásmidos de ADN en las células uroteliales. La demostración del procedimiento correrá a cargo de Ofir Stefanson y Yueli Liu, de mi laboratorio.
Para comenzar este procedimiento, autoclave todos los instrumentos quirúrgicos y esterilice el espacio de trabajo con etanol al 70%. Rocíe los instrumentos quirúrgicos y los guantes con etanol al 70% con frecuencia al realizar los procedimientos posteriores para mantener las condiciones estériles. Para empezar, anestesia al ratón y afeita la zona quirúrgica.
Para agotar la orina, aplique lubricante al catéter y asegúrese de que su superficie exterior esté completamente cubierta. A continuación, inserte el catéter en la abertura de la uretra del ratón y empújelo lentamente hasta que llegue a la vejiga. Presione suavemente el abdomen para ayudar a la depleción de la orina.
Posteriormente, deseche la orina con una pipeta en un vaso de precipitados de desechos, luego pipetee 80 microlitros de PBS en el extremo exterior del catéter con el otro extremo aún en la vejiga. A continuación, coloque con cuidado una jeringa de un milímetro en el catéter. Empuje suavemente la jeringa para inyectar PBS en la vejiga.
Deje un poco de PBS en el catéter para evitar la formación de burbujas de aire en la vejiga. Después, retire la jeringa y espere a que el PBS drene de la vejiga. Presione suavemente el abdomen para evacuar el PBS, luego deseche el PBS en el catéter con una pipeta en el vaso de precipitados.
Repita el lavado con PBS dos veces más. Para cada vejiga a transfectar, prepare al menos 20 microlitros de plásmido de ADN a un microgramo por microlitro. A continuación, agregue un microlitro de azul de tripán a los 20 microlitros de solución de plásmido y un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y una pipeta para mezclar bien.
Para administrar el plásmido, aplique etanol al 70% en el abdomen. Haz una incisión vertical de un centímetro para abrir la piel abdominal por encima de la vejiga. A continuación, corte la capa muscular para exponer la vejiga.
Pipetear al menos 20 microlitros de solución de plásmido más azul de tripano en el extremo exterior del catéter y separarlo de la jeringa. Luego, inyecte la solución de plásmido en la vejiga. Si la vejiga se vuelve azul, la inyección es exitosa.
Deje un poco de líquido en el catéter para evitar la formación de burbujas de aire en la vejiga. Después, agarre el orificio uretral externo y retire el catéter y la jeringa. Use un hilo para apretar el orificio uretral externo.
Haz dos bucles con la cuerda y luego átalos con dos nudos. Este es un paso crucial que requiere la cooperación de dos personas. Asegúrese de que los nudos estén apretados para que los plásmidos no se escapen.
Ahora, encienda el generador de electroporación. Pellizque la vejiga con dos electrodos y presione el pedal para realizar la electroporación. Para mantener la vejiga apoyada, se puede pellizcar la parte posterior de la incisión abdominal con pinzas.
Evite cualquier contacto entre las pinzas y los electrodos, ya que esto puede generar una chispa. Una vez hecho esto, suturar el abdomen y la abertura cutánea con sutura quirúrgica estéril. Retire la cuerda y aplique los clips.
Aplique yodo sobre la herida y luego retire al animal del sistema de isoflurano. Administrar buprenorfina, analgésico por vía subcutánea para aliviar el dolor postquirúrgico. Mantenga al animal en la almohadilla térmica y devuélvalo a la jaula de origen después de la recuperación completa.
Revise al animal al menos una vez al día para ver si tiene movilidad normal, comportamientos de bebida y alimentación, y si no hay signos de infección hasta que la incisión haya sanado. Luego, una semana después, retira los clips. Administre inyecciones posteriores de analgésico de buprenorfina si el animal muestra síntomas de dolor, como disminución del acicalamiento, aumento de la agresividad y la vocalización.
Para demostrar el éxito de la entrega génica en el urotelio de la vejiga, se inyectaron 20 microlitros de plásmido pCAG-GFP y solución de azul de tripán a través de la uretra y se administraron cinco pulsos eléctricos. Aquí se muestra la electroporación exitosa que hizo que la vejiga se volviera verde después de 48 horas, mientras que una vejiga de control negativa que no se sometió a electroporación no mostró ninguna señal de GFP. La tinción inmunofluorescente de los tejidos vesicales seccionados se realizó con anticuerpos CK5, CK18 y GFP.
Se observó que la señal de GFP estaba presente en las células paraguas, intermedias y basales, pero no en la capa muscular, lo que indica una buena especificidad de la entrega de plásmidos en el urotelio. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 15 minutos si se realiza correctamente. Tras su desarrollo, esta técnica abre el camino a los investigadores en el campo del cáncer de vejiga para construir nuevos modelos de ratón autóctonos para estudiar los mecanismos de progresión de la enfermedad.
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Resumen
Este artículo describe un método novedoso para introducir plásmidos de ADN en las células uroteliales de la vejiga de ratón in vivo mediante cateterización uretral y electrotransferencia. Esta técnica proporciona una forma rápida y conveniente de generar modelos murinos autóctonos de enfermedades de la vejiga.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Terapia génica
- Investigación sobre el cáncer de vejiga
- Técnicas de electrotransferencia
Antecedentes
- El método tiene como objetivo introducir plásmidos de ADN en el urotelio de la vejiga de ratones vivos.
- Aborda preguntas clave sobre la progresión del cáncer de vejiga.
- Los vectores virales tradicionales presentan preocupaciones de seguridad y barreras técnicas.
- Este método ofrece una alternativa para la entrega de genes.
Objetivo del estudio
- Facilitar la sobreexpresión génica o la edición del genoma en células de la vejiga.
- Explorar los efectos de las mutaciones genéticas en el cáncer de vejiga.
- Mejorar la eficiencia de los métodos de entrega de ADN.
Métodos Utilizados
- Cateterización de la uretra para la administración de plásmidos.
- Electroporación para mejorar la absorción de ADN.
- Aplicación in vivo en modelos de ratón.
- Demostración por Ofir Stefanson y Yueli Liu.
Resultados principales
- Entrega exitosa de plásmidos de ADN a células uroteliales.
- Método rápido y eficiente en comparación con vectores virales.
- Aplicaciones potenciales en terapia génica e investigación del cáncer.
- Factibilidad demostrada en modelos de ratón vivos.
Conclusiones
- Este método proporciona un enfoque novedoso para la entrega génica en la vejiga.
- Tiene implicaciones para el estudio de enfermedades de la vejiga y del cáncer.
- Investigaciones futuras podrían ampliar sus aplicaciones en terapia génica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método aborda un cuello de botella crítico en la investigación del cáncer de vejiga al permitir la entrega rápida de genes no virales al urotelio in vivo. Facilita la validación de dianas y la reducción del riesgo mecanicista al permitir la sobreexpresión transitoria o la inhibición de genes candidatos en un sistema relevante para la enfermedad. El enfoque acelera la generación de modelos preclínicos, reduciendo el tiempo y el costo en comparación con los modelos de línea germinal, al tiempo que mantiene la relevancia fisiológica para estudios traslacionales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la comprobación de hipótesis terapéuticas mediante la entrega de plásmidos a células uroteliales de la vejiga para la modulación funcional de genes.
- Valor operativo: Ofrece una alternativa rápida y conveniente a los vectores virales, evitando restricciones de bioseguridad y retrasos en la producción.
- Valor predictivo: Facilita la selección fenotípica en un contexto de tejido nativo, mejorando la confianza en la selección de dianas para las vías del cáncer de vejiga.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera lecturas reproducibles y cuantificables (por ejemplo, expresión de GFP) para evaluar la eficiencia de transfección y los niveles de expresión génica.
- Valor operativo: Estandariza la administración de plásmidos mediante cateterización y electrotransferencia, lo que permite cribados consistentes de compuestos o perturbaciones genéticas.
- Escalabilidad: Facilita la preparación de modelos de vejiga validados para ensayos posteriores de respuesta a fármacos o biomarcadores.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Crea modelos de ratón autóctonos que reflejan los mecanismos de inicio y progresión del cáncer de vejiga.
- Valor operativo: Permite la modulación génica inducible en ratones adultos, lo que posibilita el control temporal en estudios preclínicos.
- Continuidad traslacional: Conecta los hallazgos del descubrimiento con la validación preclínica mediante la evaluación de efectos genéticos en un sistema orgánico clínicamente relevante.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica, permitiendo una rápida iteración desde la hipótesis del blanco hasta la validación in vivo en tejido vesical.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la aclaración de vías y la confirmación de dianas mediante la entrega directa de genes a compartimentos uroteliales.
- Cribado: Proporciona resultados cuantitativos de fluorescencia o inmunohistoquímicos para evaluar la eficiencia de transfección y modulación génica.
- Análisis: Ofrece puntos finales medibles (por ejemplo, intensidad de la señal GFP, especificidad por tipo celular) para comparar condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Permite modelar fenotipos de cáncer de vejiga a nivel preclínico utilizando urotelio genéticamente manipulado.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la entrega génica en múltiples dianas y estudios dentro de la investigación de enfermedades urológicas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la dependencia de sistemas artificiales de sobreexpresión.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante parámetros quirúrgicos y de electroporación estandarizados.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al acelerar la generación de modelos y reducir la eliminación por selección inadecuada de objetivos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos en cáncer de vejiga basada en datos funcionales in vivo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas quirúrgicas en ratones, cateterización y electroforesis.
- Depende de instrumentos quirúrgicos estériles, generador de electroporación y electrodos compatibles.
- Necesita estandarización entre los equipos para lograr un volumen de plásmido, parámetros de impulsos y exposición de la vejiga consistentes.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen el tamaño del plásmido, la elección del promotor y la tasa de renovación del urotelio, que afecta la duración de la expresión.
- Las limitaciones prácticas incluyen la expresión transitoria (pico a las 48 horas) y los desafíos técnicos para mantener la integridad de la vejiga durante los procedimientos.
