Caracterización de las glicoproteínas con el doblez de la inmunoglobulina por cristalografía de rayos x y técnicas biofísicas

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las glicoproteínas. Proporciona información sobre la función de la proteína, el papel de los glicanos ligados a N y el mecanismo y la acción de los antibióticos dirigidos a la glicoproteína. La principal ventaja de esta técnica es que se puede aplicar a cualquier glicoproteína de interés.

Facilitar la caracterización estructural y biofísica de una amplia gama de dianas glicoproteicas. La demostración de este procedimiento estará a cargo de Hong Cui, coordinador de proyectos de investigación en nuestro laboratorio. Para comenzar, prepare y transfecte las células como se describe en el protocolo de texto.

Recolectar las células por centrifugación a 6, 371 veces g y cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Retenga el sobrenadante y luego use un filtro de 0,22 micras para filtrarlo. Cargue el sobrenadante filtrado a cuatro mililitros por minuto en una columna de Ni-NTA en un sistema de cromatografía de sobremesa.

Después de esto, lave la columna con tres o cuatro volúmenes de tampón de lavado. Diluir la glicoproteína purificada de la columna utilizando un gradiente de tampón de elución, mientras se recogen las fracciones. Tire de las fracciones que contienen el pico eludido en un dispositivo de filtración centrífuga con un límite de peso molecular nominal de 10 kilodalton.

A continuación, concentrar centrifugando a 4.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 15 minutos o hasta que la muestra alcance un volumen de 500 microlitros. Inyecte la glicoproteína concentrada en un circuito de muestra de 500 microlitros. Cargue la glicoproteína en una columna de exclusión de tamaño preequilibrada de alto rendimiento en un sistema FPLC a cuatro grados Celsius mientras recolecta fracciones.

Después de esto, ejecute un gel SDS-PAGE para identificar qué fracciones eludidas contienen la glicoproteína y extraiga las que sí lo hacen. Utilizando un dispositivo de filtración centrífuga con un límite de peso molecular nominal de 10 kilodaltons, concentre ECD puro desglicosilado a 4.000 veces G y cuatro grados Celsius hasta obtener la concentración deseada. Después de determinar la concentración de proteínas, centrifugar la muestra a 12.000 veces G y cuatro grados Celsius durante cinco minutos, para eliminar el polvo y otros contaminantes.

A continuación, agregue 80 microlitros de solución de cristalización de una pantalla de cristalización comercial a cada pozo del depósito en una placa de cristalización de gota de 96 pocillos. Utilice un robot de cristalización para dispensar gotas de proteína en los pocillos de la placa de cristalización. Usando un volumen total de gota de 200 nanolitros en una proporción de uno a uno de proteína purificada a solución de cristalización.

Después de esto, selle la placa con cinta adhesiva. Transfiera la placa sellada a un generador de imágenes de placas para su inspección con luz visible y ultravioleta. Identifique las condiciones que dan a las cabezas de cristal de glicoproteína iniciales y optimice aún más estos cristales como se describe en el protocolo de texto.

Crioproteja los cristales sumergiéndolos en una solución de licor madre suplementada con un 20% de glicerol. A continuación, monta los cristales en CryoLoops. Usando nitrógeno líquido, congele rápidamente los cristales montados antes de la recopilación de datos.

Después de producir cristales bien difractados en una placa de cristalización de 24 pocillos, prepare una solución madre de 50 milimolares de ligando y 20 milimolares de Tris a pH 9.0 con 150 milimolares de cloruro de sodio. Añadir varias concentraciones de esta solución de ligando a la gota previamente preparada que contiene los cristales de ECD. Selle la gota para duraciones de tiempo de incubación que oscilan entre cinco minutos y cinco días.

Usando un microscopio óptico, rastree visualmente los cristales para identificar cualquier posible cambio en la morfología. Después de la incubación, monte los cristales con CryoLoops y protéjalos en una solución de licor madre suplementada con un 20% de glicerol. Para comenzar la interferometría de biocapa, prepare 50 milímetros de 1X Kinetics Buffer a partir de 10X Kinetics Buffer como se describe en el protocolo de texto.

Agregue 200 microlitros de este tampón a una placa de prehumectación. Transfiera seis biosensores de Ni-NTA a la placa y déjelos hidratar en el tampón durante 10 minutos. A continuación, diluya la ECD marcada con His en un mililitro de 1X Kinetics Buffer a una concentración final de 25 nanogramos por microlitro.

Y preparar diluciones en serie del FAB purificado. Ahora aqua los reactivos en una microplaca de 96 pocillos, como se ve aquí. Donde B representa el tampón cinético 1X, L representa la carga de glicoproteínas marcadas con His, las entradas numéricas representan las concentraciones de FAB diluidas y R representa el tampón de regeneración.

Transfiera los biosensores hidratados a pocillos que contengan 1X Kinetics Buffer durante 60 segundos para establecerlos como referencia. Luego, cargue la glicoproteína a una concentración de 25 nanogramos por microlitro durante 240 segundos a 1.000 RPM. Vuelva a colocar los biosensores en los pocillos que contienen 1X Kinetics Buffer durante 60 segundos para una segunda línea de base.

Transfiera los sensores a los pocillos que contienen las diluciones en serie de FAB durante 180 segundos. Después de esta fase de asociación, transfiera los biosensores de nuevo a 1X Kinetics Buffer para un paso de disociación de 180 segundos. A continuación, abra el software de análisis.

En la pestaña uno, importe y luego seleccione los datos. En la pestaña dos, paso uno, selección de datos, elija selección de sensor. Resalte los pozos de referencia y, a continuación, haga clic con el botón derecho para definir el pozo de referencia.

En el paso dos, resta, seleccione pozos de referencia. Después de esto, en el paso tres alinear el eje Y, seleccione la línea de base y establezca un rango de tiempo de 0,1 segundos a 59,8 segundos. En el paso cuatro, seleccione la corrección entre pasos y alinee con la disociación.

A continuación, en el paso cinco, procese el filtrado de Savitzky-Golay y haga clic en procesar datos. La puerta a la pestaña tres. En el paso dos, analice con un modelo uno a uno, seleccione asociación y disociación, seleccione ajuste global y agrupe por color.

Haga clic con el botón derecho en las curvas, haga clic en establecer color y establezca todas las curvas en los colores deseados. Después de esto, seleccione ajustar curvas. Si los datos están bien ajustados, exporte el resultado haciendo clic en Guardar informe.

Repita el experimento para todas las condiciones deseadas. En este estudio, varias construcciones del dominio extracelular CD22 se clonan con éxito en el vector de expresión pHL-sec. Estos constructos se sobreexpresan en las líneas celulares HEK293-F y HEK293-S de mamíferos.

Mientras que los cultivos que contenían aproximadamente un millón y un millón y medio de células por mililitro, expresaron niveles muy similares de glicoproteínas. Los cultivos de solo medio millón de células por mililitro expresaron notablemente menos. Después de esto, se cosechan los cultivos y se aísla la glicoproteína ECD mediante cromatografía de afinidad y exclusión por tamaño para purificar todas las construcciones a la homogeneidad del tamaño.

Produciendo una muestra de alta pureza para cristalización y estudios biofísicos. Siguiendo estos procedimientos, se pueden realizar otros métodos como la microscopía electrónica de partículas singulares para responder preguntas adicionales sobre la estructura tridimensional del dominio extracelular de longitud completa o complejos de proteínas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo expresar, purificar y caracterizar estructural y biofísicamente las glicoproteínas, sus ligandos y los anticuerpos dirigidos.