Aislamiento de glándula Mandibular depósito contenidos de Borneo ' explosión de hormigas (Formicidae) para análisis por GC-MS y MetaboliteDetector de Volatilome

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la metabolómica de los insectos. El enfoque de perfil de metabolitos se puede utilizar para estudiar la ecología química de las hormigas al dilucidar el papel de los volátiles en la interacción con otros organismos. La principal ventaja del flujo de trabajo presentado es: que consta de dos partes distintas que básicamente se pueden aplicar de forma independiente.

En primer lugar, el aislamiento físico del reservorio de la glándula mandibular y su contenido, y en segundo lugar, el perfilado no dirigido y la identificación de la constitución orgánica volátil, en la muestra biológica de interés. Michaela Hoenigsberger, una talentosa estudiante de doctorado de mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Antes de diseccionar las hormigas, en una campana extractora, limpie una placa de Petri de vidrio y los instrumentos de disección con pañuelos de papel y una mezcla de metanol y agua uno más uno por volumen.

Guarde el plato a menos 20 grados centígrados. Luego, tome la masa de viales de rosca corta de 1,5 mililitros, incluidos sus tapones de rosca que contienen septos de PTFE de silicio. Guarde los viales en hielo.

A continuación, coloque una compresa fría maleable congelada en una caja de espuma de poliestireno. Luego cargue la placa de Petri encima de la compresa fría y coloque una hormiga congelada en la placa. Ahora, examina a la hormiga con un microscopio estereoscópico.

Comprueba la integridad de sus compartimentos gástricos. La hormiga debe tener una región gástrica intacta. No use hormigas con gásteres planos o rastros de contenido de depósito de glándula mandibular endurecida en sus superficies corporales.

Ahora, aísla el contenido del depósito de la glándula mandibular de la hormiga. Usa pinzas para agarrar el propodio y el pecíolo, luego separa suavemente estos segmentos del cuerpo. A continuación, agarre el gáster en la tergita cuatro con pinzas finas.

Con otro par de pinzas, agarre la tergita uno y retírela suavemente despegándola. Repita este proceso para arrancar las tergitas dos y tres, de modo que la porción de gastrol de los depósitos de la glándula mandibular sea mayormente visible. Los reservorios de la glándula mandibular son de color amarillo en las hormigas obreras C. Explodens, pero el color puede variar desde el blanco sobre el amarillo, hasta el rojo en otras especies.

A continuación, con una aguja de disección, retire suavemente el contenido similar a la cera de los depósitos de la glándula mandibular emparejada rascándolos fuera del compartimento gástrico. Retire únicamente las partes del contenido del depósito de la glándula mandibular que se puedan aislar sin aplicar presión sobre las otras glándulas y estructuras corporales presentes en el gáster hormiga. No es necesario recolectar todo el contenido del reservorio de la glándula mandibular.

Ahora, recoja el contenido del depósito de la glándula mandibular tocándolo suavemente con la punta de la aguja de disección hasta que se pegue a él. A continuación, transfiera el contenido de la glándula a un vial frío de hilo corto de 1,5 mililitros. Puede ser necesario mover la punta de la aguja a lo largo de la pared del vial y untar el contenido de la glándula en la pared del vial.

Mantenga la colección cubierta y en hielo hasta que pueda ser analizada. Entre las disecciones, vuelva a limpiar los instrumentos y el plato con la mezcla de metanol y agua. Para hacer una muestra analítica, combine el contenido del depósito de glándulas de varias hormigas.

En este caso, se agrupa el contenido de las glándulas de cinco hormigas obreras C. explodens. Para un control, recoja muestras compuestas por la glándula de Dufour, que se encuentra adyacente a los depósitos de la glándula mandibular. Antes de extraer el contenido glandular, determine las masas de las muestras analíticas.

Luego, agregue 14 partes de acetato de etilo de alta pureza helado por volumen, a una parte de tejido por masa. Agite la preparación durante cinco minutos en condiciones frías. A continuación, centrifuga las muestras durante 10 minutos y recoge los sobrenadantes.

Se esperan alrededor de 55 a 75 microlitros de sobrenadante de una muestra de cinco hormigas. Transfiera cada sobrenadante a un vial de rosca corta de 1,5 mililitros preenfriado con un microinserto de 0,1 mililitros, y selle herméticamente los viales con tapones de rosca que contengan orificios y septos de PTFE de caucho rojo. Para obtener una secuencia de medición completa de GCMS, prepare un vial de hilo corto de 1,5 mililitros con una mezcla calibrada de índice de retención, elaborado diluyendo soluciones estándar de alcano disponibles comercialmente en hexano, a ocho miligramos por mililitro por compuesto.

Luego, prepare otro vial de acetato de etilo puro para que sirva como blanco de solvente. En la bandeja del muestreador automático refrigerado del cromatógrafo de gases, cargue primero el disolvente en blanco, en segundo lugar, la mezcla de calibrante del índice de retención, en tercer lugar, el extracto del contenido del depósito de la glándula mandibular y, en cuarto lugar, el extracto del contenido de la glándula de Dufour. Coloque las muestras con la bandeja en hielo para transportarlas al cromatógrafo de gases.

Inserte la bandeja en el muestreador automático enfriado. Para cada muestra, inyecte un aliquat de un microlitro en la especificación de masas de GC para la separación cromatográfica en una columna adecuada para los compuestos objetivo. Por ejemplo, una columna de interfaz de usuario HP-5MS.

A continuación, establezca los parámetros de GC adecuados. Por ejemplo, use helio en el gas portador con un flujo de columna constante de un mililitro por minuto. Use una rampa de temperatura del horno a partir de 40 grados centígrados durante dos minutos, seguida de una rampa de 10 grados centígrados por minuto hasta 330 grados centígrados.

Seguido de una espera de siete minutos. Con estos parámetros, ajuste la temperatura de entrada a 270 grados centígrados. Ahora, si es necesario, ajuste las relaciones de división para la especificación de masa de GC.

inyección para que proporcionen formas e intensidades de pico adecuadas para los compuestos de interés. Ajuste la temperatura auxiliar a 350 grados centígrados. Para la especificación de masas.

Utilice los siguientes parámetros. Una temperatura de la fuente MS de 230 grados Celsius, una temperatura MS cuádruple de MS de 150 grados Celsius, un rango de escaneo de baja masa 30 a alta masa 500, para dar como resultado una velocidad de escaneo de aproximadamente tres escaneos por segundo. Y un retardo del disolvente de 4,1 minutos para el disolvente en blanco y las muestras experimentales, o un retardo del disolvente de 6,1 minutos para la mezcla de calibrante del índice de retención.

Cuando se completen las mediciones, abra el software de análisis de datos GCMS y exporte los datos como un archivo de proyecto AIA a un dispositivo de almacenamiento portátil para facilitar la transferencia de datos a una computadora con un sistema operativo basado en Linux de 64 bits. Para analizar los datos, siga la descripción del texto del protocolo del uso del software detector de metabolitos. En el campo, las hormigas se recolectaron y congelaron a menos 20 grados Celsius durante dos días, y luego se almacenaron a menos 80 grados Celsius hasta que fueron analizadas.

Se agruparon los contenidos de reservorio de la glándula mandibular de cinco hormigas obreras C. explodens y se midieron mediante GCMS. El análisis de datos reveló docenas de compuestos putativos del contenido de las glándulas. Los dos metabolitos dominantes en el extracto del contenido del reservorio de la glándula mandibular causaron una sobrecarga de la columna.

Es por eso que la misma muestra se analizó nuevamente en una proporción de división más alta de 50 a uno. La contaminación cruzada del contenido del reservorio de la glándula mandibular por la constitución de la glándula de Dufour se investigó teniendo muestras de la glándula de Dufour para examinar. Dichos contaminantes mostraron tiempos de retención tardíos, comenzando alrededor de 29 minutos.

Los metabolitos putativos detectados en el contenido del reservorio de la glándula mandibular se identificaron sobre la base de una combinación de espectro y similitud del índice de retención con una biblioteca interna. De esta manera, fue posible confirmar la identidad de aproximadamente el 10% de los metabolitos detectados, algunos de los cuales se enumeran como compuestos del uno al cinco. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar, extraer y determinar, uno por vez, los metabolitos eligiendo la medición de MS.

Una vez dominado, el aislamiento, la extracción con disolventes y la adquisición de datos de una misma muestra se pueden realizar en unas dos horas si se realiza correctamente. Dependiendo de la complejidad del perfil de compuestos orgánicos volátiles, el tiempo necesario para la evaluación de los datos variará. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener la muestra permanentemente fría, desde la recolección hasta el análisis.

Además, antes de la sección, se debe verificar que el gaster de la hormiga esté físicamente intacto. Este procedimiento también puede combinarse con la cuantificación comparativa o absoluta de los metabolitos, con el fin de responder a preguntas adicionales, como la composición metabólica y las diferentes condiciones ambientales, o cantidades absolutas de constitución enlatada. Convenientemente, los pasos de extracción, medición y evaluación de datos de este protocolo también se pueden aplicar a múltiples sistemas biológicos, como otros insectos, microorganismos o plantas.