Name: Detección de Heterodimerization de isoformas de la proteína usando un análisis de ligadura in Situ proximidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprende a detectar la heterodimerización de proteínas MST1/MST2 en células fijas mediante el ensayo de ligadura de proximidad in situ. Este método de alta sensibilidad permite visualizar interacciones proteicas sin necesidad de expresión transgénica.

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Agradecemos al laboratorio de Chernoff todo para contribuir a la optimización y validación de este protocolo, en particular María Radu y Galina Semenova. También agradecemos a Andrey Efimov de la instalación de la proyección de imagen de celular en el Fox Chase Cancer Center. Este trabajo fue financiado por una subvención del NIH (R01 CA148805) a JC.

1. preparación de soluciones
<ol><li>Preparar solución de fijación: 4% paraformaldehido (PFA) en PBS 1 x. Para 10 mL, tomar 2.5 mL de 16% PFA y agregar 7,5 mL de PBS 1 x. Peligros: PFA es carcinogénico a dosis bajas. Los vapores y el contacto con la piel son peligrosos. Almacenar a-20 ° C.</li>
	<li>Preparar solución de permeabilización: 0,1% Tritón X-100 en PBS 1 x. Para 100 mL de solución, añada 100 μl de Tritón X-100 en 100 mL de 1 x PBS. Almacenar a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Preparar el tampón de lavado: 1 x TBST. Para 1 L, tomar 100 mL de 10 x TBS y 890 mL de dH2O 10 mL de Tween 20 (10%).</li>
	<li>Preparar solución de bloqueo suministrado por kit. Alternativamente, use 1 x PBS solución 2% BSA.</li>
	<li>Prepare el diluyente de anticuerpos como suministrados por kit. Alternativamente, use 1 x solución de PBS con 1% de BSA.</li>
</ol>2. galjanoplastia de células
Nota: En este estudio, se utilizaron células de Schwann humanas inmortalizadas (iHSC) y humano embrionario riñón 293 células (HEK 293); sin embargo, este método puede utilizarse para muchos tipos de células adherentes.
<ol><li>Cultura HEK 293 en DMEM suplementado con 10% FBS, 0,2% glucosa, 2 mM L-glutamina, 100 U/mL de penicilina G y estreptomicina 100 μg/mL en placas de cultivo de tejidos tratados a 37 ° C en 5% CO2. Mantener iHSC en 10% FBS/DMEM suplementado con pluma/Strep y 2 μm forskoline. Rutinariamente la prueba las células de mycoplasma. Se realizó sin autenticación de línea celular.</li>
	<li>Capa una diapositiva 16-pozo cámara con 50 μl de 10 μg/mL ratón natural laminina o 0.01% poly-L-lisina solución e incubar durante 30 min a 37 ° C en 5% CO2. Dividir celdas utilizando 0.04% tripsina-EDTA.</li>
	<li>IHSC placa y HEK-293 en 100 μl de medio en confluencia del 80% (15.000-25.000 células/pocillo).</li>
	<li>Incube las células para 12-24 horas a 37 ° C en vapor, 5% CO2 incubadora.</li>
</ol>3. fijación y permeabilización
<ol><li>Retire el medio de los pocillos y lavar con 100 μl de 1 x PBS. Aspiración con una micropipeta para minimizar el riesgo de la eliminación de la muestra.</li>
	<li>Fijar las células añadiendo 50 μl de 4% PFA por bien e incubar 10 min a temperatura ambiente, sin agitación. Las células son sensibles a la separación, así que evitar pipetear las soluciones directamente sobre las células.</li>
	<li>Lavar las células con 0.05% TBST tres veces por 5 minutos cada uno. Aspiración con una micropipeta para minimizar el riesgo de la eliminación de la muestra.</li>
	<li>Tratar las células con solución de permeabilización (0,1% Tritón x-100 en 1 x PBS) durante 10 minutos sin agitación a TA.</li>
	<li>Lavar las células con TBST tres veces por 5 minutos con agitación.</li>
</ol>4. bloqueo
<ol><li>Tap off TBST (muy suavemente con una micropipeta). Visualizar el portaobjetos en un microscopio para ver si las células permanecen adjuntas.</li>
	<li>Añadir una gota (50-60 μL) de solución de bloqueo 1 x a cada muestra.</li>
	<li>Precalentar una cámara de humedad (caja de punta vacía con agua) a 37 ° C e incubar los portaobjetos en él durante 1 h a 37 ° C.</li>
</ol>5. primarios anticuerpos
<ol><li>Diluir los anticuerpos primarios (1: 100) en el diluyente de anticuerpos (véase Tabla de materiales). Preparar solución de anticuerpo de 40 μl por pocillo.</li>
	<li>Quitar bloqueo solución de las diapositivas golpeando el líquido. No permita que las células se sequen.</li>
	<li>Vórtice y agregar 40 μl de las soluciones de anticuerpos a cada pocillo.</li>
	<li>Incubar 1 h a 37 ° C en una cámara de humedad precalentado.</li>
</ol>6. proximidad ligadura ensayo sondas
Nota: Las sondas PLA son proporcionadas como parte de un kit (véase Tabla de materiales). La elección de las puntas de prueba dependerá de la especie de los anticuerpos primarios utilizados para detectar las proteínas de interés.
<ol><li>Diluir las dos sondas PLA (menos el ratón y anti-conejo PLUS) 1:5 en el diluyente de anticuerpos. Para cada muestra, preparar 40 μl de sonda PLA. Incubar la mezcla por 20 min a TA.</li>
	<li>Puntee fuera de la solución de anticuerpo primario de las diapositivas. Lavar los portaobjetos dos veces por 5 minutos con Buffer de lavado a TA.</li>
	<li>Suavemente golpee el tampón de lavado de los portaobjetos y añadir la solución de sonda PLA diluyente en los pocillos (40 μL/pocillo).</li>
	<li>Incubar los portaobjetos en una cámara de humedad precalentado durante 1 hora a 37 ° C.</li>
</ol>7. ligadura
Nota: La en situ detección reactivos rojo, ligasa, ligadura de solución y se proporcionan como parte de un kit (véase Tabla de materiales).
<ol><li>Utilice el en situ detección reactivos rojo.</li>
	<li>Inmediatamente antes de utilizar, vortex y diluir los volúmenes requeridos de 5 x stock de ligadura 1:5 en alta pureza del agua. Nota: No almacene reactivos diluidos.</li>
	<li>Puntee fuera de la solución de sonda PLA de las diapositivas. Lave el portaobjetos en el 1 x de tampón de lavado dos veces por 5 min a TA.</li>
	<li>Inmediatamente antes de la adición a las muestras, vortex y ligasa a la solución de la ligadura en el 1:40 dilución y agitar nuevamente.</li>
	<li>Tap off el tampón de lavado de los portaobjetos y añadir la solución de Ligase de la ligadura a cada pozo (40 μL/pocillo).</li>
	<li>Incubar los portaobjetos en una cámara de humedad previamente calentado durante 30 min a 37 ° C.</li>
</ol>8. la amplificación
Nota: Los valores de amplificación se proporcionan como parte de un kit (véase Tabla de materiales). Los reactivos son sensibles a la luz; por lo tanto Evite exponer las diapositivas a la luz.
<ol><li>Vórtice y diluir los volúmenes requeridos de los 5 x stock de amplificación 1:5 en agua de alta pureza y mezcla.</li>
	<li>Puntee fuera de la solución de Ligase de la ligadura de las diapositivas. Lave el portaobjetos en el 1 x de tampón de lavado dos veces por 2 min a TA.</li>
	<li>Vórtice y agregar la polimerasa a la solución de amplificación en dilución de 1: 80 y agitar de nuevo.</li>
	<li>Toque de tampón de lavado de los portaobjetos y añadir la solución de amplificación de la polimerasa a cada pozo (40 μL/pocillo). Incubar los portaobjetos en una cámara de humedad previamente calentadas para 100 min a 37 ° C.</li>
</ol>9. preparación para la proyección de imagen
Nota: Estos son reactivos sensibles luz. Guardar las diapositivas de la luz.
<ol><li>Toque de la solución de amplificación-polimerasa de las diapositivas y lavar dos veces por 10 min cada 1 en x Wash Buffer a TA.</li>
	<li>Retire las cámaras y la silicona alrededor de los pozos de la diapositiva completamente. Raspe los bits restantes de silicona con una maquinilla de afeitar. Dibujar una cuadrícula en la diapositiva de separación cada uno bien.</li>
	<li>Añadir ~ 40 μl del medio de montaje con DAPI. Tenga cuidado de evitar atrapar burbujas de aire bajo el cubreobjetos. Los bordes de la hoja de cubierta pueden sellarse con esmalte de uñas.</li>
	<li>Espere por lo menos 20 minutos antes de realizar el análisis de imágenes mediante un microscopio confocal. Nota: El protocolo puede hacer una pausa aquí.</li>
	<li>Después de la proyección de imagen, guardar las diapositivas a-20 ° C en la oscuridad.</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nore1B%2FMst1+complex+restrains+antigen+receptor-induced+proliferation+of+na%C3%AFve+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).</li>
<li>Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOBKL1A%2FMOBKL1B+phosphorylation+by+MST1+and+MST2+inhibits+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation.</a> Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li>
<li>Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ste20+group+kinases+as+regulators+of+MAP+kinase+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades.</a> Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).</li>
<li>Rawat, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H-ras+Inhibits+the+Hippo+Pathway+by+Promoting+Mst1%2FMst2Heterodimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization.</a> Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).</li>
<li>Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ste20-like+protein+kinase%2C+Mst1%2C+dimerizes+and+contains+an+inhibitory+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).</li>
<li>Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Approaches+Toward+Quantitative+Mapping+of+the+Interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome.</a> Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).</li>
<li>Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li>
<li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li>
<li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Nos pareció útil portaobjetos de la cámara para este experimento, ya que es muy conveniente realizar el experimento con varias líneas de celulares (14-16) y no hay necesidad de cambiar la muestra cada vez que durante el análisis de microscopía. Pueden surgir algunas complicaciones, tales como un mayor riesgo de contaminación cruzada con los anticuerpos. Por lo tanto, sugerimos lavar cada pozo individual en lugar de utilizar un frasco de Coplin, a pesar de la mayor duración del experimento. Además, la remoción del inserto...

Interrupción de señalización MST1/Hippo ha estado ligada a trastornos del desarrollo y carcinogénesis1. En mamíferos, se activan las quinasas MST1 y MST2 (fosforilan) MOB1 y LATS1/2, el último de los cuales luego fosforila y hace inactivo el coactivador transcripcional de la proteína asociada a Yes (YAP)2. En su forma activa (unphosphorylated), YAP tiene actividad oncogénica, mejorar la transcripción de genes de proliferación celular; por el contrario, cuando YAP es inactivado por la vía de Hippo, se suprime la proliferación celular y apoptosis promovido3. En los tejidos, MST1 y MST2 existen principalmente como homodímeros activo, pero estímulos oncogénicos pueden aumentar los niveles de heterodímeros MST1/MST2 y son de estos heterodímeros inactivos4. Sin embargo, cómo está regulada la MST1/MST2 heterodimerization sigue siendo mal entendida. Homo - y heterodímeros están mediada a través de interacciones entre regiones de en espiral-arrolle c-terminal de MST1 y MST2, conocida como SARAH dominios5. Usando una en situ PLA demostrado en este artículo, nos muestran la presencia de heterodímeros MST1/MST2 en las células de las células de Schwann humana (HSC) y riñón embrionario humano (HEK-293). PLA tiene una ventaja sobre otros métodos de detección de interacción proteína/proteína, ya que permite la detección de interacciones proteína-proteína endógena, que puede ser identificado y cuantificado sin la necesidad de expresión del transgen o el uso de etiquetas del epítopo 6.
Vías de transducción de señalización son controladas en gran parte por la Asociación condicional de proteínas componentes. Por ejemplo, la estimulación de la mayoría del receptor tirosina quinasas conduce a su homo o hetero-dimerización y posterior asociación con proteínas de señalización intracelulares adicionales, que a su vez formar más complejos. El propósito del método PLA es visualizar la proximidad entre las proteínas en las células, siempre que las proteínas son menos de 30-40 nm aparte. Proximidad de proteína generalmente se detecta por primera incubar las células con anticuerpos primarios apropiados en diferentes especies (por ej., conejo y ratón) contra cada interacción proteína, luego agregar anticuerpos secundarios propios de cada especie, sondas de ADN previamente acoplado a corto. Si las sondas de ADN están en proximidad cercana, un oligonucleótido de ADN enlace específico al mismo tiempo puede enlazar tanto de estas sondas, formando una plataforma para la amplificación en situ PCR o mecanismo del círculo del balanceo. Etiquetas fluorescentes agregados a la reacción de amplificación permiten la visualización de las proteínas obran recíprocamente, que aparecen como puntos fluorescentes que pueden ser fácilmente cuantificados y localizadas en determinadas regiones en la celda7,8, 9 , 10.

<table><tbody><tr><td>Portaobjetos de cámara</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>178599</td><td>16 pocillos, portaobjetos de vidrio Sonda</td></tr><tr><td>PLA Anti-Mouse Minus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td>Contiene 1x Solución de bloqueo, 1x anticuerpo Diluyente Sonda</td></tr><tr><td>PLA Anti-Rabbit PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td>Contiene 1x Solución de bloqueo, 1x Anticuerpo Diluyente</td></tr><tr><td>Tampones de lavado, Flurescence</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Contiene tampón de lavado A y tampón de lavado B</td></tr> Medio de <tr><td>montaje con reactivos de detección de DUO82040</td><td></td><td></td>DAPI <td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>DUO92008 rojo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Contiene 5 veces la ligasa, 1 ligasa, 5 veces el rojo de amilificación, 1 polimerasa</td></tr><tr><td>p44/42 MAPK (Erk1/2)</td><td>Señalización celular</td> de anticuerpos <td>9102s</td><td></td></tr><tr><td>Fosfo-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)</td><td>Célula Señalización</td><td>5726s</td><td>anticuerpo pERK</td></tr><tr><td>anticuerpo MST2</td><td>Señalización celular</td><td>3952s</td><td></td></tr><tr><td>Krs-2 (RJ-5)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-100449</td><td>Anticuerpo MST1</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehído</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>15710</td><td>Diluido al 4% de PFA en PBS para solución de fijación</td></tr><tr><td>Triton x100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP 151-500</td><td>Para preparar Triton x-100 al 0,1 % en 1xPBS para la solución de permeabilización</td></tr><tr><td>Microscopía confocal</td><td>Leica TCS SP8, 63x</td><td></td><td>Análisis de imágenes con el software ImageJ</td></tr></tbody></table>

detección de heterodimerization de isoformas de la proteína usando un análisis de ligadura in situ proximidad

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Las interacciones proteína-proteína regulada están un principio rector de muchos eventos de señalización, y la detección de este tipo de eventos es un elemento importante en la comprensión de cómo estas vías están organizadas y cómo funcionan. Hay muchos métodos para detectar las interacciones proteína-proteína en las células, pero relativamente pocos pueden utilizarse para detectar interacciones entre proteínas endógenas. Un tal método, el análisis de ligadura de proximidad (PLA), tiene varias ventajas para recomendar su uso. En comparación con otros métodos comunes de análisis de interacción de proteínas, PLA tiene relativamente alta sensibilidad y especificidad, se puede realizar con la manipulación mínima de la célula y en el protocolo descrito en este documento, requiere sólo dos específico del destino anticuerpos derivan de diferentes especies (por ejemplo., de ratón y conejo) y un reactivo especializado: un conjunto de anticuerpos secundarios que son oligonucleótidos covalentemente ligados a determinado que, cuando muy cerca uno del otro, crear un plataforma amplificable en situ PCR o amplificación de círculo rodante. En esta presentación mostramos cómo aplicar la técnica PLA para visualizar cambios en proximidad MST1 y MST2 en células fijas. La técnica descrita en este manuscrito es particularmente aplicable para el análisis de estudios de señalización de la célula.

Se utilizó el ensayo PLA para probar la interacción entre MST1 y MST2 en HEK-293 y iHSC. Las células eran fijos, permeabilized y teñidas con anticuerpos diferentes, seguidos de amplificación en situ según el protocolo PLA (figura 1). Para documentar el nivel de heterodimerization MST1/MST2, las células fueron teñidas con anticuerpos MST1 y MST2 (figura 1A, 1C y 1 G). Como control positivo, también utiliz...

Aquí, mostramos cómo hacer un análisis de proximidad de la ligadura (PLA) visualizar heterodimerization MST1/MST2 en células fijas con alta sensibilidad.

Detección de Heterodimerization de isoformas de la proteína usando un análisis de ligadura in Situ proximidad

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

El ensayo de ligadura de proximidad in situ o PLA, es una tecnología capaz de detectar interacciones entre proteínas, tejido fijado y células. Las asociaciones entre proteínas pueden identificarse y cuantificarse sin necesidad de expresión transgénica ni tecnologías adicionales. El único requisito es la disponibilidad de anticuerpos específicos de alta eficiencia que se pueden modificar con oligonucleótidos de ADN.En los tejidos MST1 y MST2 existen principalmente como homodímeros activos, pero los estímulos oncogénicos pueden aumentar el nivel de heterodimeros MST1 MST2 y tales heterodímeros están inactivos. Después de la incubación con anticuerpos de imprimación específicos contra las proteínas de interés, se añaden a la ranura anticuerpos secundarios específicos especiales, cada uno vinculado a una cadena de ADN única, corta y gratuita unida a ella, para unirse a los anticuerpos primarios. Si las proteínas en las preguntas son heterodimerizadas, tanto los anticuerpos primarios como los anticuerpos secundarios unidos a ellos estarán muy cerca.En este estado, las hebras de ADN adjuntas en los segundos anticuerpos pueden interactuar a través de una adición posterior de otros dos oligonucleótidos de ADN formadores de círculos. Varios cientos de replicación del círculo de ADN puede ocurrir después de una reacción de amplificación y una señal de fluorescencia es generada por sondas de oligonucleótido de cortesía niveladas. Por lo tanto, cada señal detectada se visualiza como un punto fluorescente individual que se puede asignar a una ubicación subcelular específica basada en imágenes de microscopio.El día antes del experimento, cubra 16 diapositivas bien bien cuidadas añadiendo 50 a 100 microlitros de laminina de ratón o poli-L-lisina e incubar a 37 grados centígrados. Después de 30 minutos eliminar la solución fría, dividir las células usando Trypsin y la placa 15,000 a 25, 000 células por pozo en 16 diapositivas bien cámaras. Incubar células a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5% durante 24 horas.Después de 24 horas, retire el medio de los pozos y lave suavemente las células con PBS. Utilice una micropipeta para minimizar la toma de riesgos de la muestra y luego aspire el PBS y fije las células añadiendo 50 microlitros de 4%PFA por pozo e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente sin agitación. No pipetee la solución directamente sobre las células, ya que eso puede resultar en el desprendimiento de las células.Después de la fijación, lave las células con TBST tres veces durante cinco minutos cada una con agitación leve. A continuación, permeabilizar las células e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente sin agitación. Una vez completada la permeabilización, lave las células con TBST tres veces durante cinco minutos por lavado con agitación.Después de eliminar TBST añadir una gota de solución de bloqueo en cada pozo e incubar los portaobjetos en una cámara de humedad precalentada durante una hora a 37 grados Centígrados. Diluir los anticuerpos primarios. Retire la solución de bloqueo con una micropipeta, pero no permita que las diapositivas se sequen.Vórtice y añadir 40 microlitros de la solución de anticuerpos diluidos a los pozos apropiados e incubar las muestras a 37 grados Celsius en una cámara de humedad precalentada durante una hora. Durante la incubación, diluya las dos sondas PLA en el diluyente de anticuerpos. Para cada muestra prepare 40 microlitros de sonda PLA.Después de una hora de incubación, aspirar la solución de anticuerpos y lavar los portaobjetos dos veces durante cinco minutos con TBST a temperatura ambiente. Retire suavemente el TBST de las diapositivas y agregue 40 microlitros de la solución de sonda PLA a cada pozo. Incubar los portaobjetos en una cámara de humedad precalentada durante una hora a 37 grados centígrados.Vórtice y diluya los volúmenes requeridos de la población de ligadura de 1 a 5 en agua de alta pureza inmediatamente antes de su uso. Se requieren 40 microlitros de la solución de ligadura para cada pocóteo. Después de la incubación, retire la solución PLA de los portaobjetos y lávelos dos veces en TBST durante cinco minutos a temperatura ambiente con agitación.Utilice un bloque de congelación al eliminar la ligasa del congelador y justo antes de agregarlo a las células, vórtice y diluirlo con la solución de ligadura. Retire el TBST de las diapositivas y agregue 40 microlitros de la solución de ligasa de ligadura a cada pocero. Incubar toboganes en una cámara de humedad precalentada durante 30 minutos a 37 grados centígrados.Después de la incubación aspirar la solución y lavar dos veces con TBST durante cinco minutos a temperatura ambiente con agitación. Evite exponer el pozo a la luz brillante, ya que los reactivos son sensibles a la luz. Durante el último lavado, vórtice y diluir los volúmenes requeridos de solución de amplificación en agua de alta pureza inmediatamente antes de su uso.Mantener la polimerasa sobre hielo o en un bloque de enfriamiento y justo antes de agregarla al vórtice de las células y diluir con la solución de amplificación. Aspirar el TBST de los pozos y añadir 40 microlitros de solución de amplificación a cada pocólculo. Incubar toboganes en una cámara oscura de humedad precalentada durante 100 minutos a 37 grados centígrados.Después de la incubación, aspirar la solución de amplificación polimerasa de los portaobjetos y lavar dos veces diez minutos cada uno en TBST a temperatura ambiente. Retire las cámaras y la silicona alrededor de los pozos de la diapositiva por completo. Raspa las perlas restantes de silicona con una maquinilla de afeitar.Dibuja una cuadrícula en la diapositiva que separa cada pozo. Agregue aproximadamente 40 microlitros del medio de montaje con DAPI, asegurando que no quede ninguna burbuja de aire atrapada bajo el resbalón de la cubierta. Use esmalte de uñas para fijar el vidrio de la cubierta.El análisis microscópico se puede realizar en 20 minutos después de la fijación, pero en la práctica nos resulta más conveniente realizar análisis de imágenes al día siguiente. Para analizar las muestras, utilizamos un microscopio de escaneo láser de configuración Leica SP8. Aquí se muestran ejemplos de ensayo de ligadura de proximidad in situ que visualiza la proximidad entre las proteínas MST 1 y MST2 en las células renales embrionarias humanas en los paneles A a D, y las células Schwann humanas en los paneles E a través de H.In todos los núcleos celulares de los paneles son manchados de azul por DAPI y los puntos rojos indican señales de ligadura de proximidad positivas resultantes de la proximidad cercana entre las proteínas indicadas.El panel A muestra la proximidad de MST1 y MST2 y el panel B muestra la proximidad de ERK y fosfoERK, ya que estos epítopos están en la misma proteína. El Panel C representa un control negativo, ya que estas células como MST1 y MST2 y el Panel D representan un segundo control negativo manchado con anticuerpos para MST1 y ERK que no se espera que estén cerca unos de otros. Los paneles E y F muestran la proximidad de MST1 con MST2 y ERK con fosfoERK en células Schwann.Los paneles G y H son controles negativos manchados solo con anticuerpos MST1 o con anticuerpos MST1 y ERK. Es imperativo utilizar anticuerpos primarios no reactivos que deben reconocer sólo un miembro del heterodímero. También es importante recordar el uso de diferentes puntas para evitar la contaminación cruzada de anticuerpos primarios y sondas PLA, para evitar tocar el fondo del pozo, y para evitar pipetear directamente en las muestras.Después de ver este video usted debe tener una buena comprensión de cómo utilizar PLA in situ para estudiar la dimerización de proteínas en células fijas.

detection-heterodimerization-protein-isoforms-using-an-situ-proximity

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Aquí se muestra cómo utilizar la ligadura de ensayo de proximidad (PLA), con una combinación de anticuerpos para visualizar la proteína morfogenética ósea (BMP) de señalización en células fijadas. Esta técnica nos permitió seguir la acumulación nuclear de endógeno BMP activa de efectos complejos y cuantificar sus niveles en el tiempo en BMP4 estimulación.

La detección de señalización de Efectos Complejos de aguas abajo de BMP4 uso In situ PLA, un ensayo de la ligadura de proximidad

Este video describe el ensayo de ligadura de proximidad para estudiar in situ las interacciones proteína-proteína en células de nematodos. La proximidad de las proteínas de interés genera la plantilla circular de ADN con la ayuda de una sonda de PLA unida a un anticuerpo secundario. La sonda se amplifica aún más utilizando la solución de amplificación, que produce un ADN monocatenario largo seguido de la hibridación de la sonda detectora, lo que permite la localización de las interacciones...

Ensayo de ligadura de proximidad para estudiar in situ las interacciones proteína-proteína

Este protocolo demuestra cómo la proximidad Ligadura ensayo se puede usar para detectar in situ en las interacciones proteína-proteína en la unión neuromuscular Drosophila larval. Con esta técnica, los discos grandes y Hu-li shao tai se muestra para formar un complejo en la región postsináptica, una asociación identificado previamente a través de co-inmunoprecipitación.

Detección de In Situ Complejos proteína-proteína en la Drosophila Larval unión neuromuscular Usando proximidad Ligadura Ensayo

A continuación, describimos un procedimiento para visualizar y cuantificar con alta sensibilidad las interacciones endógenas entre el retículo endoplasmático y las mitocondrias en las células fijadas. El protocolo cuenta con una optimizada en el ensayo de ligamiento por proximidad situ la orientación del inositol receptor / proteína 1,4,5-trifosfato regulada por glucosa 75 / D compleja canal de aniones / ciclofilina dependiente de la tensión en la interfase membrana de la mitocondria asociada.

Estudio del retículo endoplasmático y las mitocondrias por Interacciones<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidad ligadura de ensayo en células fijadas

Las interacciones proteína-proteína pueden ocurrir tanto en el núcleo como en el citoplasma de una célula. Para investigar estas interacciones, se aplica la coinmunoprecipitación tradicional y el ensayo moderno de ligadura de proximidad. En este estudio, comparamos estos dos métodos para visualizar la distribución de las interacciones NF90-RBM3 en el núcleo y el citoplasma.

La visualización de la interacción proteína-proteína en las fracciones nucleares y citoplasmáticas de Co-inmunoprecipitación y<em&gt; In Situ</em&gt; Ligadura ensayo de proximidad

Aquí se demuestra cómo se puede usar el Ensayo de Ligación de Proximidad in situ (PLA) para detectar y visualizar las interacciones directas proteína-proteína entre ATM y p53 en cultivos de células en suspensión expuestos al estrés genotóxico.

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

Aquí presentamos un protocolo para supervisar el montaje y desmontaje de la toxina del ántrax mediante interferometría de la biocapa (BLI). Tras el montaje y desmontaje en la superficie del biosensor, los complejos de proteínas grandes son liberados de la superficie para la visualización e identificación de componentes de los complejos usando microscopia electrónica y espectrometría de masas, respectivamente.

Análisis complejos de la proteína dinámica montan en y de interferometría de biocapa Biosensor usando espectrometría de masas y microscopia electrónica

Este protocolo describe un enfoque libre de calibración para cuantificación de proteína homo-Oligomerización en vitro basado en la espectroscopia de fluorescencia de fluctuación comercial luz microscopia. Se muestran los métodos de análisis y configuración correcta adquisición.

Calibración-libre In Vitro cuantificación de proteína Homo-Oligomerización utilizando instrumentación comercial y Software de análisis de brillo libre de código abierto

Las proteínas de dominio J de Cognate cooperan con el acompañante Hsp70 para ayudar en una miríada de procesos biológicos que van desde el plegado de proteínas hasta la degradación. Aquí, describimos un ensayo de ligadura de proximidad in situ, que permite el seguimiento de estas máquinas de chaperone formadas transitoriamente en células bacterianas, levaduras y humanas.

Monitoreo in situ de conjuntos de chaperona molecular formadas transitoriamente en bacterias, levaduras y células humanas

Este protocolo demuestra el uso del ensayo de ligadura de proximidad para sondear las interacciones proteína-proteína in situ en la línea germinal de C. elegans.

Detección en situ del conjunto del complejo de ribonucleoproteína en la línea germinal de C. elegans utilizando el ensayo de ligadura de proximidad

Los ensayos de captura de bucle D (DLC) y extensión de bucle D (DLE) utilizan el principio de ligadura de proximidad junto con PCR cuantitativa para cuantificar la formación de bucle D, la extensión del bucle D y la formación de productos en el sitio de una ruptura ducible de doble cadena en Saccharomyces cerevisiae.

Detección de intermediarios de recombinación homóloga mediante ligadura de proximidad y PCR cuantitativa en Saccharomyces cerevisiae

Aprende a detectar la heterodimerización de proteínas MST1/MST2 en células fijas mediante el ensayo de ligadura de proximidad in situ. Este método de alta sensibilidad permite visualizar interacciones proteicas sin necesidad de expresión transgénica.

Detección de Heterodimerization de isoformas de la proteína usando un análisis de ligadura in Situ proximidad

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