Name: Formación de Biofilm oral sobre diferentes materiales para implantes dentales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprende a evaluar la formación de biofilm oral en titanio y circonia para implantes dentales mediante microscopía avanzada. Este método compara la viabilidad bacteriana y mejora la selección de materiales.

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Los autores agradecen José Augusto Maulin del laboratorio de microscopía multiusuario (Facultad de medicina de Ribeirão Preto) por su ayuda generosa con el EDS y SEM análisis y Hermano Teixeira Machado por su generosa asistencia técnica en la edición de vídeo.

Este estudio fue aprobado por la Junta de revisión institucional de la Facultad de Odontología de Ribeirão Preto, y el participante voluntario firmado el consentimiento por escrito (proceso 2011.1.371.583).
1. Biofilm formación in Situ
<ol><li>
Selección de los participantes
	<ol>
<li>Seleccionar a los pacientes basados en los siguientes criterios de inclusión: un individuo sano con una dentición completa y sin signos clínicos de enfermedades orales.</li>
		<li>Excluir a los pacientes basados en los siguientes criterios de exclusión: embarazo, lactancia, caries dental, enfermedad periodontal o tratamiento antibiótico en los últimos 3 meses, fumador o cualquier enfermedad sistémica que podría influir en el estado periodontal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de dispositivo intraoral
	<ol>
<li>Registro de la arcada maxilar mediante una impresión de alginato.</li>
		<li>Preparar tipo IV piedra añadiendo 19 mL de agua y 100 g de polvo de piedra. Vierta la piedra en el molde de alginato para hacer un modelo del arco maxilar.</li>
		<li>Diseñar y fabricar un dispositivo intraoral acrílico para apoyar a las probetas (discos de cerámica y titanio).<ol>
<li>Fabricar cierres retentivos de alambre de NiCr (0,7 mm de diámetro) utilizando alicates ortodónticos #139 y posición en el modelo. Para colocar la abrazadera entre los premolares superiores, doblar un extremo de cada alambre de modo que formen un bucle.<ol>
<li>Adaptar el bucle en la región de la papila interdental. En oclusal, inserte una curvatura suave para no interferir con los puntos de contacto y la oclusión. Hacer un 90 º doblez en el extremo de la abrazadera de retención en el acrílico.</li>
				<li>Para montar la pinza en el segundo molar superior, adaptar la curvatura del alambre en el tercio cervical (vestibular) del contorno del diente (distal) y 90 º doblez en el extremo de la abrazadera de retención en el acrílico. Nota: Para proveer retención/estabilidad adecuada al dispositivo intraoral, los broches de retención se colocaron entre los premolares superiores y el aspecto distal del segundo molar en ambos lados de la arcada dental.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Manipular la resina acrílica autopolimerizable según las instrucciones del fabricante y presiona la resina de acrílico entre 2 placas de vidrio (con un espaciador de espesor 3 mm interpuesto) durante la fase plástica, para hacer una hoja gruesa de 3 milímetros.</li>
			<li>Coloque la hoja de acrílico en la región palatina de la modelo, según el diseño del dispositivo y recortar el excedente la resina de acrílico con un carver, antes de la polimerización.</li>
			<li>Fabricación de discos de cera mediante una matriz metálica [10 mm de diámetro, 2 mm de espesor (área de superficie de 78,5 mm2)] colocando cera fundida en la matriz y a la espera de la cera se solidifique. Incorporar manualmente 4 discos de cera en la resina de acrílico, 2 de ellos entre los premolares y los otros 2 al lado de los segundos molares.</li>
			<li>Deje que la resina de acrílico polimerice en una olla a presión menores de 20 psi de aire comprimido por 20 min.</li>
			<li>Acabado el dispositivo intraoral con una pieza de mano eléctrica laboratorio dental y cortador y pulir con abrasivo de goma.</li>
			<li>Ajustar el dispositivo para un ajuste correcto en la boca, utilizar el equipo descrito anteriormente.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de las probetas de titanio y zirconio Nota: Las muestras (n = 14) son 10 mm de diámetro y 2 mm de espesor y tienen una superficie de 78,5 mm2.<ol>
<li>Pulir las superficies de los especímenes con lijas refrigerado por agua de disminuir la abrasividad (600, 1200 y 2000 arena), durante aproximadamente 20 minutos. Nota: El pulido de las muestras fue realizado para uniformar la rugosidad de la superficie a 0.2 μm.</li>
		<li>Limpiar y desinfectar las muestras y los dispositivos intraorales con agua y detergente líquido y luego un baño de ultrasonidos de alcohol isopropílico para 15 minutos secar con toallas de papel absorbente.</li>
		<li>Fijar a las muestras en el aparato bucal intraoral con aproximadamente 0.1 mL de adhesivo de fusión en caliente no tóxico (figura 1).</li>
		<li>Instalar el dispositivo que contiene a las muestras de la cavidad bucal. Nota: El dispositivo intraoral que contiene a las muestras se debe usar durante 48 h. El dispositivo fue extraído y guardado en tampón fosfato salino (PBS) mientras que el paciente era comer y realizar la limpieza oral.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. evaluación de viabilidad bacteriana
Nota: La muestra tamaño n = 10.
<ol><li>Preparar una solución de teñido mediante la adición de 3 μl de SYTO9 (ácido nucleico fluorescente tinte verde) y 3 μl de yoduro de propidio (rojo ácido nucleico fluorescente tinte) a 1 mL de estéril de agua destilada. Nota: Preparar soluciones protegidas de la luz.</li>
	<li>Transferir a las muestras a una placa de 24 pocillos y lávelos bien con PBS para eliminar las células no adherentes.</li>
	<li>Añadir el volumen adecuado (1 mL) de solución de colorante fluorescente para cubrir a la muestra que contiene el biofilm. Añadir el colorante con mucho cuidado para no desorganizar el biofilm.</li>
	<li>Incubar a la muestra durante 20-30 min a temperatura ambiente, protegido de la luz.</li>
	<li>Lave suavemente la muestra de biofilm con agua destilada estéril para eliminar cualquier exceso de tinte.</li>
	<li>Coloque al espécimen en un plato de fondo de cristal y efectuar multifotón láser microscopía para el análisis de biofilm. Nota: El análisis de la viabilidad de las células bacterianas se llevó a cabo mediante un sistema de microscopía multifotón. La fluorescencia de yoduro de propidio fue detectada usando un filtro con una longitud de onda de excitación/emisión de 546/680 nm y 477/600 nm para SYTO9. El tamaño de las imágenes obtenidas fue 5.16188 x 5.16188 mm, que corresponde a 26,64 mm2 de área total de cada muestra (78,5 mm2) o el 33.94% de la superficie total. Las imágenes fueron hechas desde la parte más central de la muestra, con una resolución de 1.024 x 1.024 píxeles. El canal rojo y canal verde imágenes se analizaron por separado de software Fiji31. Cada celda fue seleccionado utilizando una herramienta de selección y la intensidad de la fluorescencia fue medida a través de la densidad integrada de los píxeles, restando el fondo de la imagen.</li>
</ol>3. Análisis de la composición química de las muestras por espectroscopia de energía dispersiva (EDS)
Nota: La muestra tamaño n = 3.
<ol><li>Seleccione a 3 ejemplares de cada material de la prueba libre de biofilm y evaluar la composición química en 2 zonas diferentes de cada muestra con un microscopio electrónico acoplado a un espectrómetro de energía dispersiva, con una tensión de haz de electrones de 10 kV32.</li>
</ol>4. morfológico análisis del Biofilm bacteriano por microscopía electrónica de barrido
Nota: La muestra tamaño n = 1.
<ol><li>Fijar el biofilm sumergiendo las muestras en glutaraldehído 2.5% diluido en buffer de cacodilato de sodio de 0.1 M, pH 7.0-7.3, para 24 h.</li>
	<li>Lavar la muestra en tampón PBS (pH = 7,6).</li>
	<li>Postfix el biofilm con tetróxido de osmio 1% durante 1 hora.</li>
	<li>Lavar la muestra en tampón PBS (pH = 7,6).</li>
	<li>Deshidratan las muestras de la biopelícula cuidadosamente, manteniéndolos sumergidos en el aumento de concentraciones de soluciones de etanol (50%, 70%, 90%, 95% y 100%). Nota: Realizar 3 intercambios de etanol a una concentración de 100%. El paso de deshidratación total toma aproximadamente 2 horas.</li>
	<li>Transferir las muestras en el secador de punto crítico y hacer varias sustituciones con dióxido de carbono (CO2) hasta que las muestras estén secas.</li>
	<li>Retire a las muestras secas del aparato y montar sobre los soportes de microscopio electrónico de barrido.</li>
	<li>Farfullar-capa una capa de nm 20 de oro sobre la superficie de la muestra de 120 s.</li>
	<li>Inserte los discos recubiertos de oro en la cámara de microscopio electrónico de barrido. Obtención de imágenes de 5 diferentes áreas de cada muestra, en 20-30 kV bajo presión variable y de aumento de 650 X12.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito en este estudio se desarrolló para evaluar la formación de biopelículas sobre materiales de titanio y zirconio para aditamentos protésicos, incluyendo el análisis de la viabilidad de la célula bacteriana y características morfológicas. Para lograr esto, se diseñó un modelo en situ de la formación de biopelículas, que consta de un dispositivo intraoral capaces de acomodar las muestras de los materiales de prueba y mantenerlos expuestos al medio oral dinámico durante 48 h. El dispositivo era ...

Biofilms bacterianos son complejos, funcionalmente y estructuralmente organizada las comunidades microbianas, caracterizado por una diversidad de especies microbianas que sintetizan una matriz extracelular polímero biológicamente activo1,2. La adhesión bacteriana a superficies bióticas o abióticas es precedida por una formación de la película adquirida, que consiste en principalmente glicoproteínas salivales1,3,4. Débiles interacciones fisicoquímicas entre los microorganismos y la película son inicialmente establecidas y seguidas por fuertes interacciones adhesinas bacterianas y receptores de la glicoproteína de la película adquirida. Diversidad microbiana aumenta gradualmente a través de la coaggregation de los colonizadores secundarios a los receptores de las bacterias ya atados, formando una comunidad de especies1,3,4, 5.
Homeostasis de la microbiota oral y su relación simbiótica con el hospedero es importante en el mantenimiento de la salud oral. La disbiosis dentro de los biofilms orales pueden aumentar el riesgo para el desarrollo de caries y enfermedad periodontal2,5. Estudios clínicos demuestran una relación de causa y efecto entre la acumulación de biofilm en los dientes o implantes dentales y el desarrollo de gingivitis o peri-implante mucositis6,7. La progresión del proceso inflamatorio conduce a peri-implantitis y la consiguiente pérdida del implante8.
Implantes dentales y sus componentes protésicos son propensos a la colonización bacteriana y biofilm formación9. El uso de materiales con una composición química y la topografía de la superficie que proporciona la adherencia microbiana baja puede reducir la prevalencia y progresión de peri-implante enfermedades9,10. El titanio es el material más utilizado para la fabricación de aditamentos protésicos para implantes; sin embargo, los materiales cerámicos fueron introducidos recientemente y están ganando popularidad como una alternativa al titanio debido a sus propiedades estéticas y biocompatibilidad11,12. También importante, materiales de cerámica se han asociado con un potencial supuestamente reducido a adherirse a los microorganismos, principalmente debido a su rugosidad, la humectabilidad y la energía libre superficial10,13.
Estudios in vitro han contribuido a importantes avances en la comprensión de la adherencia microbiana a pilar protésico superficies9,14,15,16,17. Sin embargo, el dinámico ambiente de la cavidad oral, caracterizado por sus diversos temperatura y pH y la disponibilidad de nutrientes, así como por la presencia de las fuerzas de corte, no es reproducible en vitro protocolos experimentales18, 19. Para superar este problema, una alternativa es el uso de modelos en situ de la formación de biofilm, que ventajosamente conserva su estructura tridimensional para ex vivo análisis10,20, 21 , 22 , 23 , 24.
El análisis de la compleja estructura del biofilm formado sobre sustratos orales requiere el uso de técnicas de microscopía de ópticamente denso materia25. Microscopía multifotón láser es una opción moderna para biofilm análisis estructural26. Se caracteriza por el uso de la óptica no lineal con una fuente de iluminación cerca de la longitud de onda infrarroja pulsada a femtosegundos27. Este método está indicado para la adquisición de imágenes de Autofluorescencia o materiales marcados por fluoróforos, además de imágenes generadas por señales ópticas no lineales derivadas de un fenómeno conocido como segunda generación armónica. Entre las ventajas de la microscopía multifotón es la profundidad de la imagen obtenida con células mínimo daño causado por la intensidad de la luz de excitación27.
Para un análisis de viabilidad de biopelícula en superficies abióticas por microscopía multifotón, el uso de ácido nucleico fluorescente tiñe con diferentes características espectrales y una capacidad de penetración en las células bacterianas es necesario28. Fluorophores SYTO9 (verde fluorescente) y yoduro de propidio (rojo fluorescente) pueden ser utilizados para una diferenciación visual entre bacterias vivas y muertas28,29,30. Yoduro de propidio penetra solamente bacterias con membranas dañadas, mientras que SYTO9 entra en las células bacterianas con una membrana intacta y comprometida. Cuando ambos colorantes están presentes dentro de una celda, yoduro de propidio tiene una mayor afinidad por los ácidos nucleicos y desplaza SYTO9, marca rojo28,30.
Teniendo en cuenta el medio ambiente oral oral y complejidad biofilm heterogeneidad, microscopia se necesitan técnicas que permite el análisis de la biopelícula de las superficies de los dientes y materiales dentales. Este artículo describe una serie de protocolos implementados para comparar la formación de biofilm oral sobre titanio y materiales cerámicos de aditamentos protésicos, así como los métodos de análisis de biopelículas orales a nivel morfológico y celular.

<table><tbody><tr><td>Hydrogum 5</td><td>Zhermack Dental</td><td>C302070</td><td></td></tr><tr><td>Durone IV</td><td>Dentsply</td><td>17130500002</td><td></td></tr><tr><td>alambre de NiCr&nbsp;</td><td>Morelli</td><td>55.01.070</td><td></td></tr><tr><td>JET acrílico autopolimerizante</td><td>Cl&aacute; ssico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cera dental&nbsp;</td><td>Cl&aacute; ssico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olla de presión&nbsp;</td><td>Esenciadental</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lijas grano 600</td><td>NORTON</td><td>T216</td><td></td></tr><tr><td>Lijas grano 1200</td><td>NORTON</td><td>T401</td><td></td></tr><tr><td>Lijas grano 2000</td><td>NORTON</td><td>T402</td><td></td></tr><tr><td>Pulidora metalográfica</td><td>Arotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>Adhesivo termofusible</td><td>TECSIL</td><td>PAH M20017</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Kit de viabilidad</td><td>Invitrogen</td><td>L10316</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta, 10 y micro; L</td><td>KASVI</td><td>K8-10&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta, 1.000 y micro; L</td><td>KASVI</td><td>K8-1000B&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 pocillos&nbsp;</td><td>KASVI</td><td>K12-024</td><td></td></tr><tr><td>Plato con fondo de vidrio</td><td>Thermo Scientific</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido AxioObserver&nbsp;</td><td>Láser ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon vision ii</td> Objetivo <td>coherente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Aceite DIC</td><td>ZEISS</td><td>440452-9903-000</td><td></td></tr><tr><td>Sensores SDD - X-Max 20mm&sup2;</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de glutaraldehído</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de cacodilato de sodio&nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>97068&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>201030</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S9638</td><td>Se utiliza para la preparación de solución salina tamponada con fosfato</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9791&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>MERK</td><td>1.06404</td><td></td></tr><tr><td>Kcl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9333&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Absoluto de etanol para análisis EMSURE</td><td>MERK</td><td>1.00983</td><td></td></tr><tr><td>CPD 030 Secador de punto crítico</td><td>BAL-TEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JSM-6610 Series Microscopio electrónico de barrido</td><td>JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCD 050 Recubridor por pulverización catódica</td><td>BAL-TEC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

formación de biofilm oral sobre diferentes materiales para implantes dentales

Oral Biofilm Formation on Different Materials for Dental Implants

Implantes dentales y sus componentes protésicos son propensos a la colonización bacteriana y formación de biopelículas. El uso de materiales que proporciona la adherencia microbiana baja puede reducir la prevalencia y progresión de enfermedades peri-implante. Teniendo en cuenta el medio ambiente oral oral y complejidad biofilm heterogeneidad, microscopia se necesitan técnicas que puede hacer un análisis de biofilm de las superficies de los dientes y materiales dentales. Este artículo describe una serie de protocolos implementados para comparar la formación de biofilm oral sobre titanio y materiales cerámicos de aditamentos protésicos, así como los métodos de análisis de biopelículas orales a nivel morfológico y celular. El modelo en situ para evaluar la formación de biofilm oral sobre materiales de titanio y zirconio para pilares de prótesis dentales como se describe en este estudio ofrece una satisfactoria preservación de la biopelícula de 48 h, lo que demuestra la adecuación metodológica. Microscopía multifotón permite el análisis de un representante del área de la biopelícula formada en la prueba de materiales. Además, el uso de fluoróforos y el procesamiento de las imágenes mediante microscopía multifotón permiten el análisis de la viabilidad bacteriana en una población muy heterogénea de microorganismos. La preparación de muestras biológicas para microscopia electrónica promueve la preservación estructural de biofilm, imágenes con buena resolución y sin artefactos.

La densidad de colonización de la biopelícula después de 48 h de crecimiento en situ estuvo representada en este estudio por la proporción del área colonizada en los discos de titanio y zirconio en relación con el total área escaneada de la muestra mediante microscopía multifotón ( 26.64 mm2). Figura 2 representa la densidad de colonización bacteriana en la superficie de los materiales probados 3. Se observó una mayor densidad de biofilm e...

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la formación de biofilm oral sobre materiales de titanio y zirconio para pilares de prótesis dental, incluyendo el análisis de la viabilidad de las células bacterianas y características morfológicas. Un modelo en situ asociado con técnicas de microscopía de gran alcance se utiliza para el análisis de biofilm oral.

Formación de Biofilm oral sobre diferentes materiales para implantes dentales

Dental implants and their prosthetic components are prone to bacterial colonization and biofilm formation. The use of materials that provides low ...

Formación de biofilm oral en diferentes materiales para implantes dentales. Las biopelículas bacterianas son comunidades microbianas complejas, funcional y estructuralmente organizadas, caracterizadas por una diversidad de especies microbianas que sintetizan una matriz polimérica extracelular biológicamente activa. Los implantes dentales y sus componentes protésicos son propensos a la colonización bacteriana y a la formación de biopelículas.El uso de materiales con una composición química y una topografía superficial que proporcionen una baja adhesión microbiana puede reducir la prevalencia y la progresión de las enfermedades periimplantarias. En vista de la complejidad general del entorno y la heterogeneidad de la biopelícula oral, se necesitan técnicas microscópicas que puedan permitir el análisis estructural de la biopelícula de los dientes y las superficies del material dental. En este artículo se describen una serie de protocolos implementados para comparar la formación de biofilm oral en diferentes materiales para implantes dentales.Los pasos involucrados en el uso de la formación de biopelículas en este estudio fueron los siguientes:Registrar el arco maxilar mediante una impresión de alginato. Vierta la impresión de alginato con piedra Tipo IV para fabricar un modelo de arco maxilar. Fabrique clips retenedores de alambre microcromado y ubíquelos en el modelo.Manipule la resina acrílica autopolimerizable de acuerdo con las instrucciones del fabricante y presione la resina acrílica entre dos placas de vidrio durante la fase plástica para hacer una lámina de tres milímetros de grosor. Coloque la lámina acrílica en la región palatina del modelo, de acuerdo con el diseño del dispositivo, y recorte el exceso de resina acrílica antes de la polimerización. Fabricar discos de cera utilizando una matriz de 10 milímetros de diámetro y dos milímetros de grosor.Incrusta cuatro discos de cera en la resina acrílica, dos de ellos entre los premolares y los otros dos junto a los segundos molares. Deje que la resina acrílica se polimerice en una olla a presión bajo 20 libras de aire comprimido durante 20 minutos. Finalice el dispositivo intraoral con una pieza de mano eléctrica y puntos de fresado y pulido.Pula las superficies de la muestra con papel de lija enfriado por agua que disminuya la abrasividad. Limpie las muestras con detergente líquido y agua del grifo y baño ultrasónico de alcohol isopropílico durante 15 minutos. Luego, sécalo con toallas de papel absorbentes.Fije las muestras en el dispositivo intraoral con adhesivo termofusible no tóxico. Instale el dispositivo que contiene las muestras en la cavidad oral. El dispositivo intraoral que contiene las muestras debe usarse durante 48 horas.Prepare una solución de tinte agregando tres microlitros de SYTO 9 y tres microlitros de yoduro de propidio a un mililitro de agua destilada estéril. Transfiera las muestras a una placa de 24 pocillos y lávelas a fondo con PBS para eliminar las células no adherentes. Agregue el volumen apropiado de solución de tinte fluorescente para cubrir la muestra que contiene biopelícula.Añade el tinte con mucho cuidado para no desorganizar el biofilm. Incubar el espécimen durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz. Lave suavemente la muestra de biopelícula con agua destilada estéril para eliminar el exceso de colorante.Coloque la muestra en un plato con fondo de vidrio para el análisis de la biopelícula, utilizando microscopía de escaneo láser multifotónico. El tamaño de las imágenes obtenidas fue de 5,16 x 5,16 mm, lo que corresponde a 26,64 milímetros cuadrados del área total de cada espécimen o 33,94% del área total. Las imágenes se analizaron con el software de Fiji.Cada celda se seleccionó utilizando una herramienta de selección y la intensidad de fluorescencia se midió a través de la densidad integrada de píxeles, restando el fondo de la imagen. Seleccione tres muestras de cada material de prueba y evalúe la composición química en dos áreas diferentes de cada muestra, utilizando un microscopio electrónico de barrido acoplado a un espectrómetro de energía dispersiva. Fije la biopelícula sumergiendo las muestras en un 2,5% de glutaraldehído diluido en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M durante 24 horas.Lavar en tampón PBS. Post-fijación con tetróxido de osmio al 1% durante una hora. Lavar en tampón PBS.Deshidrate las muestras de biopelícula con cuidado, manteniéndolas sumergidas en concentraciones crecientes de soluciones de etanol. Transfiera las muestras al secador de puntos críticos y haga varias sustituciones con dióxido de carbono hasta que las muestras se sequen. Retire las muestras secas del aparato y móntelas en los soportes del microscopio electrónico de barrido.Disperse una capa de oro de 20 nanómetros sobre las superficies de la muestra durante 120 segundos. La densidad de colonización del biofilm después de 48 horas de crecimiento in situ se representó en este estudio por la proporción del área colonizada con respecto a los discos de titanio y zirconia en relación con el área total escaneada del espécimen mediante microscopía multifotónica. La figura muestra las bacterias adheridas a las superficies de los materiales de prueba.Se observó una mayor densidad de biopelícula en las superficies de los discos de titanio fundidos y mecanizados que en los discos de zirconio. Esta figura muestra bacterias vivas y muertas adheridas a la superficie de los especímenes. En este protocolo, el yoduro de propidio teñido con ácido nucleico penetra solo en las bacterias con la membrana dañada y, por lo tanto, emite una señal fluorescente roja que está relacionada con las células muertas.SYTO 9 penetra en las células bacterianas con membrana intacta o comprometida y emite una señal fluorescente verde de microorganismos vivos. La viabilidad bacteriana celular fue similar entre los materiales de ensayo, con predominio de microorganismos vivos en todos los grupos. En la superficie de los diferentes materiales analizados se observaron grietas, ranuras o defectos de abrasión producidos durante el proceso de pulido y/o mecanizado.En los discos de Zirconia se observaron grandes áreas con ausencia de microorganismos y presencia de pequeños agregados microbianos polimórficos constituidos principalmente por cocos y bacilos y bacterias filamentosas. La presencia de cocos y bacilos se dispersó en las superficies de los discos de titanio mecanizados. Los especímenes de titanio fundido presentaron colonias de microorganismos involucrados en una matriz con apariencia de biopelícula en la superficie.Se observó menos material de matriz en la superficie de los discos de zirconio, en comparación con los discos de titanio mecanizado y titanio fundido. El análisis EDS reveló en los discos de zirconio un 70,83% de zirconio. En los discos de titanio fundido, 95,16 de titanio y en los discos de titanio mecanizado, 89,86% de titanio.El protocolo descrito en este estudio proporcionó una conservación satisfactoria del biofilm de 48 horas, demostrando por lo tanto, la adecuación metodológica. El uso de fuente de flúor y el procesamiento de las imágenes mediante microscopía multifotónica permitió analizar la integridad bacteriana en una población muy heterogénea de microorganismos de un área representativa de este espécimen con un daño celular mínimo. La preparación de especímenes biológicos para microscopía electrónica promovió la preservación estructural de la biopelícula, lo que resultó en una imagen con buena resolución y sin artefactos.Esto permitió la visualización y caracterización morfológica de los microorganismos adheridos.

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