Un análisis basado en la citometría de flujo para medir el potencial de membrana mitocondrial en miocitos cardiacos después de hipoxia/Reoxygenation

Este método puede ayudar a medir el efecto de la hipoxia/reoxigenación en las células en el potencial de membrana mitocondrial, y se puede utilizar para evaluar si un agente es protector contra una lesión. La principal ventaja de este ensayo es que la MMP detectada por ella es en función de factores como el tamaño mitocondrial. Además, tiene un bajo requerimiento de materiales y resplandor.

Comience con un 70% de miocitos cardíacos humanos confluentes en una placa de seis pocillos. Después de lavar las células con solución salina tampón de fosfato, agregue el fármaco o vehículo en dos mililitros de suero y DMEM sin glucosa. Incubar en una incubadora de cultivo celular que contenga 5% de CO2 y 95% de aire a 37 grados centígrados durante 30 minutos antes de la hipoxia.

Después de 30 minutos, coloque el plato de miocitos cardíacos humanos en un frasco anhipóxico hermético de 2,5 litros. Equipado con un catalizador para eliminar el oxígeno libre y un indicador anaerobio para medir la tensión de oxígeno en el medio. Coloque el frasco en la incubadora de cultivo de tejidos.

El color del indicador anaerobio cambia de azul claro en ambiente normóxico a blanco pálido en condiciones hipóxicas. Reoxigena los miocitos cardíacos humanos retirando la placa de seis pocillos del frasco y colocándola en el estante de la incubadora durante dos horas. Después de la reoxigenación, enjuague las células con un mililitro de PBS precalentado y agregue 0,5 mililitros de tripsina precalentada al 25% a lo largo de la pared del pocillo.

Incubar a 37 grados centígrados durante aproximadamente un minuto hasta que todos los miocitos cardíacos humanos estén casi desprendidos. A continuación, añada un mililitro de medio completo DMEM a los pocillos para neutralizar la tripsina. Transfiera la suspensión de la celda a un tubo de centrífuga de 15 mililitros y granule HCM centrifugando a 500 veces G durante tres minutos, a temperatura ambiente.

Después de la centrifugación, aspire cuidadosamente el sobrenadante sin alterar los gránulos. A continuación, añada 5 mililitros de medio completo para miocitos cardíacos humanos y 5 mililitros de solución de trabajo JC-1 a cada tubo. Vuelva a suspender los HCM pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

Cubra los tubos con papel de aluminio para evitar el blanqueo del indicador fluorescente e incube las células en condiciones normales durante 20 minutos. Después de peletizar los miocitos cardíacos humanos centrífugados a 500 veces G durante tres minutos en una centrífuga preenfriada a cuatro grados centígrados, enjuague las células dos veces con dos mililitros de tampón de tinción JC-1 helado. Después del segundo enjuague, vuelva a suspender los miocitos cardíacos humanos en 300 microlitros de tampón de tinción helado.

Y filtre las muestras en los tubos de muestra respectivos. Analice las células mediante citometría de flujo en 30 minutos. Encienda el citómetro de flujo y asegúrese de que el software esté conectado.

Realizar la puesta en marcha fluida. Inicie la transmisión y configure la interrupción. Abra dos ventanas de diagrama de puntos en el software de citometría de flujo.

Seleccione la luz dispersa hacia adelante en el eje X y la luz dispersa lateral en el eje Y en el primer diagrama de puntos. Representar las características de las celdas en términos de su tamaño y su granularidad, respectivamente. Seleccione el canal de detección PE para el eje Y.

Y FITC para el eje X, utilizando una escala logarítmica en el segundo gráfico de puntos, que se utiliza para medir la intensidad de la fluorescencia del tinte JC-1 en las células. Haga clic en descargar para dejar salir el brazo de soporte del tubo y coloque el tubo de muestra en blanco que contiene miocitos cardíacos humanos que no se han teñido con JC-1. Haga clic en cargar para devolver el brazo de soporte a su posición de trabajo.

Haga clic en grabar para recoger las partículas de la suspensión en el tubo de muestra en blanco. Y ajuste los voltajes de los canales de fluorescencia en el segundo gráfico de puntos. Cierre la población de células para su posterior análisis en el primer diagrama de puntos.

A continuación, analice los miocitos cardíacos humanos. Visualice las estadísticas de cada tubo de muestra y calcule las MMP de cada muestra dividiendo la relación entre la intensidad de la harina roja y la intensidad de la harina verde. La hipoxia y la reoxigenación inducen significativamente la apoptosis de los miocitos cardíacos humanos, en comparación con las células normales según lo medido por la relación PI de anexina.

una medicina tradicional china con efectos cardioprotectores, previno la apoptosis de las MCH después de la hipoxia/reoxigenación. Como se muestra aquí, la relación rojo/verde JC-1 después del tratamiento con el CCP mitocondrial fue casi nula. Consistente con los resultados del ensayo de apoptosis.

El grupo tratado con H/R mostró una relación rojo/verde significativamente más baja, en comparación con el grupo normal. Y revirtió ese cambio de proporción. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las células cargadas con JC-1 deben iniciarse en un tampón estacionario helado, ya que la temperatura tiene un efecto considerable en la estabilidad del potencial de membrana mitocondrial.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la manipulación genética, para responder a preguntas adicionales, como si la disminución de MMP se debe a la apertura de MPTP.