Name: Un análisis basado en la citometría de flujo para medir el potencial de membrana mitocondrial en miocitos cardiacos después de hipoxia/Reoxygenation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Aprende a medir el potencial de membrana mitocondrial en miocitos cardiacos humanos tras hipoxia/reoxigenación mediante citometría de flujo con JC-1. Este ensayo evalúa agentes protectores.

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Este estudio fue apoyado por becas de la investigación clave nacional y programa de desarrollo de China (Nº 2017YFC1700503), el programa nacional de investigación básica (programa 973) de China (No.2012CB518602), la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (no. 81370223 y Nº 81573957) y la Fundación de investigación innovadora de los postgrados de Peking Union Medical College (2016-1002-01-02).

1. preparación de reactivos y soluciones
<ol><li>Preparar el medio completo de miocitos cardiacos humanos (HCMs) añadiendo 25 mL de mezcla de suplemento del medio de crecimiento del miocito a 500 mL de medio de crecimiento del miocito según las instrucciones del fabricante. Almacenar a 4 ° C y caliente a 37 ° C antes de usar.</li>
	<li>Preparar solución de Tongxinluo (TXL) disolviendo polvo ultrafino TXL en suero glucosa-libre de Dulbecco modificado medio de águila (DMEM) y ajustar la concentración de TXL a 400 μg/mL mediante la adición de DMEM (para más detalles, véase11). Almacenar a 4 ° C y caliente a 37 ° C antes de usar.</li>
	<li>Preparar 5 mL de solución de trabajo de JC-1 añadiendo 25 μl de la solución madre (200 x) JC-1, 4 mL de agua ultrapura y 1 mL de caldo coloración buffer (x 5) en un tubo de centrífuga de 15 mL en la oscuridad. Pipetear la mezcla arriba y abajo varias veces y caliente a 37 ° C antes de usar.</li>
	<li>Prepare 30 mL de tampón de tinción de trabajo agregando 24 mL de agua ultrapura a 6 mL de stock buffer (x 5) en un tubo de centrífuga de 50 mL de tinción. Utilice esta solución helada.</li>
</ol>2. establecimiento del modelo de hipoxia/Reoxygenation
<ol><li>Células por pozo con medio completo de HCM en una placa de la pozo 6 en placa de 1.0 x 105 . Crecer para llegar a una confluencia de 70% en un incubador de células que contiene 5% CO2 y 95% aire a 37 ° C.</li>
	<li>HCMs lavar con solución salina buffer fosfato (PBS). Exponerlos a diferentes tratamientos (400 μg/mL TXL o no) en 2 mL de suero glucosa-libre DMEM 30 min antes de la hipoxia en un incubador de células que contiene 5% CO2 y 95% aire a 37 ° C.</li>
	<li>Incubar adoptadas en un tarro hermético e hipóxico (2.5 L) equipado con un catalizador para buscar oxígeno libre e inducir hipoxia por 18 h (figura 1A) y un indicador anaerobio para medir la tensión de oxígeno en el medio11,12, 13, en un incubador de células que contiene 5% CO2 y 95% aire a 37 ° C. Nota: Tarda aproximadamente 1,5 horas para el catalizador de barrido de oxígeno libre en la jarra. Por lo tanto, el HCMs se mantienen en la jarra de 19,5 h antes de abrir el frasco. El color del indicador de anaerobios cambia de azul claro en medio ambiente normoxic a blanca palidez en condición hipóxica (figura 1B).</li>
	<li>Reoxygenate adoptadas mediante el movimiento de la placa de la pozo 6 en una incubadora a 37 ° C con 5% CO2 y 95% aire durante 2 h.</li>
</ol>3. preparación de HCMs para citometría de flujo
<ol><li>Calentar la solución de ácido (EDTA) 0.25% tripsina-etilendiaminotetracético y PBS a 37 ° C.</li>
	<li>Aspirar el medio de cada pozo, lavar las células con 1 mL de PBS y añadir 0,5 mL de tripsina 0.25% a lo largo de la pared del pozo.</li>
	<li>Incubar a 37 ° C hasta que todas adoptadas son casi independiente (1 min.).</li>
	<li>Añadir 1 mL de medio completo DMEM (medio DMEM con 10% suero bovino fetal) en los pocillos para neutralizar la tripsina. Transferir la suspensión de células a un tubo de centrífuga de 15 mL y pelotilla adoptadas por centrifugación a 500 x g durante 3 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Cuidadosamente aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet.</li>
	<li>Agregar 0,5 mL de medio completo de HCM y 0,5 mL de solución de trabajo de JC-1 para cada tubo. Resuspender las adoptadas mediante pipeteo arriba y abajo.</li>
	<li>Cubrir los tubos todo con papel de aluminio para evitar la decoloración del indicador fluorescente e incubar adoptadas en condiciones normales (a 37 ° C con 5% CO2 y 95% aire) durante 20 minutos.</li>
	<li>Pelotilla adoptadas por centrifugación a 500 x g durante 3 min a 4 ° C.</li>
	<li>Enjuague adoptadas dos veces con 2 mL de tampón de tinción de JC-1 helado.</li>
	<li>Suspender adoptadas en un volumen final de 300 μL de tampón de tinción helada en el tubo de ensayo (12 x 75 mm) y utilizar las células para su análisis dentro de 30 minutos. Nota: Use carbonilo cianuro m-clorofenil hidrazona (CCCP), un potente inhibidor de la cadena de transporte de electrones respiratoria, para tratar adoptadas por 1 h a una concentración de 20 μm, para el control positivo.</li>
</ol>4. configuración de citómetro de flujo de
<ol><li>Inicie el citómetro de flujo y asegúrese de que el software está conectado a él.</li>
	<li>Realizar arranque fluídicas, comenzar la corriente y fijar el quiebre.</li>
	<li>Abrir dos ventanas de trama de punto en el software de citometría de flujo.<ol>
<li>Seleccione avance dispersa luz (FSC) en el eje X y lado dispersada (SSC) en el eje Y en la primera parcela de puntos para representar las características de las células en cuanto a su tamaño y su granularidad, respectivamente.</li>
		<li>Seleccione el canal de detección de PE (575 ± 26 nm) para el eje Y y FITC (530 ± 30 nm) para el eje X en escala logarítmica de la segunda trama de punto, que se utiliza para medir la intensidad de la fluorescencia del tinte de JC-1 en las células.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. flujo Cytometry medición y análisis de datos
<ol><li>Haga clic en descarga para que el tubo soporte brazo y colocar el espacio en blanco (adoptadas que no han sido teñidos con JC-1) muestra el tubo en él. Haga clic en carga para devolver el brazo de soporte del tubo a la posición de trabajo.</li>
	<li>Haga clic en registro para recoger las partículas en suspensión en el tubo de muestra en blanco y luego la población de la célula (P1) de la puerta para su posterior análisis en la primera parcela de punto (figura 3).</li>
	<li>Recoger adoptadas en otros tubos de muestras y optimizar la medición mediante el ajuste de los voltajes de los canales de fluorescencia, para asegurarse de que el punto de la célula se encuentra en la zona central de la segunda trama de punto.</li>
	<li>Mostrar las estadísticas de cada tubo de muestras y calcular la MMP de cada muestra dividiendo la relación de intensidad de fluorescencia roja de intensidad de fluorescencia verde.</li>
</ol>

<ol><li>Anderson, J. L., Morrow, D. A. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1606915">Acute Myocardial Infarction.</a> New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).</li>
<li>Ibanez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESC+Guidelines+for+the+management+of+acute+myocardial+infarction+in+patients+presenting+with+ST-segment+elevation%3A+The+Task+Force+for+the+management+of+acute+myocardial+infarction+in+patients+presenting+with+ST-segment+elevation+of+the+European+Society+of+Cardiology+%28ESC%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC).</a> European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).</li>
<li>Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Myocardial reperfusion injury.</a> New England Journal of Medicine. 357 (11), 1121-1135 (2007).</li>
<li>Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition+pore+and+its+role+in+myocardial+ischemia+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).</li>
<li>Heusch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+cardioprotection%3A+signal+transduction+in+ischemic+pre-%2C+post-%2C+and+remote+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning.</a> Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).</li>
<li>Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+an+isolated+mitochondrial+population+revealed+by+cytofluorometric+analysis+at+the+single+organelle+level%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level.</a> Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).</li>
<li>Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+and+glutamate+excitotoxicity+in+cultured+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells.</a> Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).</li>
<li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient%3A+a+practical+usage+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).</li>
<li>Cossarizza, A., Salvioli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+mitochondrial+membrane+potential+using+JC-1%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 14(2001).</li>
<li>Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JC-1%2C+but+not+DiOC6%283%29+or+rhodamine+123%2C+is+a+reliable+fluorescent+probe+to+assess+delta+psi+changes+in+intact+cells%3A+implications+for+studies+on+mitochondrial+functionality+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis.</a> FEBS Letters. 411 (1), 77-82 (1997).</li>
<li>Chen, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+miR-128-3p+by+Tongxinluo+Protects+Human+Cardiomyocytes+from+Ischemia%2Freperfusion+Injury+via+Upregulation+of+p70s6k1%2Fp-p70s6k1%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 775(2017).</li>
<li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+autophagy+by+Tongxinluo+through+the+MEK%2FERK+pathway+protects+human+cardiac+microvascular+endothelial+cells+from+hypoxia%2Freoxygenation+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidic+acid+protects+mesenchymal+stem+cells+against+hypoxia+and+serum+deprivation-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis.</a> Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).</li>
<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/9/pdb.prot065490.short">Labeling mitochondria with JC-1.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).</li>
<li>Pravdic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetic-induced+preconditioning+delays+opening+of+mitochondrial+permeability+transition+pore+via+protein+Kinase+C-epsilon-mediated+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway.</a> Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Excessive+Histone+Deacetylases+Activity+in+Diabetic+Hearts+Attenuates+Myocardial+Ischemia%2FReperfusion+Injury+via+Mitochondria+Apoptosis+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway.</a> Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065(2017).</li>
<li>Qiu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin-induced+melanoma+cell+death+is+associated+with+mitochondrial+permeability+transition+pore+%28mPTP%29+opening%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).</li>
<li>Zhen, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P53+dependent+mitochondrial+permeability+transition+pore+opening+is+required+for+dexamethasone-induced+death+of+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts.</a> Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).</li>
<li>Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nox2+as+a+potential+target+of+mitochondrial+superoxide+and+its+role+in+endothelial+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).</li>
<li>Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+mitochondrial+KATP+channel+on+voltage-gated+K%2B+channel+in+24+hour-hypoxic+human+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medical+Journal+%28Engl%29%22%5BJournal%5D)">Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).</li>
<li>Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neuroprotective+Effects+of+Hypothermia+on+Bilirubin-Induced+Neurotoxicity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neonatology%22%5BJournal%5D)">The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro.</a> Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).</li>
<li>Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+activation+by+Jiang+Zhi+Granule+protects+against+metabolic+stress-induced+hepatocyte+injury%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury.</a> World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).</li>
<li>El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renoprotective+Effects+of+Aldose+Reductase+Inhibitor+Epalrestat+against+High+Glucose-Induced+Cellular+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury.</a> Biomed Research International. 2017, 5903105(2017).</li>
<li>Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Liver+Mitochondria+Isolation%2C+Size+Fractionation%2C+and+Real-time+MOMP+Measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement.</a> Bio-Protocols. 6 (15), (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, presentamos un protocolo que utiliza tinte JC-1 para evaluar la MMP de células después de estar expuesto a H/R. detectado por análisis de JC-1, MMP de células es independiente de factores tales como tamaño mitocondrial, forma y densidad que puede influir en la fluorescencia del solo-componente señales de14. En consecuencia, los resultados del ensayo de JC-1 son relativamente confiables. Además, es conveniente y ahorro de tiempo para realizar el ensayo de JC-1. Este ensayo tiene un requisito ...

Enfermedad coronaria es la principal causa de muerte en todo el mundo. El tratamiento de elección para reducir lesión isquémica y limitar el tamaño del infarto en pacientes con segmento ST elevan de infarto de miocardio es oportuna y eficaz la reperfusión miocárdica mediante intervención coronaria percutánea (ICP) primaria1, 2. Sin embargo, la reperfusión causa daño adicional, que puede suponer hasta un 30% del tamaño final del infarto3. Se reconoce universalmente que el poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP) no es sólo central en mitocondrial daño y muerte celular durante la isquemia/reperfusión (me / R), pero es también un objetivo convergente de cardioprotectores señalización4 , 5. como la apertura del mPTP traería sobre la despolarización de la membrana mitocondrial interna potencial (MMP)4, detectamos la apertura del mPTP usando el 5, 5, 6, 6 '-Tetrachloro-1, 1, 3, 3′-Tetraetil-imidacarbocyanineiodide (JC-1) ensayo.
El ensayo de JC-1 es un método cytofluorimetric que es cualitativa y cuantitativa, y ha sido validado mediante el análisis de la MMP en el nivel de una sola mitocondria6. JC-1 existe como un agregado, rindiendo un rojo a emisión color naranja (590 ± 17,5 nm) en la matriz de la mitocondria con MMP normal; con la pérdida de MMP, JC-1 se convierte en la forma monomérica que produce fluorescencia verde con una emisión de 530 nm ± 15. Por lo tanto, una disminución en el cociente de la intensidad de fluorescencia roja/verde podría indicar la reducción de MMP en condiciones como la isquemia/reperfusión (me / R).
Además de JC-1, MMP también se ha estudiado con membrana permeable cationes lipofílicos como rodamina 123 y 3, 3′ dihexyloxadicarbocyanine yoduro [DiOC6(3)]. Sin embargo, en comparación con estas dos sondas, JC-1 es más confiable para el análisis de MMP. Rodamina 123 tiene sensibilidad relativamente pobre (especialmente en modo7,8de amortiguamiento) y la pobre especificidad. El cambio en rodamina 123 a veces es tan pequeño que es difícil para los investigadores o equipos para observar/detectar. Además, en una sola célula, existen sitios de Unión diferentes mitocondrias de rodamina 123 y así ello tenga fluorescencia diferentes emisiones9. DiOC6(3) no se recomienda para la detección de MMP o como reacciona sensiblemente a la despolarización de la membrana plasmática10.
Por lo tanto, aquí utilizamos el JC-1 ensayo para evaluar la MMP de HCMs después de ser expuestos a hipoxia/reoxygenation con o sin un agente protector.

<table><tbody><tr><td>Kit de ensayo de potencial de membrana mitocondrial con JC-1</td><td>Beyodtime, China</td><td>C2006</td><td>En el kit hay solución madre JC-1 (200 veces), tampón de tinción estándar (5 veces) y CCCP (10 mM)</td></tr> <tr><td>Polvo ultrafino Tongxinluo</td><td>Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China</td><td>071201</td><td></td></tr><tr><td>Anexina V-FITC / PI Kit</td><td>Becton-Dickinson, EE. UU.</td><td>556547</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies, Grand Island Biological Company, EE. UU.</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Miocito cardíaco humano</td><td>Promocell, Alemania</td><td>C-12810</td><td></td></tr><tr><td>Medio de crecimiento de miocitos (SupplementMix)</td><td>Promocell, Alemania</td><td>C-39275</td><td></td></tr><tr><td>Medio de crecimiento de miocitos (listo para usar)</td><td>Promocell, Alemania</td><td>C-22070</td><td>utilizado con el medio de crecimiento de miocitos SupplementMix</td></tr><tr><td>GENbox</td><td>BioM&eacute; rieux, Marcy l' Etoile, Francia</td><td>96127</td> Catalizador de <td>2.5L</td></tr><tr><td>(AnaeroPack)</td><td>MITSUBISHI GAS CHEMICAL&nbsp; COMPAÑÍA, INC.&nbsp;, Japón</td><td>&nbsp; C-1</td><td></td></tr><tr><td>Indicador anaeróbico</td><td>BioM&eacute; rieux, Marcy l' Etoile, Francia</td><td>96118</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro</td><td>de flujo Becton-Dickinson, EE. UU.</td><td>FACSAria 2</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software</td><td>Becton-Dickinson, EE. UU</td><td></td>. <td>Versión8.0.1</td></tr><tr><td>Tubo de muestra</td><td>Corning science, EE. UU.</td><td>352054</td><td>12 * 75 mm</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone, EE. UU</td>. <td>SH30256.01</td><td></td></tr></tbody></table>

un análisis basado en la citometría de flujo para medir el potencial de membrana mitocondrial en miocitos cardiacos después de hipoxia/reoxygenation

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Oportuna y eficiente la reperfusión de la arteria coronaria ocluida es la mejor estrategia para disminuir el tamaño del infarto miocardio en pacientes con un segmento ST elevado de infarto de miocardio. Sin embargo, la reperfusión por sí puede provocar más muerte de cardiomiocitos, un fenómeno conocido como lesión de la reperfusión. La apertura del poro de transición de la permeabilidad mitocondrial (mPTP), con la disminución del potencial de membrana mitocondrial (MMP), o la despolarización mitocondrial, es reconocida universalmente como el paso final de daño por reperfusión y es responsable de mitocondrial y de la muerte de los cardiomiocitos. JC-1 es un colorante catiónico lipofílico que se acumula en las mitocondrias dependiendo del valor de MMP. Cuanto más alto es el MMP, más JC-1 se acumula en la mitocondria. Las crecientes cantidades de JC-1 en la mitocondria pueden ser reflejadas por un cambio de emisión de fluorescencia verde (~ 530 nm) a rojo (~ 590 nm). Por lo tanto, la reducción de la relación de intensidad de fluorescencia roja/verde puede indicar la despolarización de las mitocondrias. Aquí, tomamos ventaja de JC-1 para medir la MMP o la apertura del mPTP en miocitos cardiacos humanos después de la hipoxia/reoxygenation, detectado mediante citometría de flujo.

Antes de realizar el ensayo de JC-1 para evaluar los cambios de MMP, se recomienda encarecidamente que se realizaron experimentos confirmar las condiciones de éxito establecido por los investigadores. Como se muestra en los resultados de citometría de flujo (figura 2), en comparación con el grupo normal, hipoxia/reoxygenation (H/R) indujo significativamente la apoptosis de HCMs (anexina V + /PI±), indicando que habíamos establecido un modelo basado en la célu...

Aquí, presentamos un protocolo que utiliza tinte JC-1 para evaluar el potencial de membrana mitocondrial de las células después de ser expuestos a hipoxia/reoxygenation con o sin un agente protector.

Un análisis basado en la citometría de flujo para medir el potencial de membrana mitocondrial en miocitos cardiacos después de hipoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Este método puede ayudar a medir el efecto de la hipoxia/reoxigenación en las células en el potencial de membrana mitocondrial, y se puede utilizar para evaluar si un agente es protector contra una lesión. La principal ventaja de este ensayo es que la MMP detectada por ella es en función de factores como el tamaño mitocondrial. Además, tiene un bajo requerimiento de materiales y resplandor.Comience con un 70% de miocitos cardíacos humanos confluentes en una placa de seis pocillos. Después de lavar las células con solución salina tampón de fosfato, agregue el fármaco o vehículo en dos mililitros de suero y DMEM sin glucosa. Incubar en una incubadora de cultivo celular que contenga 5% de CO2 y 95% de aire a 37 grados centígrados durante 30 minutos antes de la hipoxia.Después de 30 minutos, coloque el plato de miocitos cardíacos humanos en un frasco anhipóxico hermético de 2,5 litros. Equipado con un catalizador para eliminar el oxígeno libre y un indicador anaerobio para medir la tensión de oxígeno en el medio. Coloque el frasco en la incubadora de cultivo de tejidos.El color del indicador anaerobio cambia de azul claro en ambiente normóxico a blanco pálido en condiciones hipóxicas.

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Saponina permeabilized preparación de la fibra junto con el análisis de la fosforilación oxidativa respirométrica proporciona una evaluación integradora de la función mitocondrial. Respiración mitocondrial en los estados fisiológicos y patológicos pueden reflejar diferentes influencias regulatorias, incluidas las interacciones mitocondrial, la morfología y la bioquímica.

Evaluación de respirometría la fosforilación oxidativa en saponina-permeabilized fibras cardíacas

Un protocolo espectrofluorométrico para la medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial en el corazón de ratón mitocondrias aisladas se presenta aquí. El ensayo involucra la medición simultánea de las mitocondrias...

Multi-parámetro de medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad en el corazón del ratón mitocondrias aisladas

Este video muestra el marcaje de células neuronales con anticuerpos para complejos de cadenas respiratorias mitocondriales, proteínas asociadas al ADN mitocondrial y proteínas de la membrana externa mitocondrial, seguido de citometría de flujo para cuantificar sus niveles.

Medición de Múltiples Parámetros Mitocondriales en Neuronas mediante Citometría de Flujo

Se describe aquí es un método para detectar y cuantificar proteínas de la membrana externa mitocondrial por inmunomarcaje de las mitocondrias aisladas de tejido de roedores y análisis por citometría de flujo. Este método puede ampliarse para evaluar los aspectos funcionales de subpoblaciones mitocondriales.

La inmunodetección de la membrana externa proteínas por Citometría de Flujo de mitocondrias aisladas

El objetivo de este protocolo es ilustrar cómo utilizar cardiomiocitos neonatales de ratón como modelo para analizar cómo diversos factores pueden alterar el consumo de oxígeno en el corazón.

Analizando la tasa de consumo de oxígeno en los cardiomiocitos neonatales primario de ratón cultivadas utilizando un analizador de flujo extracelular

Las bombas de eflujo xenobiótico son muy activas en células hematopoyéticas madre y progenitoras (HSCCP) y causan extrusión de TMRM, un tinte fluorescente potencial de membrana mitocondrial. Aquí, presentamos un protocolo para medir con precisión el potencial de la membrana mitocondrial en los HSCCP por TMRM en presencia de Verapamil, un inhibidor de la bomba de eflujo.

Mejorar la precisión de la evaluación citométrica de flujo del potencial de la membrana mitocondrial en células hematopoyéticas de tallo y progenitor a través de la inhibición de las bombas de eflujo

Aquí describimos un método confiable para medir la masa mitocondrial y el potencial de membrana en células madre hematopoyéticas cultivadas ex vivo y células T.

Medición de la masa mitocondrial y el potencial de la membrana en células madre hematopoyéticas y células T por citometría de flujo

Los distintos efectos de los diferentes grados de hipotermia en la protección miocárdica no han sido evaluados a fondo. El objetivo del presente estudio era cuantificar los niveles de muerte celular tras diferentes tratamientos de hipotermia en un modelo humano basado en cardiomiocitos, sentando las bases para futuras investigaciones moleculares en profundidad.

Evaluación in vitro de la protección miocárdica después del preaccondicionamiento de hipotermia en un modelo de miocitos cardíacos humanos

Este estudio informa un enfoque novedoso para medir múltiples parámetros funcionales mitocondriales basados en citometría de flujo y tinción doble con dos reporteros fluorescentes o anticuerpos para detectar cambios en el volumen mitocondrial, el potencial de la membrana mitocondrial, el nivel de especies reactivas de oxígeno, la composición de la cadena respiratoria mitocondrial y el ADN mitocondrial.

Análisis citométrico de flujo de múltiples parámetros mitocondriales en células madre pluripotentes inducidas por humanos y sus derivados neuronales y gliales

Aquí, presentamos una compilación de ensayos para medir directamente la función mitocondrial en células de mamíferos independientemente de su capacidad para consumir oxígeno molecular.

Ensayos independientes del oxígeno para medir la función mitocondrial en mamíferos

Aprende a medir el potencial de membrana mitocondrial en miocitos cardiacos humanos tras hipoxia/reoxigenación mediante citometría de flujo con JC-1. Este ensayo evalúa agentes protectores.

Un análisis basado en la citometría de flujo para medir el potencial de membrana mitocondrial en miocitos cardiacos después de hipoxia/Reoxygenation (Video) | JoVE Journal

Un análisis basado en la citometría de flujo para medir el potencial de membrana mitocondrial en miocitos cardiacos después de hipoxia/Reoxygenation

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