Novedoso método de plásmido ADN entrega al urotelio de la vejiga de ratón por electroporación

Se describe un método novedoso para la entrega de plásmido de DNA en las células uroteliales del ratón vejiga en vivo a través de la cateterización de la uretra y electroporación. Ofrece una manera rápida y conveniente para la generación de modelos de ratón autóctonas de enfermedades de la vejiga.

El objetivo general de este método es introducir plásmidos de ADN en el urotelio de la vejiga de ratones vivos in vivo para la sobreexpresión de genes o la edición del genoma. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer de vejiga, como ¿cómo las diferentes mutaciones genéticas promueven la progresión del cáncer de vejiga? La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una forma rápida y conveniente de administrar genes a la vejiga sin los problemas de seguridad y las barreras técnicas asociadas con los vectores virales.

Primero tuve la idea de este método de tratar de usar cualquier virus asociado modificado para la entrega de ADN, lo que no funcionó bien en la vejiga. La implicación de esta técnica también puede extenderse hacia la terapia génica porque la electroporación puede lograr una entrega eficiente de plásmidos de ADN en las células uroteliales. La demostración del procedimiento correrá a cargo de Ofir Stefanson y Yueli Liu, de mi laboratorio.

Para comenzar este procedimiento, autoclave todos los instrumentos quirúrgicos y esterilice el espacio de trabajo con etanol al 70%. Rocíe los instrumentos quirúrgicos y los guantes con etanol al 70% con frecuencia al realizar los procedimientos posteriores para mantener las condiciones estériles. Para empezar, anestesia al ratón y afeita la zona quirúrgica.

Para agotar la orina, aplique lubricante al catéter y asegúrese de que su superficie exterior esté completamente cubierta. A continuación, inserte el catéter en la abertura de la uretra del ratón y empújelo lentamente hasta que llegue a la vejiga. Presione suavemente el abdomen para ayudar a la depleción de la orina.

Posteriormente, deseche la orina con una pipeta en un vaso de precipitados de desechos, luego pipetee 80 microlitros de PBS en el extremo exterior del catéter con el otro extremo aún en la vejiga. A continuación, coloque con cuidado una jeringa de un milímetro en el catéter. Empuje suavemente la jeringa para inyectar PBS en la vejiga.

Deje un poco de PBS en el catéter para evitar la formación de burbujas de aire en la vejiga. Después, retire la jeringa y espere a que el PBS drene de la vejiga. Presione suavemente el abdomen para evacuar el PBS, luego deseche el PBS en el catéter con una pipeta en el vaso de precipitados.

Repita el lavado con PBS dos veces más. Para cada vejiga a transfectar, prepare al menos 20 microlitros de plásmido de ADN a un microgramo por microlitro. A continuación, agregue un microlitro de azul de tripán a los 20 microlitros de solución de plásmido y un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y una pipeta para mezclar bien.

Para administrar el plásmido, aplique etanol al 70% en el abdomen. Haz una incisión vertical de un centímetro para abrir la piel abdominal por encima de la vejiga. A continuación, corte la capa muscular para exponer la vejiga.

Pipetear al menos 20 microlitros de solución de plásmido más azul de tripano en el extremo exterior del catéter y separarlo de la jeringa. Luego, inyecte la solución de plásmido en la vejiga. Si la vejiga se vuelve azul, la inyección es exitosa.

Deje un poco de líquido en el catéter para evitar la formación de burbujas de aire en la vejiga. Después, agarre el orificio uretral externo y retire el catéter y la jeringa. Use un hilo para apretar el orificio uretral externo.

Haz dos bucles con la cuerda y luego átalos con dos nudos. Este es un paso crucial que requiere la cooperación de dos personas. Asegúrese de que los nudos estén apretados para que los plásmidos no se escapen.

Ahora, encienda el generador de electroporación. Pellizque la vejiga con dos electrodos y presione el pedal para realizar la electroporación. Para mantener la vejiga apoyada, se puede pellizcar la parte posterior de la incisión abdominal con pinzas.

Evite cualquier contacto entre las pinzas y los electrodos, ya que esto puede generar una chispa. Una vez hecho esto, suturar el abdomen y la abertura cutánea con sutura quirúrgica estéril. Retire la cuerda y aplique los clips.

Aplique yodo sobre la herida y luego retire al animal del sistema de isoflurano. Administrar buprenorfina, analgésico por vía subcutánea para aliviar el dolor postquirúrgico. Mantenga al animal en la almohadilla térmica y devuélvalo a la jaula de origen después de la recuperación completa.

Revise al animal al menos una vez al día para ver si tiene movilidad normal, comportamientos de bebida y alimentación, y si no hay signos de infección hasta que la incisión haya sanado. Luego, una semana después, retira los clips. Administre inyecciones posteriores de analgésico de buprenorfina si el animal muestra síntomas de dolor, como disminución del acicalamiento, aumento de la agresividad y la vocalización.

Para demostrar el éxito de la entrega génica en el urotelio de la vejiga, se inyectaron 20 microlitros de plásmido pCAG-GFP y solución de azul de tripán a través de la uretra y se administraron cinco pulsos eléctricos. Aquí se muestra la electroporación exitosa que hizo que la vejiga se volviera verde después de 48 horas, mientras que una vejiga de control negativa que no se sometió a electroporación no mostró ninguna señal de GFP. La tinción inmunofluorescente de los tejidos vesicales seccionados se realizó con anticuerpos CK5, CK18 y GFP.

Se observó que la señal de GFP estaba presente en las células paraguas, intermedias y basales, pero no en la capa muscular, lo que indica una buena especificidad de la entrega de plásmidos en el urotelio. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 15 minutos si se realiza correctamente. Tras su desarrollo, esta técnica abre el camino a los investigadores en el campo del cáncer de vejiga para construir nuevos modelos de ratón autóctonos para estudiar los mecanismos de progresión de la enfermedad.