Name: Caracterización de las glicoproteínas con el doblez de la inmunoglobulina por cristalografía de rayos x y técnicas biofísicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprende a caracterizar glicoproteínas con plegado de inmunoglobulina mediante cristalografía de rayos X e interferometría de biocapa. Estas técnicas biofísicas permiten analizar interacciones proteína-ligando en tiempo real.

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Experimentos de difracción de rayos x se describe en este documento fueron realizados utilizando líneas ID-08 y 08-BM en la fuente de luz canadiense, que es apoyado por la Fundación de Canadá para la innovación, ciencias naturales y Consejo de investigación de ingeniería de Canadá, la Universidad de Saskatchewan, el gobierno de Saskatchewan, diversificación económica occidental Canadá, el Consejo de investigación nacional Canadá y los institutos canadienses de investigación en salud. Nos gustaría reconocer la estructurales y biofísicas instalaciones centrales, el Hospital para niños enfermos, para el acceso a los instrumentos de ITC y BLI. J.E.O. fue apoyado por Banting Postdoctoral Fellowship BPF-144483 de los institutos canadienses de investigación en salud. T.S. es un receptor de Canadá postgrado becas Master Award y un Vanier Canadá becas postgrado de los institutos canadienses de investigación en salud. Este trabajo fue apoyado por funcionamiento PJT-148811 (J.-P.J.) la subvención de los institutos canadienses de investigación en salud. Esta investigación fue realizada, en parte, gracias a la financiación del programa de Cátedras de investigación de Canadá (J.-P.J.).

Los autores declaran a no hay intereses contrapuestos.

Glicoproteínas ancladas a membrana son críticos para la función de la célula y atractivo dianas terapéuticas. Aquí, presentamos un protocolo para la caracterización estructural y Biofísica de la ECD de glicoproteínas de membrana, tanto solos como en complejos con ligandos de molécula pequeña y los fragmentos Fab. Con éxito hemos utilizado este protocolo para determinar la estructura cristalina de los tres dominios de Ig N-terminal-la mayor parte de la porción extracelular del humano CD2228, un correceptor crítico en las células B involucradas en mantener inmunidad humoral check79. También hemos caracterizado el sitio de unión de CD22 con su ligando natural α2-6 sialyllactose y define el modo de reconocimiento de un anticuerpo terapéutico hacia humano CD22. Estos resultados proporcionan ideas sobre la relación estructura-función de miembro de la familia de Siglecs que ha restringido la expresión en las células de B y una hoja de ruta molecular hacia el desarrollo de la nueva molécula pequeña dirigida CD22 y basados en anticuerpos terapéutica. Mientras que este protocolo fue utilizado con éxito para un receptor de la célula de B que contienen Ig, proponemos que nuestro enfoque puede ser aplicado para la caracterización estructural y Biofísica de cualquier glicoproteína de membrana con una organización de dominio distintos. En tales casos, la construcción diseño y combinatoria glycan N-ligado pueden evaluarse las mutaciones (ya sea a Gln o Ala) para encontrar una construcción conveniente para el crecimiento cristalino y difracción de alta resolución.
Obtención de una muestra homogénea y pura de la glicoproteína es de vital importancia para crecimiento cristalino y difracción de rayos x, así como para la caracterización biofísica aguas abajo. Glycans N-ligados en glicoproteínas son inherentemente heterogéneos y pueden causar heterogeneidad conformacional y química dentro de la glicoproteína que puede impedir la formación de cristales. Para reducir esta heterogeneidad micro, estrategias que introducen mutaciones puntuales para eliminar los residuos de Asn predichos para abrigar glycans N-ligados, o usando líneas celulares mutantes (como HEK293S) seguido de tratamiento con endoglycosidases (como EndoH) pueden considerablemente mejorar la cristalización éxito15,21,22. En este protocolo, se discute la purificación de glicoproteínas solubles y fábricas que son secretadas en el sobrenadante de la célula. La secreción de glicoproteínas proporciona una ruta relativamente sencilla hacia la pureza, sin la necesidad de lisis celular o la adición de productos químicos fuertes o detergentes. La célula sobrenadante, obtenido siguientes célula cosecha luego corre directamente sobre una columna que tiene afinidad por la proteína de interés (por ejemplo, Ni-NTA para su etiquetado glicoproteínas o afinidad de LC con fragmentos Fab). Sin embargo, dependiendo de la columna de uso y las condiciones de la célula sobrenadante (e.g., pH), puede verse afectada la capacidad de unión de la proteína de interés a la columna. Si este es el caso, puede ser necesario concentrar y cambio el sobrenadante celular para mejorar el enlace a la columna de búfer. Además, se recomienda emplear medidas de control de calidad durante la purificación para ayudar a evaluar la pureza de la proteína. Correr un gel de SDS-PAGE o Western blot de todas las muestras (antes, durante y después de pasos de purificación) puede producir información sobre si el esquema de purificación propuesto es adecuado para la proteína de interés. Si las bandas contaminantes están visibles en SDS-PAGE, o si varias especies se obtienen durante la purificación (por ejemplo, varios picos sobre la exclusión de tamaño), pasos de purificación adicional se debe considerar, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, para obtener en pureza y aumento de las posibilidades de cristalización aguas abajo80.
De cristalización macromolecular, a menudo es crítica para obtener altos rendimientos de la proteína de interés para permitir la proyección de un gran número de posibles condiciones de cristalización en las concentraciones de proteína alta para encontrar hits de cristal adecuado. Generalmente, las HEK293 líneas celulares aquí (HEK293F y HEK293S) son sistemas de expresión sólida y pueden fácilmente ampliarse para producir más muestra según sea necesario. Sin embargo, es posible que la proteína de interés no puede expresar suficientemente en estas líneas celulares. En estos casos, otras líneas celulares, como células de Expi293 de81,82, se han encontrado para demostrar niveles superiores de expresión de la proteína y deben ser considerados como una alternativa.
Si bien ordenados, diffracting los cristales no se después de pruebas de varias construcciones de la proteína de interés a pesar de alta pureza, puede ser necesario ampliar técnicas de cristalización para promover la formación de cristales. Se ha demostrado que fragmentos Fab de anticuerpos y nanobodies pueden ser potenciadores de excelente cristalización y promover cristal ordenado embalaje83,84,85. Estos fragmentos pueden expresados y purificados a homogeneidad y utilizados en un complejo con la proteína de interés para promover la cristalización. Lo importante, fragmentos Fab producidas como se describe en la sección 10 pueden tener una tendencia a formar no funcionales LC dímeros86. Estos dímeros son contaminantes y deben eliminarse durante la purificación. En nuestra experiencia, dímeros de LC a menudo tengan un volumen de retención diferentes de exclusión de tamaño, o responsables como un pico distinto en la cromatografía de intercambio iónico y así pueden extraerse la purificación Fab - sin embargo esto no es siempre el caso. Si estas técnicas no son suficientes para eliminar dímeros de LC de la purificación de la Fab, métodos de purificación adicional, como la purificación de la afinidad de la proteína G, pueden ser empleados para mejorar la pureza.
Alternativa a la co-complejación con fragmentos Fab, técnicas bien documentadas como microseeding de la matriz al azar pueden mejorar las posibilidades de obtención de cristales bien ordenado63,70. Este método implica la adición de pequeñas cantidades de cristales aplastados, subóptimos en la condición de la cristalización, proporcionando un cristal nuclea a promover el crecimiento del cristal. Esto puede realizarse usando cristales de la proteína de interés, o con estructura similar dominio de arquitectura y terciario. Además, microseeding de la matriz al azar se puede realizar en un intento de cristalizar la proteína sola o en conjunto con un fragmento Fab o pequeñas moléculas de interés. Los recientes avances en microscopia del cryo-electrón también hacen esta técnica una alternativa atractiva a la cristalografía de rayos x para obtener información estructural de alta resolución para moléculas con características apropiadas87,88, 89,90,91.
Cuando eliminación de conjuntos de datos de difracción de rayos x por el Señor, HA remojo puede ser necesaria para resolver el problema de la fase dispersión anómala o sustitución isomórfica. Inspección de la secuencia de aminoácidos de la proteína puede proporcionar pistas sobre la estrategia para la derivatización de HA, incluyendo el pH óptimo para el enlace. En particular, cisteínas impares dentro de la proteína pueden atar específicamente HA compuestos que contienen mercurio. Remojo cristales nativos HA compuestos es un proceso iterativo para determinar la identidad del compuesto HA óptima, su concentración y el tiempo de incubación requerido. Si los intentos de remojo iniciales no den bien diffracting cristales que contienen una HA adecuado para la eliminación, puede ser necesario introducir sustituciones de aminoácidos para mejorar la probabilidad de la Unión HA y señal anómala. Los ejemplos incluyen mutaciones para incluir un residuo de cisteína libre para enlazar eficientemente Au, Pt, Hg y Pb. expresión de proteínas para eliminación anómala en un medio de seleno-metionina suplido en e. coli se utiliza ampliamente para la eliminación anómala, sin embargo un sistema equivalente que incorpora confiablemente seleno-metionina no está fácilmente disponible para células de mamífero en suspensión92,93y es una zona de futuro desarrollo.
Una vez que se obtiene la estructura unliganded de glicoproteínas de interés, tomando los cristales con ligandos de molécula pequeña puede realizarse para obtener una estructura del complejo ligando-receptor inmune. Estos datos proporcionan un modelo para el diseño racional de ligandos más específicos y de alta afinidad que puede utilizarse como terapéutica de molécula pequeña, como también ofrece ideas de alta resolución sobre la función biológica de la glicoproteína. Al intentar remojo cristales glicoproteína con ligandos de pequeña molécula de interés, inspección de la estructura de cristal unliganded puede indicar si el remojo debe ser posible. Si cierre cristal-embalaje contactos se encuentran alrededor del sitio de unión a ligando o en regiones que sufren cambios conformacionales al ligando vinculante, tomando probablemente ser problemático. En este caso, se deben realizar otros métodos como la cristalización del complejo proteína-ligando.

Proteínas de superficie juegan papeles críticos en la función celular. A través de sus dominios extracelulares, estas proteínas de membrana pueden modular las interacciones célula-célula, adherencia, transporte y señalización1,2. La localización extracelular de estas proteínas es objetivos atractivos para el desarrollo de la terapéutica para el tratamiento de una amplia gama de enfermedades, incluyendo cáncer y enfermedades autoinmunes3,4,5 , 6 , 7. uno de los dobleces más comunes de ectodomains de proteína de la membrana humana es el pliegue de inmunoglobulina-como (Ig), que está formado por siete o más β-filamentos dispuestos en dos β-hojas8,9. Glicoproteínas que contienen Ig son típicamente, estructuras multidominio con dominios Ig secuencialmente dispuestas en la porción extracelular de la proteína de la membrana10. Modificaciones postraduccionales de estas proteínas de superficie celular, particularmente N - y O-ligado glycosylation, han demostrado que desempeñan un papel fundamental en su regulación, plegable, secreción y función11. Para mejorar nuestra comprensión de su función y a la mejor terapéutica de diseño que les puede orientar, se requieren técnicas que permiten su caracterización molecular detallada. Aquí, presentamos una combinación de técnicas que permiten el biofísico (biocapa interferometría (BLI) y calorimetría isoterma de titulación (ITC)) y caracterización estructural (cristalografía de rayos x) el dominio extracelular de Ig glicoproteínas de membrana, solas y en conjunto con sus ligandos biológicamente relevantes y moléculas terapéuticas (figura 1).
N-ligado glycosylation es una de las modificaciones post traducción más común en las proteínas mamíferas y se produce durante la maduración de la proteína en el retículo endoplasmático y Golgi12,13. Líneas celulares, como células de riñón embrionario humano (HEK) 293, se han desarrollado para la expresión recombinante de grandes cantidades de glycosylated proteínas mamíferas14,15. Esta línea celular se ha desarrollado en un formato de suspensión, que permite la facilidad de escalado de producción de proteínas en grandes cantidades en comparación con líneas de células adherentes. Aquí, utilizamos dos líneas de células HEK293: HEK293F y HEK293 Gnt I- / - (HEK293S), que se diferencian por la ausencia de N-acetylglucosaminyl transferasa I (Gnt yo) en el último. A su vez, producción de glycans complejo (como visto en HEK293F) no es posible y en su lugar alta manosa-tipo glicanos (predominante hombre5GlcNAc2) residen en N-ligados glycan sitios18,19,20 . Estas dos variedades de células en paralelo permite estudiar el efecto de glicanos tamaño y la complejidad sobre la función biológica y orientación terapéutica. En efecto, glicoproteínas producidas en células de HEK293F tendrá glicanos más grande, más compleja en comparación con la misma glicoproteína producida en las células HEK293S. Glicoproteínas que se producen en las células HEK293S son más susceptibles de cristalización, debido a la menor heterogeneidad química y conformacional de los glycans N-ligados. Para mejorar aún más el crystallizability, glicoproteínas producidas en células HEK293S (pero no HEK293F) pueden ser tratados con la enzima endoglycosidase H (Endo H), que se traduce en la ruptura de glicanos de alta manosa tal que solamente una sola N-acetilglucosamina (GlcNAc) parte se mantiene en cada sitio de glicosilación N-ligados21,22. También pueden utilizar otros métodos para limitar el proceso de N-glicanos dentro de las células, tales como la adición de inhibidores de glicosidas durante la expresión de la glicoproteína, incluyendo kifunensine23. Alternativas implican la expresión de glicoproteínas nativos (en las células HEK293F) seguida por deglycosylation enzimática utilizando péptidos N-glucosidasa F (PNGaseF). Sin embargo, deglycosylation con PNGaseF ha demostrado ser menos eficaz bajo condiciones nativas y aumenta la agregación de algunas proteínas; en casos cuando la proteína permanece soluble después del tratamiento, adquiere cargas negativas en su superficie debido a la deamidation del residuo Asparagina Ácido aspártico24, que podría ser perjudicial para su cristalización. Sitios de N-glicosilación predijo también pueden ser transformados, más a menudo a los residuos de alanina o glutamina, para prevenir N-ligado glycosylation en estos sitios y para generar muestras de glicoproteína de alta homogeneidad. Alternativamente, se pueden producir glicoproteínas en otras culturas de células eucariotas, incluyendo levaduras, insectos y sistemas de planta u otras líneas de células de mamífero como el hámster chino ovario (CHO) células16,17.
Muchos vectores de expresión mamíferos, incluyendo pHLsec, permiten la secreción de ectodomains de la glicoproteína recombinante en la célula media25. Secreción de glicoproteínas de las células HEK293 permite la purificación rápida y fácil sin necesidad de lisis celular. Adición de etiquetas de purificación (por ejemplo, su etiqueta, Strep-tag, bandera, Myc-etiqueta, etiqueta de HA) a la N o C terminal del destino glicoproteína permite la purificación mediante una cromatografía de afinidad solo paso. Posteriormente, cromatografía por exclusión de tamaño puede utilizarse para obtener una muestra de monodispersa de caracterización Biofísica y estructural.
Una muestra de glicoproteína altamente puro y homogéneo en condiciones adecuadas puede dar lugar a cristales bien diffracting. Una vez que se cuente con un conjunto de datos de difracción de rayos x completo de tales cristales, fases iniciales deben determinarse para el cálculo de la densidad del electrón de la glicoproteína. Gracias a un número cada vez mayor de estructuras en el Banco de datos de la proteína (PDB), el método más comúnmente utilizado para la eliminación en gran medida ha convertido en reemplazo molecular (MR), que utiliza una estructura de la proteína relacionada para obtener fases iniciales26. Sin embargo, cuando Señor es incapaz de resolver el problema de fase, como en ocasiones ha sido el caso de multi-Ig dominio glicoproteínas27,28,29, métodos alternativos son necesarios. En este artículo detallamos un método para disfrutar de cristales con átomos pesados (HA) para la eliminación, que se requería para resolver la estructura del ectodomain CD2228. Identificación de la derecha HA para la eliminación es un proceso iterativo que depende de la reactividad de la HA, átomos disponibles en la glicoproteína en un enrejado cristalino determinado y la cristalización solución30,31. Como alternativa, átomos de azufre natural en residuos de cisteína y metionina pueden utilizarse para la eliminación si está presente en una proporción bastante alta a otros átomos en la glicoproteína, y si se recogerán datos de difracción de rayos x con suficiente redundancia32, 33.
La función biológica de glicoproteínas de membrana está a menudo mediada por interacciones proteína-proteína o las interacciones proteína-ligando, como con hidratos de carbono. Cuando el ligando es lo suficientemente pequeño como para la difusión de la solución para el sitio de unión de la glicoproteína en el enrejado cristalino, experimentos de remojo puede ser exitoso para obtener una estructura de cristal Co glicoproteína ligando para entender mejor el reconocimiento de ligando.
Los protocolos aquí presentados también son relevantes para la comprensión de las interacciones de glicoproteínas de superficie con ligandos sintéticos de terapéutica34,35 y anticuerpo terapéutica36,37. Cuando se combina con información estructural, Unión cinética y la termodinámica puede ser poderosa para entender y mejorar sus mecanismos de acción. Una técnica que permite el análisis cinético de anticuerpos terapéuticos a una glicoproteína es BLI38,39. BLI utiliza biosensores con un ligando inmovilizado para medir la cinética de asociación y disociación con un socio de la Unión, en última instancia, determinar una constante de disociación de equilibrio (KD). BLI es un enfoque atractivo ya que se requieren pequeñas cantidades de glicoproteínas (< 100 μg), tiempo del experimento es rápido (~ 10-15 min por ejecutar), y puede ser automatizado. ITC es también útil para el estudio de las afinidades entre glicoproteínas y Unión socios40,41,42,43. Mientras que ITC es más tiempo y reactivo intensivo, puede obtenerse información valiosa sobre la termodinámica de la interacción (ΔG, ΔH, ΔS y estequiometría). ITC es también muy útil para el estudio de las interacciones débiles que a menudo están asociadas con la unión transitoria de glicoproteínas de superficie a ligandos. Además, estas técnicas se pueden utilizar en conjunto para evaluar la Unión de varias construcciones y evaluar el efecto de diferentes glicoformas N-ligados de expresión de la glicoproteína en diferentes líneas celulares. Realizar BLI y ITC con glicoproteínas producidas en HEK293F, HEK293S y tratados con Endo H puede proporcionar una vista detallada del papel de glycans en actividad biológica y el compromiso terapéutico.
Hemos aplicado con éxito estos protocolos para caracterizar el dominio extracelular (ECD) del humano CD2228, miembro de la glicoproteína de la familia de lectinas (Siglecs) de Ig-como Unión a ácido siálico que es esencial para mantener la homeostasis de la célula de B44 . Realizamos diseño de fondo de construcción para facilitar la cristalización y gradualmente el conjunto de datos de rayos x por HA con Hg. También empapado CD22 cristales con su ligando el ácido siálico (α2-6 sialyllactose) para obtener una estructura del complejo ligando-receptor inmune y así proporcionan los planos para el diseño de estructura guiada de glicanos miméticos45,46. Además, genera el atascamiento del antígeno del fragmento (Fab) del epratuzumab anticuerpo terapéutico de anti-CD22 - un candidato terapéutico actualmente en ensayos clínicos de fase III para de linfoma de los non-Hodgkin47- para determinar su afinidad de Unión por BLI y CCI a diferencialmente glucosilada CD22 ECD construye. Estos estudios revelaron un papel crítico para el N-ligado glycosylation en compromiso epratuzumab, con posibles consecuencias para el reconocimiento de CD22 en células B disfuncionales.

<table><tbody><tr><td>0,22 y mu; m Filtro Steritop</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPS02RE</td><td></td></tr><tr><td>10 pocillos 4-15% gradiente SDS-PAGE gel</td><td>Bio-Rad</td><td>4561084</td><td></td></tr><tr><td>10x glicotampón 3</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702S</td><td>Viene con reactivo Endo H</td></tr><tr><td>10x Kinetics Buffer</td><td>PALL Fort&eacute; Bio</td><td>18-1092</td><td></td></tr><tr><td>10x Tampón Tris/Glicina/SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>1 mL de fondo redondo Bloque de 96 pocillos</td><td>ThermoFisher</td><td>260251</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos de 22 mm</td><td>Hampton research</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Tampón de muestras</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>96-3 pocillos INTELLIPLATE&nbsp; reservador de bajo volumen</td><td>Art Robbins Instrumentos</td><td>102-0001-03</td><td></td></tr><tr><td>AgeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0552S</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA Pure</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml; Inicio de KTA&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 dispositivo de filtración centrífuga 10KDa MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4 dispositivo de filtración centrífuga 10KDa MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC801008</td><td></td></tr><tr><td>Auto-iTC200</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axygen MaxyClear Snaplock 1,5 mL microtubos</td><td>Fisher Scientific</td><td>MCT150C</td><td></td></tr><tr><td>Correderas de cámara de recuento de células Countess</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0,05-0,1 mm</td><td>Hampton research</td><td>HR4-945</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0,1-0,2 mm</td><td>Hampton research</td><td>HR4-947</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0,2-0,3 mm</td><td>Hampton research</td><td>HR4-970</td><td></td></tr><tr><td>Baño seco digital</td><td>Bio-Rad</td><td>1660562EDU</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5 y alfa;</td><td>Invitrogen</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>Endo H</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702S</td><td></td></tr><tr><td>Matraz Erlenmeyer (base con deflectores), policarbonato, estéril, 500 ml, DuoCAP</td><td>TriForest Labware</td><td>FBC05000S</td><td></td></tr><tr><td>matraz Erlenmeyer de 125 ml (base con deflectores), policarbonato, estéril, 125 ml con tapón ventilado</td><td>VWR</td><td>89095-258</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Pipeta serológica estéril desechable, no pirógena, 10 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Pipeta serológica estéril desechable, no pirógena, 25 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Pipeta serológica estéril desechable, no pirógena, 5 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Pipeta serológica estéril desechable, no pirogénica, 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>768180</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de transfección de ADN FectoPRO, Polyplus</td><td>Células VWR</td><td>10118-842</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle 293F</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R79007</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle Expression</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12338001</td><td></td></tr><tr><td>Pantallas de átomos pesados Au</td><td>Hampton research</td><td>HR2-444</td><td></td></tr><tr><td>Pantallas de átomos pesados Hg</td><td>Hampton research</td><td>HR2-446</td><td></td></tr><tr><td>Cribas de átomos pesados M1</td><td>Hampton research</td><td>HR2-448</td><td></td></tr><tr><td>Cribas de átomos pesados M2</td><td>Hampton research</td><td>HR2-450</td><td></td></tr><tr><td>Cribas de átomos pesados Pt</td><td>Hampton research</td><td>HR2-442</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293S</td><td>ATCC ATCC</td><td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>Columna de afinidad HisTrap</td> GE <td>Healthcare</td><td>17525501</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap KappaSelect Columnas de afinidad</td><td>GE Healthcare</td><td>17545811</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap LambdaSelect Columnas de afinidad GE</td><td>Healthcare</td><td>17548211</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-1 Pantalla de cristal Bloque de 1,7 ml</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-1</td> MCSG-2 <td></td></tr><tr><td>Pantalla de cristal Bloque de 1,7 ml</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-2</td> MCSG-3 <td></td></tr><tr><td>Pantalla de cristal de 1,7 ml</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-3</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-4 Pantalla de cristal Bloque de 1,7 mL</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-4</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de mercurio</td><td>Sigma</td><td>1044170100</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca, 96 pocillos, polipropileno, fondo plano, negro&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655209</td><td></td></tr><tr><td>Minstrel DT UV</td><td>Formulatrix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro agitador</td><td>Infors HT</td><td>MP25-TA-CO2HB</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000/2000c Espectrofotómetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep 3K Omega dispositivo centrífugo</td><td>PALL Ciencias de la Vida</td><td>OD003C33</td><td></td></tr><tr><td>Biosensores de Ni-NTA</td><td>PALL Fort&eacute; Bio</td><td>18-5102</td><td></td></tr><tr><td>Octeto RED96</td><td>PALL ForteBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oryx 4 robot de cristalización</td><td>Douglas Instrument</td><td>ORY-4/1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de platino</td><td>Sigma</td><td>520632-1g</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210006</td><td></td></tr><tr><td>Quick Coomassie Stain</td><td>Protein Ark</td><td>GEN-QC-STAIN-1L</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip Estéril 50 mL Sistema de filtración al vacío desechable 0.22 &micro; m Millipore Express</td><td>EMD Millipore SCGP00525</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 Aumento 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17517201</td><td></td></tr><tr><td>Clúster de bromuro de tantalio</td><td>Jena bioscience</td><td>PK-103</td><td></td></tr><tr><td>Top96 Pantalla de cristalización</td><td>Reactivos Rigaku</td><td>1009846</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripán</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>VDX de 24 pocillos con sellador</td><td>Hampton research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; 2-6 sialilactosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8556-1mg</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterización de las glicoproteínas con el doblez de la inmunoglobulina por cristalografía de rayos x y técnicas biofísicas

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Glicoproteínas en la superficie de las células desempeñan un papel crítico en la función celular, incluyendo señalización, transporte y adherencia. En leucocitos, varias de estas glicoproteínas poseen pliegues de inmunoglobulina (Ig) y son esenciales para la regulación y reconocimiento inmune. Aquí, presentamos una plataforma para el diseño, expresión y caracterización biofísica del dominio extracelular del receptor de células B humanas CD22. Proponemos que estos enfoques son ampliamente aplicables a la caracterización de ectodomains de mamíferos de la glicoproteína que contiene dominios Ig. Dos suspensión riñón embrionario humano (HEK) líneas celulares, HEK293F y HEK293S, se utilizan para expresar glicoproteínas dan cobijo glycans complejo y de alta manosa, respectivamente. Estas glicoproteínas recombinantes con diferentes glicoformas permiten investigar el efecto de tamaño de glicanos y composición en el atascamiento del ligand. Discutimos protocolos para el estudio de la cinética y la termodinámica de unión de la glicoproteína a ligandos biológicamente relevantes y anticuerpo terapéutico candidatos. Glicoproteínas recombinantes que se producen en las células HEK293S son susceptibles de cristalización debido a la homogeneidad de glicanos, flexibilidad reducida y susceptibilidad a endoglycosidase H. Presentan métodos de remojo cristales glicoproteína con átomos pesados y moléculas pequeñas para determinación de fase y análisis de ligando, respectivamente. Los protocolos experimentales discutidos aquí son prometedoras para la caracterización de las glicoproteínas mamíferos para dar información sobre su función e investigar el mecanismo de acción de la terapéutica.

Varias construcciones de ECD CD22 con éxito fueron clonadas en el vector de expresión pHLsec y overexpressed en mamíferos HEK293F y HEK293S líneas celulares (figura 2 y 3A). Todas las construcciones eran purificadas a homogeneidad de tamaño por cromatografía por exclusión de tamaño y rindió una muestra muy pura para los estudios de cristalización (figura 3B y 3C). La construcción de CD22 que llevó a cristales bien diffracting era el truncamiento de d1-d3 (residuos 20-330), con cinco de los seis sitios previstos N-ligado glycosylation mutados de ADN a Ala (N67A, N112A, N135A, N164A y N231A), producido en las células HEK293S, tales que solamente el sitio de glicosilación en la posición se mantuvo el N101 (esta construcción se denomina CD2220-330, 5A). Cristales obtenidos en diversas condiciones de la pantalla de matriz sparse MCSG-1, pero los mejores cristales eran de una condición que contiene 30% (p/v) de polietilenglicol 4000, cloruro de litio de 0,2 M y 0,1 M de Tris, pH 8.5. Estos cristales nativos difractados a 2.1 resolución Å; utilizando estructuras conocidas de dominios Ig de proteínas relacionadas Siglec no dió ninguna solución en busca del Señor.
Para adquirir información puesta en fase, hemos empapado cristales nativos con un grupo de compuestos HA que incluye Hg, Pt, Os, Ta y Br en concentraciones que van desde 1-20 mM de HA compuesto para un tiempo de incubación de 5 min a 1 d (figura 4). Seguimiento cristales para cambios en la morfología y encontró que cristales empapados con HA compuesto en 20 mM resultaron en el rápido resquebrajamiento y la disolución del cristal. Nos congeló un total de 63 cristales que conservan su forma después de tiempos de incubación establecido que fueron empapados con racimo de bromuro de tantalio, platino cloruro, acetato de mercurio y cloruro de mercurio. Cristales empapados con 7 mM de cloruro de mercurio 30 minutos demostrada señal anómala en una exploración de fluorescencia en la fuente de luz canadiense (CLS) 08-BM beamline (Saskatoon, Canadá) y permitieron la dispersión anómala onda recogida de datos de rayos x en un solo cristal. Estos conjuntos de datos nos ha permitido resolver la subestructura de mercurio de CD225A 20-330, que reveló un átomo de mercurio solo limitado a una cisteína libre en posición C308 y en última instancia nos permitió construir la estructura de CD225A 20-330, en las fases mapa de densidad de electrones utilizando autocompilación78.
Una vez que se resolvió la estructura unliganded, estábamos interesados en la solución de la estructura de CD22 a su ligando, α2-6 siallylactose. Primero calculamos la afinidad de CD22 hacia sialyllactose α2-6 uso de ITC para caracterizar la termodinámica de unión de la interacción. Observamos una afinidad de ~ 280 μm y utiliza esta información para identificar una concentración inicial (~ 100 x KD) de ligando para remojo de nuestros nativos CD2220-330 5A cristales. Empapado el CD2220-330, 5A cristales siallylactose de 25 mM para 5 min, 2 h, 14 h, 40 h y 5 d y controlar cambios en la morfología cristalina. Un total de ~ 75 cristales fueron congelados desde varios puntos de tiempo y enviado a Sincrotrón CLS línea 08-ID (Saskatoon, Canadá) para la recolección remota de datos. Se recolectaron un total de seis conjuntos de datos de rayos x de cristales bien diffracting. La estructura de cada conjunto de datos de rayos x fue resuelto por el Señor usando unliganded CD2220-330, 5A estructura como un modelo de búsqueda inicial. La densidad del electrón que resulta para todos los datasets entonces fue inspeccionada para densidad positiva en el mapa de Fo-Fc que correspondería para destino α2-6 sialyllactose en el sitio de unión de CD22. Notablemente, los conjuntos de datos recogido, incluso los cristales empapados después de sólo 5 minutos de tiempo de incubación, contenido positivo densidad correspondiente a ligand en el sitio de Unión. Estructuras generales del unliganded y CD22 liganded fueron muy similares con mínimos cambios conformacionales, que podrían explicar el éxito de remojo experimentos con α2-6 sialyllactose.
A continuación caracterizamos la superficie antigénica de CD22 reconocido por epratuzumab anticuerpo terapéutico en experimentos BLI y CCI (figura 5). Cinética y termodinámica perfiles de Unión Fab epratuzumab a CD22 construcciones con diferentes glicoformas revelaron una afinidad creciente para CD22 con tamaño reducido glycan N-ligados, con hasta una 14-fold mejora en afinidad por glicanos más pequeña (327 nM vs 24 nM en BLI; 188 nM vs 58 nM en ITC). Lo glicanos CD22 N-ligados restrinjan el acceso del anticuerpo a su epítopo fue identificado por BLI utilizando a mutantes de un solo punto de CD22 y resolviendo el epratuzumab Fab-CD22 d1-d3 cristal Co estructura28.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig1.jpg"> Figura 1 . Resumen de caracterización de glicoproteína de construcción diseño de caracterización Biofísica y estructural. Primaria (1) análisis de la glicoproteína representativa de la secuencia. En gris, el dominio extracelular (ECD); en verde, segmento transmembrana (TM); y en azul, el dominio citosólico de la glicoproteína. Predijo los glycans N-ligados están etiquetados. (2) reproducción de construcciones de la primera infancia. (3) expresión de la primera infancia construye, en células de mamíferos. (4) purificación de la glicoproteína. Mientras que las proteínas expresadas en HEK293F contendrá glycans complejo, las proteínas expresadas en HEK293S tendrá glicanos de alta manosa. Tratamiento enzimático de glicoproteínas producida en células HEK293S con Endo H resultados en glicoproteínas con sólo una molécula GlcNAc en sitios de glicosilación N-ligados. Glicoproteínas (5a) se analizan para su unión los anticuerpos a por interferometría de la biocapa (BLI) y calorimetría isoterma de titulación (ITC). Afinidad a ligandos puede medirse también por el CCI. (5b) ensayos de cristalización de las glicoproteínas con homogénea glycans N-ligados, como las expresadas en HEK293S y deglycosylated con Endo H. (6) en algunos casos, la mutación de sitios de glicosilación N-ligado es necesario para obtener cristales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig2.jpg"> Figura 2 . Diseño del ectodominio de CD22 ADN construye para su expresión en células de mamífero. A) representación del plásmido pHLsec utilizado por transfección transitoria de construcciones CD22 ECD. Africanas y KpnI sitios utilizados para la clonación se indican con cajas rojas. B) el DIT CD22 contiene siete dominios de Ig (d1-d7) y 12 sitios de glicosilación predicha de N-ligados (en azul). Se diseñaron cuatro constructos de la ECD CD22. C) 1% gel de agarosa mostrando los amplicones de PCR de CD22 ECD construye para el clonado en el vector de expresión mamífero pHLsec. Primer carril contiene marcadores de DNA de 1 kb. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig3.jpg"> Figura 3 . Expresión y purificación de glicoproteínas. A) efecto de la densidad celular en los rendimientos de la expresión. Expresión de la glicoproteína en la cultura de pequeña escala 25 mL de HEK293F suspensión células transfectadas con tres diferentes densidades a partir de las células (0,5 x 106 células mL-11.0 x 106 células mL-1y 1.5 x 106 células mL -1). Cuantificación realizada por densitometría de SDS-PAGE en el panel de la izquierda y cuantitativa BLI en el panel de la derecha. Valores son representativos de una preparación de glicoproteína. B) cromatograma del primer paso de purificación para construir CD2220-330, 5A de 600 mL de sobrenadante usando una columna de afinidad de Ni-NTA. La glicoproteína eluyó utilizando un gradiente de imidazol (línea gris), donde 100% corresponde al buffer de elución, que contiene imidazol de 500 mM. Combinado fracciones se representan con líneas verticales. C) cromatograma de exclusión de tamaño para construir CD2220-330, 5A con una potente columna de filtración de gel. Fracciones agrupados desde el pico de elución son representados con líneas verticales. Recuadro: Gel tinción de Coomassie SDS-PAGE que muestra la pureza de la glicoproteína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig4.jpg"> Figura 4 . Cristal con átomos pesados. A) estación de trabajo muestra de remojo cristales nativos HA compuestos. Todo requiere herramientas que están etiquetadas. B) pasos que se siguieron para remojo cristales de construcción CD2220-330, 5A con compuestos HA. Paso 1, abrir bien con cristales y cristales de transferencia utilizando un bucle a una caída de 0,2 μL en un cubreobjetos con solución HA diluido en la condición de la cristalización, tal que la concentración final de HA oscila entre 1-10 mM. Paso 2, sello de la gota en la placa de cristalización e incubar cristales con el HA compuesto para diferentes periodos de tiempo. Paso 3, montar el cristal empapado en el lazo y espalda-remoje durante 30 s en tres consecutivos 0,2 μl las gotas que contiene la solución del licor madre suplementada con glicerol 20% (v/v) dispensado en un cubreobjetos. Paso 4, flash congele el cristal montado en un circuito con nitrógeno líquido y colocar en un disco para su envío a la línea de sincrotrón. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig5.jpg"> Figura 5 . Biocapa interferometría e isotérmico titulación calorimetría mediciones. A) experimento representante BLI. Panel superior: ejemplo de configuración de la placa para un experimento de cinética, donde están marcados los siguientes: 1 cinética x buffer (B), su6 x-glicoproteína etiquetada carga (L), representante de concentraciones Fab (500, 250, 125, 62.5 nM), PBS + regeneración de 500 mM buffer (R) y 1 x la neutralización de la cinética del almacenador intermediario (B). Bien, cada una contiene 200 μL de solución. Número de paso para el experimento de cinética se indica en la parte superior de la placa. Panel de centro: Datos crudos representativos de BLI experimento realizado usando biosensores de Ni-NTA y la placa descrito en el panel superior. Paso números corresponden a la línea de base (1) su glicoproteínax 6 carga (2), base (3), Asociación de dilución seriada del Fab (4) y disociación (5). Medidas de regeneración no son representados (pasos 6-7). Panel inferior: Datos representativos mostrando cruda asociación y disociación (línea azul) con el correspondiente de 1:1 ajuste (línea roja). B) panel superior: configuración de placa representativa de un ITC solo ejecutar en un instrumento automatizado de ITC con siete experimentos en un 96-pozo redondo del bloque inferior. Cada experimento está compuesto por tres pozos. El primer pozo (rojo) corresponde a la muestra de la celda (400 μL), el segundo pozo (verde) corresponde a la muestra de la jeringa (120 μL). La tercera también queda vacía, y las muestras mixtas se devolverán a este experimento bien finalizado. Experimentos 1, 2 y 7 son buffer en controles de búfer. Experimentos 3-5 representan los experimentos por triplicado con glicoproteína (P) en la celda y Fab o ligando (L) en la jeringa. Experimento 6 representa un calor ligando de control de dilución y debe restarse de experimentos 3-5 durante el análisis de datos. Panel inferior: Representante crudo (arriba) y procesados (abajo) ITC datos de Fab (epratuzumab) atar a ECD CD22 se producen en células de HEK293F. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Presentamos los enfoques para la caracterización Biofísica y estructural de las glicoproteínas con el doblez de la inmunoglobulina por interferometría de biocapa, calorimetría isotérmica de titulación y Cristalografía de rayos x.

Caracterización de las glicoproteínas con el doblez de la inmunoglobulina por cristalografía de rayos x y técnicas biofísicas

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las glicoproteínas. Proporciona información sobre la función de la proteína, el papel de los glicanos ligados a N y el mecanismo y la acción de los antibióticos dirigidos a la glicoproteína. La principal ventaja de esta técnica es que se puede aplicar a cualquier glicoproteína de interés.Facilitar la caracterización estructural y biofísica de una amplia gama de dianas glicoproteicas. La demostración de este procedimiento estará a cargo de Hong Cui, coordinador de proyectos de investigación en nuestro laboratorio. Para comenzar, prepare y transfecte las células como se describe en el protocolo de texto.Recolectar las células por centrifugación a 6, 371 veces g y cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Retenga el sobrenadante y luego use un filtro de 0,22 micras para filtrarlo. Cargue el sobrenadante filtrado a cuatro mililitros por minuto en una columna de Ni-NTA en un sistema de cromatografía de sobremesa.Después de esto, lave la columna con tres o cuatro volúmenes de tampón de lavado. Diluir la glicoproteína purificada de la columna utilizando un gradiente de tampón de elución, mientras se recogen las fracciones. Tire de las fracciones que contienen el pico eludido en un dispositivo de filtración centrífuga con un límite de peso molecular nominal de 10 kilodalton.A continuación, concentrar centrifugando a 4.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 15 minutos o hasta que la muestra alcance un volumen de 500 microlitros. Inyecte la glicoproteína concentrada en un circuito de muestra de 500 microlitros. Cargue la glicoproteína en una columna de exclusión de tamaño preequilibrada de alto rendimiento en un sistema FPLC a cuatro grados Celsius mientras recolecta fracciones.Después de esto, ejecute un gel SDS-PAGE para identificar qué fracciones eludidas contienen la glicoproteína y extraiga las que sí lo hacen. Utilizando un dispositivo de filtración centrífuga con un límite de peso molecular nominal de 10 kilodaltons, concentre ECD puro desglicosilado a 4.000 veces G y cuatro grados Celsius hasta obtener la concentración deseada. Después de determinar la concentración de proteínas, centrifugar la muestra a 12.000 veces G y cuatro grados Celsius durante cinco minutos, para eliminar el polvo y otros contaminantes.A continuación, agregue 80 microlitros de solución de cristalización de una pantalla de cristalización comercial a cada pozo del depósito en una placa de cristalización de gota de 96 pocillos. Utilice un robot de cristalización para dispensar gotas de proteína en los pocillos de la placa de cristalización. Usando un volumen total de gota de 200 nanolitros en una proporción de uno a uno de proteína purificada a solución de cristalización.Después de esto, selle la placa con cinta adhesiva. Transfiera la placa sellada a un generador de imágenes de placas para su inspección con luz visible y ultravioleta. Identifique las condiciones que dan a las cabezas de cristal de glicoproteína iniciales y optimice aún más estos cristales como se describe en el protocolo de texto.Crioproteja los cristales sumergiéndolos en una solución de licor madre suplementada con un 20% de glicerol. A continuación, monta los cristales en CryoLoops. Usando nitrógeno líquido, congele rápidamente los cristales montados antes de la recopilación de datos.Después de producir cristales bien difractados en una placa de cristalización de 24 pocillos, prepare una solución madre de 50 milimolares de ligando y 20 milimolares de Tris a pH 9.0 con 150 milimolares de cloruro de sodio. Añadir varias concentraciones de esta solución de ligando a la gota previamente preparada que contiene los cristales de ECD. Selle la gota para duraciones de tiempo de incubación que oscilan entre cinco minutos y cinco días.Usando un microscopio óptico, rastree visualmente los cristales para identificar cualquier posible cambio en la morfología. Después de la incubación, monte los cristales con CryoLoops y protéjalos en una solución de licor madre suplementada con un 20% de glicerol. Para comenzar la interferometría de biocapa, prepare 50 milímetros de 1X Kinetics Buffer a partir de 10X Kinetics Buffer como se describe en el protocolo de texto.Agregue 200 microlitros de este tampón a una placa de prehumectación. Transfiera seis biosensores de Ni-NTA a la placa y déjelos hidratar en el tampón durante 10 minutos. A continuación, diluya la ECD marcada con His en un mililitro de 1X Kinetics Buffer a una concentración final de 25 nanogramos por microlitro.Y preparar diluciones en serie del FAB purificado. Ahora aqua los reactivos en una microplaca de 96 pocillos, como se ve aquí. Donde B representa el tampón cinético 1X, L representa la carga de glicoproteínas marcadas con His, las entradas numéricas representan las concentraciones de FAB diluidas y R representa el tampón de regeneración.Transfiera los biosensores hidratados a pocillos que contengan 1X Kinetics Buffer durante 60 segundos para establecerlos como referencia. Luego, cargue la glicoproteína a una concentración de 25 nanogramos por microlitro durante 240 segundos a 1.000 RPM. Vuelva a colocar los biosensores en los pocillos que contienen 1X Kinetics Buffer durante 60 segundos para una segunda línea de base.Transfiera los sensores a los pocillos que contienen las diluciones en serie de FAB durante 180 segundos. Después de esta fase de asociación, transfiera los biosensores de nuevo a 1X Kinetics Buffer para un paso de disociación de 180 segundos. A continuación, abra el software de análisis.En la pestaña uno, importe y luego seleccione los datos. En la pestaña dos, paso uno, selección de datos, elija selección de sensor. Resalte los pozos de referencia y, a continuación, haga clic con el botón derecho para definir el pozo de referencia.En el paso dos, resta, seleccione pozos de referencia. Después de esto, en el paso tres alinear el eje Y, seleccione la línea de base y establezca un rango de tiempo de 0,1 segundos a 59,8 segundos. En el paso cuatro, seleccione la corrección entre pasos y alinee con la disociación.A continuación, en el paso cinco, procese el filtrado de Savitzky-Golay y haga clic en procesar datos. La puerta a la pestaña tres. En el paso dos, analice con un modelo uno a uno, seleccione asociación y disociación, seleccione ajuste global y agrupe por color.Haga clic con el botón derecho en las curvas, haga clic en establecer color y establezca todas las curvas en los colores deseados. Después de esto, seleccione ajustar curvas. Si los datos están bien ajustados, exporte el resultado haciendo clic en Guardar informe.Repita el experimento para todas las condiciones deseadas. En este estudio, varias construcciones del dominio extracelular CD22 se clonan con éxito en el vector de expresión pHL-sec. Estos constructos se sobreexpresan en las líneas celulares HEK293-F y HEK293-S de mamíferos.Mientras que los cultivos que contenían aproximadamente un millón y un millón y medio de células por mililitro, expresaron niveles muy similares de glicoproteínas. Los cultivos de solo medio millón de células por mililitro expresaron notablemente menos. Después de esto, se cosechan los cultivos y se aísla la glicoproteína ECD mediante cromatografía de afinidad y exclusión por tamaño para purificar todas las construcciones a la homogeneidad del tamaño.Produciendo una muestra de alta pureza para cristalización y estudios biofísicos. Siguiendo estos procedimientos, se pueden realizar otros métodos como la microscopía electrónica de partículas singulares para responder preguntas adicionales sobre la estructura tridimensional del dominio extracelular de longitud completa o complejos de proteínas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo expresar, purificar y caracterizar estructural y biofísicamente las glicoproteínas, sus ligandos y los anticuerpos dirigidos.

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Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

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