Name: Oral infección bacteriana y vertimiento en Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-31T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Aprende a realizar infecciones bacterianas orales en Drosophila melanogaster para estudiar inmunidad intestinal y derrame bacteriano. Este método permite analizar la supervivencia y carga microbiana en moscas mutantes.

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Este trabajo fue apoyado por una concesión estratégica de la confianza de Wellcome para el centro para inmunidad, infección y evolución (http://ciie.bio.ed.ac.uk; grant referencia no. 095831). PFV fue apoyado por una beca de Branco Weiss (https://brancoweissfellowship.org/) y beca de un rectorado (Facultad de ciencias biológicas, Universidad de Edimburgo); JASJ fue apoyado por una beca de doctorado de NERC E3 DTP.

1. mantener moscas
<ol><li>Mantener moscas en 23 mL plástico frascos de 7 mL de medio de Lewis recién hecha (modificado de referencia31; triple 1 L agua destilada H2O, agar 6,1 g, 93,6 g de azúcar morena, 68 g de maíz, 18,7 g de levadura instantánea, agente antihongos de Tegosept 15 mL) en las incubadoras a 25 ± 1 ° C, en un h:12 12 h luz: oscuridad ciclo de ~ 60% de humedad. Enchufe los frascos con algodón no absorbente.</li>
	<li>Después de cada 14 días, transferir a adultos de 20 a 30 para un frasco de alimento nuevo, con levadura instantánea y seca agregada a la superficie, para 2-3 días permitir la puesta de huevos se produzca. Después de este período de tiempo, asegúrese de que los huevos son visibles en la superficie de los alimentos. Eliminar moscas adultas. Nota: Esto mantiene moscas en los viales como generación, población de edad comparable.</li>
	<li>Deje los huevos a desarrollar. Nota: A 25 ° C, moscas adultas comienzan a eclose de pupas en el día 11 y seguir durante días 12 – 14.</li>
</ol>2. preparar moscas Experimental
<ol><li>Recoger los huevos de la generación de los padres en una jaula de la colección de población/embrión en una placa de agar de manzana 75 mL (1 L triple destilada H2O, agar 30 g, sacarosa de 33 g, jugo de manzana 330 mL, 7 mL Tegosept anti-hongos agente) con una extensión de la pasta de levadura (mezcla de la levadura seca con agua para una consistencia como de mantequilla de maní). Añadir algodón empapado de agua a la jaula para proporcionar humedad. Nota: Para evitar confundir los efectos causados por diferencias en la densidad de cría larval, es importante que moscas experimentales en frascos diferentes son criados en densidades similares. El paso anterior se realiza para evitar la confusión de efectos.</li>
	<li>Incubar durante 24 h a 25 ° C en un 12 h:12 h ciclo luz: oscuridad hasta la puesta de huevos se ha producido. Si hay demasiado pocos huevos después de 24 h, proporcionan un más largo período de habituación. Sustituir las placas de agar de apple y permite la puesta de huevos se produzca por una 24 h más.</li>
	<li>Tomar las placas de agar de manzana cargado de huevo de la jaula de la población. Retire la pasta de levadura restante y cualquier moscas muertas de la superficie de agar.</li>
	<li>Sumerja el agar en 20 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS) y desplazar suavemente los huevos del manzana-agar con un pincel fino. Suspendido en PBS, transferir los huevos a un tubo de centrífuga de 50 mL y deje por 5 min para que los huevos se hunden al fondo. Nota: La mayoría de huevos se encuentran en el borde exterior del agar.</li>
	<li>Retirar cortando la parte inferior 4 mm de una punta de pipeta filtrada de p1000 y utilice la punta de la pipeta para extraer 1 mL de solución, de la parte inferior del tubo de centrífuga de 50 mL. Transferir esto a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y déjela resolver. Nota: Cuando uso huevos, liberación de presión el émbolo es más eficiente que un lanzamiento suave.</li>
	<li>Retirar cortando la parte inferior 4 mm de la punta de una pipeta filtrada de p20. Establece la pipeta en un volumen deseado y sacar de la parte inferior del tubo de microcentrífuga. Nota: Con la práctica, un volumen de 5 μl contiene aproximadamente 100 huevos.</li>
	<li>Servir los huevos recogidos en los alimentos y dejarlos para la cantidad de tiempo requerida.</li>
</ol>3. bacteriana cultura
<ol><li>Para crecer culturas entomophila p. y p. aeruginosa , inocular 10 mL de caldo Luria-Bertani (LB) con 100 μl de un caldo bacteriano congelado a 30 ° C (p. entomophila) y 37 ° C (p. aeruginosa), respectivamente. Agite a 150 rpm durante la noche. Asegúrese de que la cultura bacteriana alcanza la fase de saturación.</li>
	<li>Para las bacterias utilizadas para inocular las moscas están en la fase exponencial y replica rápidamente, inoculan el cultivo durante la noche en una nueva subcultura, de un volumen deseado, a la mañana siguiente. Asegúrese de que el inóculo previa es 10% del volumen total de la cultura de la subcultura. Nota: La infección Oral requiere alta. Por lo tanto es necesario cultivar un volumen importante de cultivo bacteriano para que suficiente cultura de inoculación puede ser producida por la dosis deseada y el tamaño experimental. Calcular cuánto subcultivo es necesaria para producir las dosis infecciosas requeridas usando la ecuación MsVs = MV, donde M representa una cultura de densidad óptica medida a 600 nm (OD600) valor y V representa la volumen. Letras subíndices se refieren a si la cultura se utiliza como una subcultura (s) o una dosis infecciosa (i).</li>
	<li>Crecer este subcultivo en un erlenmeyer de 2 L en un volumen tal que la superficie del subcultivo (a más) justo por encima el principio de la cuesta del frasco. No llene por encima de esta marca como que impida el crecimiento de bacterias.</li>
	<li>Asegúrese de que las bacterias en esta subcultura son en la fase de crecimiento exponencial mediante la medición de OD cada 30 minutos. Nota: Esto ocurre después de 3 a 5 h, donde la subcultura alcanza un OD600 entre 0.6 – 0.8.</li>
	<li>Verter volúmenes iguales de esta subcultura a través de 50 mL tubos de centrífuga y centrifugar el subcultivo a 2.500 x g durante 15 min a 4 ° C para que sedimenten las bacterias. Una vez peleteado, retire y luego girar el sobrenadante nuevamente en las condiciones anteriores para confirmar la eliminación de la mayoría de las bacterias. Nota: Una pelotilla del tamaño insignificante (menor de 1 mm de altura) lo confirma.</li>
	<li>Combinar los pellets bacterianos de los tubos separados por volver a los suspende en 5 mL de sobrenadante de la subcultura y recombinación de estas soluciones en un tubo único 50 mL. Esta cultura concentrada a 2.500 x g durante 15 min a 4 ° C para que sedimenten las bacterias de la vuelta.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y Resuspenda el precipitado final de bacterias en solución de agua de 5% de sacarosa. Compruebe el OD y ajuste a la dosis infecciosa deseada (OD600 = 100 para p. entomophila8 y OD600 = 25 para p. aeruginosa16,28), al volver a suspender los pellets en 5% solución de sacarosa agua el volumen requerido. Nota: La cantidad de solución al 5% sacarosa agua a añadir se puede calcular usando la ecuación en el paso 3.2.1 (sV Ms = MV).</li>
</ol>4. por vía oral infectando moscas
<ol><li>Para asegurar que la infección oral, mueren de hambre las moscas para 2 – 4 h antes de la exposición a las bacterias mediante la transferencia de las moscas a frascos de agar estándar (triple 1 L agua destilada H2O, agar 20 g, 84 g de azúcar morena, agente antihongos de Tegosept 7 mL).</li>
	<li>Prepare frascos de infección mientras que moscas son ser muerto de hambre. Hacer un frasco de infección por Pseudomonas por Pipetear 500 μl del agar azúcar estándar en la tapa de un tubo de muestra de 7 mL y dejar que se seque. Colocar un disco de papel de filtro en la tapa y Pipetear 100 μl de cultivo bacteriano directamente sobre el disco del filtro. Para control de infecciones causadas, reemplazar el cultivo bacteriano con el mismo volumen de solución al 5% sacarosa agua en el papel de filtro.</li>
	<li>Añadir solo vuela al tubo de muestras y deje durante 18 – 24 h.</li>
	<li>Para confirmar la infección oral, primero superficie-esterilizar las moscas inmediatamente después de la exposición bacteriana, colocándolos en 100 μl de etanol al 70% para 20-30 s. eliminar el etanol y añadir 100 μl de triple destilada agua de 20 – 30 s antes de quitar el agua. Añada 100 μl de PBS 1 x y homogeneizar la mosca.</li>
	<li>Transferir el homogeneizado a la fila superior de una placa de 96 pocillos y agregar 90 μl de 1 x PBS a cada pocillo por debajo.</li>
	<li>Diluir en serie esta muestra para distinguir los valores de un rango de UFC. Tomar 10 μl del homogeneizado en el pozo superior y añadir esto a la muy por debajo. Repita este paso con la segunda, transferir 10 μL en la tercera y así sucesivamente, para tantas diluciones seriadas según sea necesario. Nota: Es importante que se utilicen puntas de pipeta nueva para cada conjunto de diluciones.</li>
	<li>Las diluciones seriadas en una placa de agar nutritivo LB en gotas de 5 μl, para asegurar que todas las gotas permanecen discretas de la placa.</li>
	<li>Incubar las placas de LB Agar durante la noche a 30 ° C y 37 ° C para p. entomophila y p. aeruginosa, respectivamente y la cuenta de unidades formadoras de colonias visibles. Nota: Mientras que microbios del intestino de Drosophila requieren condiciones distintas del crecimiento anaerobio, puede utilizarse medio selectivo, por ejemplo Pseudomonas aislamiento mediano (PIM), para asegurarse de que se cuenta sólo UFC de Pseudomonas .</li>
	<li>Calcular el número de unidades formadoras de colonias por mosca contando el número de colonias presentes en la dilución serial donde 10 – 60 UFC es claramente visibles. Luego multiplicar por el factor de dilución para calcular el número de bacterias por mosca.</li>
	<li>Realizar el análisis estadístico. En caso necesario, transformar las unidades formadoras de colonias por volar a una distribución normal. Para ello, la transformación log. Una vez transformado, utilizar modelos lineales generalizados (GLMs)30,31,32 para comprobar qué grupos de tratamiento diferencian en unidades formadoras de colonias por mosca (usando paquetes de software estadístico comúnmente disponibles como R33). Nota: El homogeneizado mosca restante puede utilizarse para medir la expresión génica a través del análisis de cuantitativo transcripción reversa PCR (RT-qPCR). Fijar el homogeneizado en 50 μl de reactivo de aislamiento de RNA, extracto de RNA y cuantificar títulos específicos gene inmune por RT-qPCR (ver p. ej., Gupta y Vale16 para un protocolo detallado). La expresión de las transcripciones del gene inmune específica debe ser normalizada a los niveles de transcripción de un gen de la limpieza (es decir, rp49) y expresada como un pliegue de cambio en relación con el control de moscas utilizando el método de 2−ΔΔCt 31, 32,33,34.</li>
</ol>5. grabación supervivencia después de la infección
<ol><li>Infectan por vía oral como se describe en el paso 4.2 moscas.</li>
	<li>Transfiera los infectados o moscas control de sus frascos respectivos infección en norma Lewis los frascos y guardar en una incubadora a 25 ° C en un 12 h:12 h luz / oscuridad (o ciclo deseado condiciones). Mantener moscas hasta que estén muertos.</li>
	<li>Contar el número de moscas vivos o muertos en cada frasco diariamente o tan a menudo como sea necesario.</li>
	<li>Transferir las moscas a viales nuevos cada 5 días para evitar las moscas quedarse atascadas en los alimentos.</li>
	<li>Presentar estos datos como curvas de supervivencia de Kaplan-Meier (KM) o media ± SE supervivencia proporcional parcelas. Para analizar el efecto de varios factores y sus respectivas interacciones con otros utilizar un paquete estadístico (por ejemplo, el paquete de "supervivencia" en R33) para ejecutar un análisis de supervivencia como el modelo de riesgos proporcionales de Cox35.</li>
</ol>6. medición de la carga bacteriana
<ol><li>En el momento deseado, transferir una sola mosca infectada a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL estéril.</li>
	<li>Superficie de esterilizar las moscas como se describe en el paso 4.4.</li>
	<li>Homogeneizar la mosca y cuantificar la carga bacteriana utilizando el protocolo descrito en los pasos 4,5 – 4.10.</li>
</ol>7. medida del vertimiento bacteriana
<ol><li>Medir el desprendimiento junto con la carga interna.</li>
	<li>Después de la infección, transferencia solo vuela a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL con 50 μl de medio de Lewis para 24 h.</li>
	<li>Eliminar las moscas para la medición de la carga interna (ver paso 6) y lavar los tubos con 100 μl de PBS 1 x con un vórtex pesadamente para 3 s.</li>
	<li>Medir la UFC en este lavado placas de LB agar nutritivo utilizando el mismo protocolo como se describe en pasos 4.6 – 4.8.</li>
	<li>Después de la infección, transferencia solo vuela a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL con 50 μl de medio de Lewis para 24 h.</li>
	<li>Transferir las moscas a nuevos tubos de microcentrífuga con 50 μl de medio de Lewis para un lavado más de 24 h. los tubos contaminados con 100 μl de PBS 1 x con un vórtex pesadamente para 3 s.</li>
	<li>Medir la UFC en este lavado placas de LB agar nutritivo utilizando el mismo protocolo que se describe en pasos 4.6 – 4.8.</li>
	<li>Repita los pasos 7.2 y 7.3 y registro mortalidad mosca en cada transferencia.</li>
</ol>

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Presentamos un protocolo para infectar confiablemente oral D. melanogaster con bacterias patógenas. Nos centramos en p. aeruginosa y p. entomophila, pero este protocolo puede ser fácilmente adaptado para permitir la infección de otras especies bacterianas, por ejemplo, Serratia marcescens7. Aspectos claves del presente Protocolo varían entre especies bacterianas. En consecuencia, la más eficiente dosis infectiva, virulencia correspondiente y host genotipo deben todos ser considerados e idealmente a prueba en estudios piloto. Exponiendo moscas a cultivos bacterianos de una gama de densidades ópticas y medir sus dosis infecciosa y la supervivencia es un punto de partida apropiado cuando se trabaja con nuevas especies bacterianas o líneas de mosca.
Pasos de protocolo tales como volar hambre antes de la alimentación y vuelva a suspensión bacteriana en solución de sacarosa al 5% son comunes en la infección oral y aumentar la confiabilidad de una infección bacteriana durante la exposición7,8, 9 , 10. sin embargo, es importante señalar que durante la exposición, moscas esencialmente viven en una superficie de cultivo bacteriano. En el proceso de caminar en esta cultura, bacterias que se metieran en la superficie de la mosca, sobre todo en la cutícula o alrededor de las cerdas24. Estas bacterias epicuticular, no reflejan una infección entérica éxito pero todavía se detectaría por la mosca de la homogeneización y el. Para reducir el riesgo de falsos positivos, es esencial a la superficie esterilizar moscas mediante inmersión en etanol al 70% para hasta 1 minuto.
Al considerar tasas de vertimiento bacterianas, la infección oral es esencial. El número de patógenos de que un host libera en el medio ambiente es a menudo difícil de medir y la carga interna se toma a menudo como un indicador de la severidad de la infección y por lo tanto transmisión26,27. Medición carga bacteriana junto con desprendimiento bacteriano permite un examen de la relación entre estos dos importantes componentes de gravedad y la propagación de la enfermedad38. Una limitación del método presentado es que ensayando la carga bacteriana interna de moscas requiere muestreo destructivo. Esto hace difícil investigar las tendencias longitudinales de crecimiento patógeno y la separación en el mismo individuo. Sin embargo, es posible superar esta limitación por cohortes de muestreo destructivo de los individuos en diferentes etapas de la infección, bajo el supuesto de que la carga microbio promedio en cada cohorte refleja la dinámica longitudinal del patógeno dentro de cualquier dado individuales. Bacteriana del vertimiento no padecen las mismas limitaciones, y ofrecemos ejemplos de cómo vertimiento se puede cuantificar en una muestra transversal y longitudinalmente para investigar cómo arrojar cambios dentro de un individuo en el tiempo.
Muchos rasgos del anfitrión y el patógeno conjuntamente determinan la propensión de un individuo para transmitir enfermedad25,26,39. Mientras que la significación de estos rasgos probablemente varía entre sistemas huésped-patógeno, vertimiento es probablemente un determinante de transmisión feco-oral. La capacidad para medir el desprendimiento bacteriano abre la oportunidad de probar esta hipótesis. Haber caracterizado dinámica huésped-patógeno en un panel deseado de líneas de mosca, experimentadores podrían oral infectar a individuos y colocarlos junto a los anfitriones no infectados, susceptibles durante sus períodos infecciosos. Estas moscas 'destinatarios' podrían ensayarse entonces para carga bacteriana interna en varios puntos del tiempo como una forma de medir directamente la transmisión.

La mosca de la fruta (también conocido como la mosca del vinagre), D. melanogaster, se ha utilizado extensivamente como un organismo modelo para la infección y la inmunidad contra una variedad de patógenos1,2. Este trabajo ha ofrecido ideas fundamentales sobre las consecuencias fisiológicas de la infección y también fue pionera en desentrañar las vías moleculares que subyacen la inmunorespuesta del anfitrión contra las infecciones bacterianas, micóticas y virales de parasitoide. Este conocimiento no sólo es útil para entender la respuesta inmune innata de insectos y otros invertebrados, pero porque muchos de los mecanismos inmunes están conservadas evolutivamente entre insectos y mamíferos, Drosophila ha estimulado también el descubrimiento principales mecanismos inmunes en los mamíferos, incluyendo seres humanos3.
Mayor parte del trabajo en Drosophila la infección y la inmunidad se ha centrado en las infecciones sistémicas, utilizando métodos de inoculación que patógenos directamente en el cuerpo del insecto por pinchazo o inyección4,5,6. La ventaja de estos métodos para permitir la entrega de una dosis infecciosa controlada es claro y apoyado por un gran cuerpo de trabajo sobre infecciones sistémicas. Sin embargo, muchos patógenos bacterianos naturales de D. melanogaster se adquieren a través de la alimentación en la descomposición de materia orgánica donde inmunocompetencia intestinal juega un papel importante en el host defensa7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. experimentos que emplean infecciones sistémicas omitir estas defensas y, por lo tanto, proporcionan una imagen completamente diferente de cómo insectos montar defensas contra patógenos naturales. Esto es especialmente relevante si el objetivo del trabajo es poner a prueba predicciones acerca de la ecología y evolución de la infección, donde el uso de patógenos naturales y rutas de infección importante16,17. Trabajo reciente ha puesto de relieve cómo la ruta tomada por patógenos significativamente afecta enfermedad resultado18,19, provoca distintas vías inmune20,21, puede determinar el efecto protector de heredado de endosimbiontes16y puede incluso jugar un papel importante en la evolución de host defensas17.
Otra razón para emplear rutas orales de la infección es que permite la investigación de la variación en la transmisión de patógenos mediante la medición del vertimiento bacteriana durante la excreción fecal después de la infección oral22,23, 24. comprensión de las fuentes de heterogeneidad de host en la transmisión de la enfermedad es difícil en las poblaciones naturales25,26, pero componentes de transmisión, tales como patógeno del vertimiento, en laboratorio de control de medición condiciones ofrece una alternativa útil27. Bacterias alimentación de moscas y bacterias medición del vertimiento bajo una variedad de contextos genéticos y ambientales en condiciones experimentales controladas, es posible identificar fuentes de variación en la transmisión entre hosts.
Aquí, describimos un protocolo para la infección por vía oral de D. melanogaster con bacterias patógenas, y para cuantificar el crecimiento bacteriano y vertimiento sigue (figura 1). Describimos este protocolo en dos bacterias Pseudomonas : una cepa virulenta de lo patógeno oportunista p. aeruginosa (PA14) y una tensión menos virulenta de lo natural volar patógeno p. entomophila. Pseudomonas son bacterias Gram negativas comunes con un rango de hospederos amplio, infectar insectos, nematodos, plantas y vertebrados y se encuentran en entornos más4,6. Infección entérica de Drosophila por p. aeruginosa y p. entomophila resultados en patología a epitelio intestinal12,13,14,15, 28. Mientras nos centramos en estos dos patógenos bacterianos, los métodos descritos aquí pueden en principio aplicarse a cualquier patógeno bacteriano de interés con modificaciones menores. Después de la exposición oral, medimos supervivencia post-infección y medir la carga de microbios dentro de los moscas y microbios viables arrojan sobre el medio ambiente, expresado en colonias formando unidades (UFC). Por último, porque gut inmunocompetencia resulta de una combinación de la barrera epitelial y las respuestas humorales, medimos también la supervivencia de líneas de mosca donde se interrumpen estas defensas. En concreto, Drosocrystallin (Dcy) mutantes han demostrado anteriormente ser más susceptibles a la infección bacteriana oral debido a una matriz peritrophic empobrecido en la tripa29. También medimos la supervivencia en un mutante de Relish (Rel) que se ve impedida de producir péptidos antimicrobianos contra bacterias Gram-negativas por el IMD camino30.

<table><tbody><tr><td>Viales</td><td>Sarstedt Ltd.</td><td>58.490</td><td>Tubo de poliestireno de base plana 75 mm x 23,5 mm, 23 ml</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7002</td><td>, ceniza 2,0-4,5%</td></tr><tr><td>Azúcar moreno</td><td>Bidvest</td><td>66032</td><td>Azúcar blanda moreno claro</td></tr><tr><td>Maíz</td><td>Dove's Farm</td><td></td><td>Harina de maíz ecológico</td></tr><tr><td>Levadura Fermipan</td><td>Bidvest</td><td>96360</td><td>Levadura seca instantánea</td></tr><tr><td>Metil-4-hidroxibenzoato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td>>=99.0%,</td></tr><tr><td>sacarosa</td> cristalina <td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td>Sacarosa BioUltra, para biología molecular, >=99.5% (HPLC)</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Fisher Scientific UK Ltd.</td><td>15788517</td><td>X600 Placa de Petri 90 X 16,2 MM Tubos Estériles Triple Vent</td></tr><tr><td>Falcon (50 ml)</td><td>Greiner Bio-one Inc 210261</td><td></td><td>Tubo de centrífuga, 50 ml, con faldón, embolsado, estéril</td></tr><tr><td>Eppendorf tubo (0,5 ml)</td><td>Sarstedt Ltd.</td><td>72.699</td><td>Sarstedt Micro Tubo Base Cónica Tapón de Empuje 0.5ml Estándar Neutro</td></tr><tr><td>Tubo Eppendorf (1.5ml)</td><td>Sarstedt Ltd.</td><td>72.690.001</td><td>Sarstedt Micro Tubo Base Cónica Tapón de Empuje 1,5ml Etanol Neutro Estándar</td></tr><tr><td></td><td>VWR International Ltd.</td><td>20821.33</td><td>ETANOL ABSOLUTO ANALAR NP ACS/R.PE - Matraz cónico de grado</td></tr><tr><td>analítico 2 L</td><td>VWR International Ltd.</td><td>214-0038</td><td>Cuello estrecho, matraz Erlenmeyer de 2 L</td></tr><tr><td>Papel de filtro estéril</td><td>Fisher Scientific UK Ltd.</td><td>1001-020</td><td>Círculo liso y hojas; Retención de partículas: superior a 11um; Velocidad de filtración: 150 herzberg; Flujo de aire: 10,5 s/100 ml/pulg2; Porosidad media; Superficie lisa; Grado 1; Tipo: círculo; Diámetro: Contenedor</td></tr><tr><td>de muestras Bijou</td> de 20 mm <td>Fisher Scientific UK Ltd.</td><td>129A</td><td>Contenedor de muestra de poliestireno de 7 ml</td></tr><tr><td>Agar de aislamiento Pseudomonas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17208</td><td>Contiene agar 13,6 g/L, cloruro de magnesio 1,4 g/L, digestión péptica de tejido animal 20 g/L, sulfato de potasio 10 g/L, triclosán 0,025 g/L</td></tr><tr><td>Caldo LB, Miller</td><td>Fisher Scientific UK Ltd.</td><td>BP1426</td><td>Contiene 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de cloruro de sodio por litro Jaulas de</td></tr><tr><td>colección de embriones grandes</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td><td>59-101</td><td>Flystuff: se adapta a la solución de reactivo TRI de placa de Petri de 100 mm</td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>AM9738</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de 96 pocillos</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td><td>353072</td><td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC Poliestireno Tratado con Cultivo Celular Microplaca con Tapa Mortero Estéril</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>12649595</td><td>Mortero, Preesterilizado; Axygen; Trituradora de tejidos; Azul; Construcción de polipropileno inerte; Se adapta a tubos de centrífuga de 1,5 y 2,0 ml; Envuelto individualmente; 100/Pk</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Suministros de Laboratorio Científico Ltd.</td><td>CHE2068</td><td>Glicerol A.R. 99.5% 2.5 L</td></tr><tr><td>Algodón - no absorbente</td><td>Cowens Ltd</td><td>ABL</td><td>No absorbente Gran cantidad 20 bolsas x 500</td></tr><tr><td>Lana de algodón - absorbente</td><td>Cowens Ltd</td><td>ABS</td><td>BP pequeña cantidad 20 bolsas x 500</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisherbrand</td><td></td><td>Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V</td></tr><tr><td>Incubadora orbital</td><td>Gallenkamp</td><td>INR-200-010V</td><td>220 V, 50 Hz, 5 A. Temperatura nominal: 70&ordm;C. Frecuencia de agitación: 0...400 rpm.</td></tr><tr><td>Lector de microplacas de absorbancia</td><td>Biotek Instruments Ltd</td><td></td><td>ELx808&trade; Lector de microplacas de absorbancia</td></tr><tr><td>Gen 5 Software de lectura y generación de imágenes de microplacas</td><td>Biotek Instruments Ltd</td><td></td> para centrífuga <td>lectora de microplacas de absorbancia</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>392304</td><td>Allegra X-12R Centrífuga de sobremesa, refrigerada 50Hz 230V</td></tr><tr><td>Step One Plus Sistema de qPCR en tiempo real</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>4376600</td><td>Biosistemas aplicados Step One Plus sistema</td></tr> <tr><td>de qPCR en tiempo realSoftware Step One 2.3</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td>Para sistemas de qPCR en tiempo real Stepone y SteponePlus</td></tr><tr><td>R Statistical Software</td><td>https://cran.r-project.org/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>10 &micro; Puntas de pipeta en L</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>741015</td><td>Easlyload estilo gilson. Graduado, transparente, recambio, 960 piezas</td></tr><tr><td>200 y micro; Puntas de pipeta en L</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>741065</td><td>Easlyload estilo gilson. Graduado, transparente, recambio, 960 piezas</td></tr><tr><td>1000 y micro; Puntas de pipeta en L</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>741045</td><td>Easlyload estilo gilson. Graduado, transparente, recambio, 960 piezas</td></tr><tr><td>20 y micro; Puntas de pipeta filtradas en L</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>774288</td><td>Punta de filtro estilo gilson. Transparente, estante azul, empaquetado individual, libre de R / Dnase, 10 estantes de 96 piezas</td></tr><tr><td>200 y micro; Puntas de pipeta filtradas en L</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>739288</td><td>Punta de filtro estilo gilson. Transparente, estante azul, empaquetado individual, sin R / Dnase, 10 estantes de 96 piezas</td></tr><tr><td>1000 y micro; L puntas de pipeta filtradas</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>740288</td><td>Punta de filtro estilo gilson. Transparente, estante azul, empaquetado individual, sin R/Dnase, 10 estantes de 60 piezas</td></tr></tbody></table>

oral infección bacteriana y vertimiento en drosophila melanogaster

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

La mosca de la fruta Drosophila melanogaster es uno de los mejores sistemas de modelo desarrollado de infección e inmunidad innata. Mientras que la mayor parte del trabajo se ha centrado en las infecciones sistémicas, ha habido un reciente aumento de interés en los mecanismos de la inmunocompetencia del intestino a los patógenos, que requieren métodos para infectar por vía oral a moscas. Aquí presentamos un protocolo para exponer oralmente moscas individuales a un oportunista patógeno bacteriano (Pseudomonas aeruginosa) y un patógeno bacteriano natural de D. melanogaster (entomophila Pseudomonas). El objetivo de este protocolo es proporcionar un método robusto para exponer las moscas machos y hembras a estos patógenos. Proporcionamos resultados representativos que muestran fenotipos de supervivencia, cargas de microbio y bacterias del vertimiento, que es relevante para el estudio de la heterogeneidad en la transmisión de patógeno. Por último, confirmamos que Dcy mutantes (falta de la matriz de protección peritrophic en el epitelio intestinal) y salsa de mutantes (falta de una vía funcional de la deficiencia inmune (IMD)), muestran mayor susceptibilidad a infección bacteriana oral. Este protocolo, por lo tanto, describe un método robusto para infectar moscas utilizando la vía de infección, que puede ser extendida al estudio de una variedad genética y medio ambiente las fuentes de variación en los resultados de infección intestinal y transmisión bacteriana oral.

Aquí, presentamos resultados ilustrativos de experimentos donde D. melanogaster oral fue infectado con p. aeruginosa o p. entomophila. Figura 2 muestra la infección oral exitosa de moscas después de un período de exposición de 12 h o 24 h a cultivos bacterianos de OD600 = 25 y 100 para p. aeruginosa (figura 2A) y p. entomophila (figura 2B C), respectivamente. Figura 2B ilustra la importancia de una cultura más concentrada de p. entomophila, demostrado por el aumento en la carga bacteriana cuando moscas están expuestas a cultivos bacterianos de mayor densidad óptica. Moscas de Oregon R (OreR) masculinos y femeninos claro de infección de p. aeruginosa en la misma proporción (figura 3) y arrojan el mismo número de UFC de p. aeruginosa (Figura 4A). Cuando infectados con p. entomophila , sin embargo, moscas OreR de hombres y mujeres difieren en el número de caseta de bacterias, de manera que cambia con el tiempo (Figura 4B). Los machos y las hembras mueren por p. aeruginosa (figura 5A) y p. entomophila (figura 5B) a diferentes velocidades. También vemos que las mutantes de condimento (que carecen de una vía inmune funcional de IMD), de Dcy mutantes (que carecen de la matriz de protección peritrophic en el epitelio intestinal) muestran supervivencia disminuida después de p. aeruginosa p. entomophila y infección oral (figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig1.jpg"> Figura 1: Descripción esquemática de los protocolos para medir supervivencia, vertimiento y carga bacteriana interna después de la infección oral de Drosophila melanogasterde. Una ilustración de 3 experimentos posibles después de la infección oral de D. melanogaster. Medir la 'supervivencia' por transferencia solo vuela a frascos y registrando su vida infectado. Mida 'derramamiento' transfiriendo solo vuela a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL con 50 μl de medio de Lewis en la tapa. Después de 24 h en el tubo, quite el fly y vórtice del tubo con 100 μl de 1 x PBS. Retire y esta solución en agar nutritivo LB para calcular el desprendimiento bacteriano de la placa. Medir el derramamiento en la marcha misma longitudinalmente, por transferencia de moscas a frescos tubos con medio de Lewis en la tapa después de 24 h y lavado y galjanoplastia del tubo ahora contaminado. 'Carga interna' de la mosca puede medirse tomando un infectado mosca, superficie de esterilización lo y homogeneización antes finalmente de la galjanoplastia el homogeneizado en agar nutritivo LB. Esto puede realizarse después del vertimiento se ha medido para calcular cómo la 'carga interna' y correlato de vertimiento. La ilustración mosca utilizada en esta figura fue dibujada originalmente por B. Nuhanen36. Los autores han modificado para acompañar la curva de Kaplan-Meier de ejemplo que es tomada de Wikimedia Commons37. Otras ilustraciones son originales. <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig2.jpg"> Figura 2: dosis infectiva de las bacterias después de la infección oral. (A) dosis infecciosas de macho y hembra Oregon-R vuela después de la exposición a una cultura de p. aeruginosa (OD600 = 25) de 12 h. Se calcularon la media y SE de 3 machos y 3 hembras. (B) dosis infecciosas de cruzada tipo salvaje las hembras después de la exposición a uno de cuatro culturas p. entomophila (OD600 = 100, 75, 50 y 25) o control solución sacarosa al 5% durante 24 h. La diferencia estadística de (F3,76 = 18.567, p &lt; 0.001) en la dosis infecciosa entre los tratamientos de exposición se denota por letras diferentes sobre las barras. Los medios se calcularon a partir 5 moscas para el OD600 = 0 dosis y 18-20 para todas las otras dosis. (C) la dosis infecciosa de macho y hembra Oregon-R vuela después de la exposición a la cultura de p. entomophila (OD600 = 100) durante 24 h. Se calcularon la media y SE de 20 machos y 20 hembras. <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig3.jpg"> Figura 3: Carga interna de p. aeruginosa en moscas después de la infección oral. Media ± SE carga bacteriana de macho y hembra Oregon-R vuela después de la infección oral con p. aeruginosa (OD600 = 25) hasta la infección después de 168 h. De 3 individuos se calculan la media y SE de cada momento. Carga bacteriana interna de la mosca cambia significativamente con el tiempo (p &lt; 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig4.jpg"> Figura 4: desprendimiento después de la infección bucal bacteriana. (A) p. aeruginosa arrojar por las moscas mismo utilizadas en la figura 3, hasta a la infección después de 120 h. Se calcularon la media y SE de 3 machos y 3 hembras. (B) p. entomophila derramada por hombre y mujer Oregon-R vuela después de la infección oral con p. entomophila (OD600 = 100) hasta la post-infección 120 h. Se calcularon la media y SE de 34 machos y 38 hembras. Para p. aeruginosa y p. entomophila, el número de unidades formadoras de colonias galpón por una mosca cambia significativamente con el tiempo (p &lt; 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig5.jpg"> Figura 5: supervivencia de moscas después de la infección bucal bacteriana. Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier (KM) de (A) Oregon-R macho y la hembra vuela después de la infección oral con p. aeruginosa (OD600 = 25) o solución de sacarosa al 5%. Se calculó la curva de supervivencia KM 4 frascos de 20 moscas por grupo de tratamiento. (B) vuela OreR masculino y femenino después de la infección oral con p. entomophila (OD600 = 100). La curva de supervivencia de KM se calculó a partir 4 de solo control de moscas y moscas infectadas 34 para machos y hembras. (C) mutantes inmunes: Dcy (peritrophic Drosocrystallin mutante de matriz) y Rel (mutante de condimento-IMD), expuestos a p. entomophila (Pe), p. aeruginosa (Pa14) o una solución de sacarosa 5% de control. Todos los grupos infectados mueren mucho más rápido que el control de moscas (p &lt; 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo describe métodos para exponer oralmente e infectar a la mosca de la fruta Drosophila melanogaster con bacterias patógenas y para medir el número de bacterias infecciosas caseta después de la infección intestinal. Además, describimos el efecto de mutantes inmunes mosca supervivencia después de la infección bacteriana oral.

Oral infección bacteriana y vertimiento en Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la infección y la inmunidad, como ¿cómo responden los individuos a las diferentes raíces de infección? La principal ventaja de esta técnica es que permite examinar la inmunocompetencia intestinal, que desempeña un papel importante en la defensa del huésped contra la infección, que se adquiere principalmente a través de la alimentación. Este método tiene el potencial de ser utilizado en otras especies además de Drosophila, y también se puede utilizar para estudiar otros patógenos, como los virus.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido al rigor experimental requerido durante estos protocolos de microbiología. Mantenga las moscas en frascos de plástico de 23 mililitros que contengan siete mililitros de medio Lewis recién hecho. Para taponar los viales, utilice algodón no absorbente.Manténgalos a 25 grados centígrados en un ciclo de luz-oscuridad de 12-12 con una humedad relativa de aproximadamente el 60%Cada 14 días, transfiera de 20 a 30 adultos a un nuevo vial de comida, con una pizca de levadura seca agregada a la superficie. Después de dos o tres días, deshágase de las moscas adultas si se han puesto suficientes huevos. Para recolectar huevos, prepare una jaula de población.Primero, agregue algodón empapado en agua para proporcionar humedad. Luego, como sustrato, use un plato de 75 mililitros lleno de agar manzana y una pasta de levadura. Por último, cargue a los adultos en una jaula de población.En intervalos de 24 horas, vuelva a colocar el plato y verifique la presencia de huevos. Una vez que hayan puesto suficientes huevos, retire las moscas muertas del plato y la pasta de levadura restante del plato recolectado. A continuación, sumerja el agar en 20 mililitros de PBS y desaloje suavemente los huevos, con un pincel fino.Transfiera los huevos en el PBS a un tubo de 50 mililitros. Luego, deje que los huevos se hundan hasta el fondo durante unos cinco minutos. A continuación, acorte el extremo de una punta p1000 en unos 4 milímetros, luego utilícela para aspirar los huevos en solución.Una liberación rápida del émbolo es eficaz para levantarlos. Luego transfiera los huevos en PBS a un tubo de 1.5 mililitros y deje que los huevos se asienten. Ahora recorta cuatro milímetros de una punta de p20 filtrada y luego úsala para transferir una alícuota de huevos a un vial de comida para que se desarrolle.Para cultivar cultivos de P. entomophila y P. aeruginosa, inocular 10 mililitros de caldo LB con 100 microlitros de un caldo congelado e incubarlo durante la noche con 150 rpm de agitación. A continuación, transfiera el cultivo a un matraz cónico de dos litros y llénelo con LB hasta el comienzo de la pendiente de las paredes del matraz. Cuando el subcultivo alcance la fase de crecimiento exponencial, transfiera volúmenes iguales a un número par de tubos de 50 mililitros, luego gírelos.A continuación, recoge los sobrenadantes y gíralos de nuevo. Ahora combine los gránulos bacterianos de todos los tubos resuspendiendo cada paleta en cinco mililitros de sobrenadante, y luego recombine las suspensiones en un solo tubo de 50 mililitros. Luego, después de otro centrifugado, vuelva a suspender las bacterias en una solución de sacarosa al 5%.Ahora diluya una muestra de esta suspensión 100 veces para medir de manera confiable el diámetro exterior de la suspensión y ajuste la concentración final de la suspensión en consecuencia con la dosis infecciosa deseada. De dos a cuatro horas antes de la infección oral, transfiera las moscas a viales de agar estándar que no contengan alimentos. Mientras tanto, para cada mosca, prepare un frasco de infección.Primero, cargue la tapa de un tubo de muestra de siete mililitros con 500 microlitros de agar azúcar estándar y deje que se solidifique. A continuación, pegue un disco de papel de filtro en el agar, luego pipetee 100 microlitros de cultivo bacteriano directamente sobre el disco de filtro. Para los controles, use agua con sacarosa al 5%.Después del período de inanición, transfiera las moscas individuales a los tubos preparados. Después de incubar las moscas durante 18 a 24 horas, esteriliza las moscas en la superficie. Cargue las personas en un tubo que contenga 100 microlitros de etanol al 70%.Después de 20 a 30 segundos, retire el etanol y reemplácelo con 100 microlitros de agua triplemente destilada. Después de otros 20 a 30 segundos, retire el agua. A continuación, añade 100 microlitros de PBS y homogeneiza la mosca.Transfiera el homogeneizado a la fila superior de una placa de 96 pocillos y agregue 90 microlitros de 1x PBS a cada pocillo inferior. Luego, usando alícuotas de 10 microlitros, diluya en serie esta muestra para distinguir un rango de valores de UFC. A continuación, coloque las diluciones en serie en una placa de agar nutriente LB en gotas de cinco microlitros.Coloque las gotas de manera que estén discretamente ubicadas en la placa. Luego incube la placa durante la noche. Al día siguiente, calcule el número de UFC de la dilución que produce de 10 a 60 colonias claramente visibles.Para medir la carga bacteriana, transfiera una sola mosca infectada a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros. Luego, como se describió anteriormente, esterilice las moscas en la superficie, luego homogeneícelas y haga un análisis de UFC. Para medir la excreción bacteriana, transfiera moscas individuales a tubos de 1,5 mililitros que contengan aproximadamente 50 microlitros de medio Lewis.Cambie el tubo cada 24 horas. Después de que se hayan llenado tres tubos durante 24 horas, deseche las moscas. Después de cada transferencia, mida las bacterias contenidas en el tubo.Mezcle el contenido del tubo con 100 microlitros de PBS usando un vórtice. A continuación, mida las UFC de la mezcla mediante diluciones en serie mediante la siembra. Utilizando el protocolo descrito, se investigó el efecto de la infección bacteriana oral a través de la mortalidad y la diseminación bacteriana.La excreción se midió longitudinalmente en las mismas moscas y en puntos de tiempo únicos junto con una carga bacteriana interna. D. melanogaster se infectó oralmente con P. aeruginosa o P. entomophila. La infección oral exitosa ocurrió después de un período de exposición de 12 o 24 horas a cultivos bacterianos.Fue necesario utilizar un cultivo más concentrado de P. entomophila. Las moscas R de Oregón macho y hembra eliminaron la infección por P. aeruginosa a la misma velocidad y eliminaron el mismo número de UFC de P. aeruginosa. Sin embargo, cuando se infectaron con P. entomophila, las moscas R de Oregón macho y hembra difirieron en el número de bacterias excretadas de manera dependiente del tiempo.Hombres y mujeres murieron por P. aeruginosa y P. entomophila a diferentes ritmos. En comparación, las moscas mutantes que carecen de la matriz peritrófica protectora en el epitelio intestinal mueren más rápido, al igual que las mutantes que carecen de una vía inmunitaria IMD funcional. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo infectar Drosophila por vía oral con bacterias y medir aspectos clave de la patología resultante, como la vida útil y la diseminación bacteriana.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar alrededor de seis a ocho horas, en un transcurso de dos días, si se realiza correctamente. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la qRT-PCR, para responder a preguntas adicionales, como cómo la infección cambia la expresión génica inmunitaria. No olvide que trabajar con patógenos bacterianos puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como usar el equipo de protección personal adecuado y trabajar dentro de una campana de flujo laminar al realizar estos procedimientos.

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Investigación

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Biología

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