Name: Visualización de la Microbiota en agallas de garrapata por Whole-mount In Situ hibridación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprende a visualizar la microbiota viable en intestinos de garrapatas mediante hibridación in situ whole-mount. Este método accesible permite el análisis espacial y temporal sin equipos costosos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos sinceramente el Dr. Mustafa Khokha, Universidad de Yale, proporcionando el uso de sus recursos de laboratorio. Agradecemos a Mr. Wu Ming-Jie excelente asistencia técnica. EF es un investigador HHMI. Este trabajo fue financiado por una donación de la John Monsky y Jennifer Weis Monsky fondo de investigación de la enfermedad de Lyme.

1. elaboración de plantillas de la DNA
<ol><li>Descargar la secuencia de rRNA 16S específica para cada género bacteriano de la NCBI diseño y base de datos de reacción en cadena polimerasa (PCR) compatible hacia adelante y atrás cartillas que se amplifican regiones específicas de géneros (~ 200-250 pares bajos largo) como se describió anteriormente 19. también consulte el código abierto las bases de datos SILVA20,21 y probeBase22 online recursos para sondas de oligonucleótidos dirigidos a rRNA y cartillas, como sondas de RNA para algunos géneros bacterianos pueden ser comercialmente disponible. Nota: Es importante seleccionar regiones de genes que son específicos a específicos géneros y asegurar que primers diseñados no amplificar géneros bacterianos relacionados. Esto es fundamental para conseguir la hibridación de géneros/gene-específico sonda.</li>
	<li>Alimentación de las garrapatas para 24, 48 o 72 h en ratones, diseccionar tripas de garrapata y elaborar ARN y cDNA de tripas de garrapatas como descrito anterior23. CDNA de uso como plantilla para PCR amplifican amplicones específicos de géneros utilizando un termociclador. Ejecutar una parte alícuota de la polimerización en cadena-producto/productos en gel de agarosa 1.5% y confirmar que el amplicon corresponde al tamaño esperado por visualización bajo luz ultravioleta (UV) utilizando un gel sistema de imagen.</li>
	<li>Clonar el bacteriano 16S ribosomal RNA amplicon de interés en un vector disponible comercialmente de TA (Tabla de materiales) que contienen promotores de la ARN polimerasa adecuados para Polimerasas del bacteriófago (SP6, T7 y T3). La secuencia de los clones para confirmar la identidad de los amplicones y la direccionalidad de la copia con respecto a cada uno de los promotores. En base a esto, determinar el promotor de la opción generar sentido o antisentido RNA puntas de prueba (figura 1).</li>
	<li>Alinear 1 mg del plásmido con una enzima de restricción apropiada en un volumen de reacción de hasta 30 µLfor 2 h en las temperaturas recomendadas por el fabricante. Elegir las enzimas de restricción basadas en el promotor que se utilizarán para generar el sentido o la punta de prueba antisentido (figura 1). Verificar la linearización de visualización de 2 μl de la reacción de digestión en gel de agarosa al 1%.</li>
	<li>Purificar las restantes 28 μl de ADN digerido utilizando un kit de potabilización comercialmente disponible de PCR producto columna y cuantificar la concentración de DNA por el espectrofotómetro. Nota: Algunas sondas de sentido pueden causar tinción de fondo mucho más alta que la correspondiente sonda antisentida y otras opciones deben ser exploradas. Controles negativos alternativos incluyen plásmidos codifican secuencias no representadas en la muestra u otro sondeo que produce un patrón distintivo de la hibridación.</li>
</ol>2. construcción de sondas de RNA Digoxygenin-UTP
<ol><li>Preparar la mezcla de nucleótidos mediante la combinación 7.5 μl 100 mm UTP, 25 μl de 10 mM digoxygenin-UTP y 10 μl cada una de 100 mM ATP, GTP y CTP, en un tubo de centrífuga de 1.5 mL.</li>
	<li>Realizar la transcripción en vitro usando kits de polimerasa T7 o Sp6 RNA disponibles comercialmente, utilizando 1 μl de la mezcla de nucleótidos (paso 2.1) y 0.25 - 1 μg de plantilla de ADN. Llevar el volumen hasta 20 μl con agua. Flick el tubo para combinar y pulso spin. Incubar a 37 ° C por 2.5-3 h. Nota: Construcción de la sonda ha tenido éxito con plásmido digerido concentraciones tan bajas como 7 ng/μl, pero concentraciones típicas en esta gama de paso de 15-25 ng/μl. La reacción de transcripción también se incuba durante la noche a 37 ° C, pero esto no aumentó significativamente la producción de RNA.</li>
	<li>Añadir 1 μl de DNasa (2.000 unidades/μL) y se incuba a 37 ° C durante 10 minutos. No exceda 10 minutos, o la enzima puede comenzar a degradar RNA.</li>
	<li>Añadir 30 μl de cloruro de litio de helada de 7,5-8 M y 30 μl de agua libre de nucleasa refrigerada para precipitar el ARN. Flick el tubo para mezclar. Permitir la precipitación de RNA para proceder durante la noche a-20 ° C.</li>
	<li>Recoger el RNA por centrifugación a 17.000 x g por 20 min a 4 ° C. Lavar el precipitado una vez con 1 mL de etanol al 75% recién preparada en dietil pirocarbonato (DEPC) agua y repita la centrifugación.</li>
	<li>Retire y descarte el sobrenadante, invertir el tubo sobre una toalla de papel limpia y dejar para secar por 10 minutos Resuspender el precipitado en agua libre de nucleasa. Si el sedimento es fácilmente visible, resuspender en 25 μl. Si la pastilla es muy pequeña o no visible, resuspender en 15-20 μl. obtener una estimación de la concentración de RNA de espectrofotómetro. Nota: RNA típicas concentraciones entre 200-500 ng/μl.</li>
</ol>3. visualización de RNA puntas de prueba por electroforesis del Gel del ARN formaldehído para evaluar la pureza del ARN
PRECAUCIÓN: Formaldehído plantea un peligro de inhalación; por lo tanto, generar las soluciones necesarias para el análisis del gel del ARN en una campana de humos. Bromuro de etidio es un carcinógeno; Manéjela con cuidado.
<ol><li>Preparar un gel de agarosa 1% formaldehído como descrito previamente24 y echado el gel en una caja de gel libre de RNasas. Una vez fría, llenan el cuadro de gel 1 x buffer (1 x MOPS a pH 7,0, formaldehído al 5%) de ejecución.</li>
	<li>Preparar el tampón de muestra (bromuro de etidio de 400 mg/mL de 5 μl, 20 μl 10 x MOPS, 35 formaldehído μl y 100 μl formamida). 2 μl de sonda de RNA (paso 2.6) se combinan con 8 μl del tampón de muestra. Incubar a 70 ° C durante 10 minutos.</li>
	<li>Preparar Buffer de carga de RNA mediante la combinación de 5 mL 50% de glicerol, formaldehído al de 10% 1 mL, azul de bromofenol 40 mg, 40 mg xileno cyanol y 20 μl de EDTA de 0,5 M (pH 7.5). Después de su uso, almacenar este tampón a-20 ° C.</li>
	<li>Agregar 3 μl de tampón de carga a la muestra de RNA de paso 3.2 y mezclar. Mantener los tubos en hielo.</li>
	<li>Cargar el volumen de toda muestra de paso 3.4 en el gel. Cargar una parte alícuota de escalera de RNA monocatenario junto a verificar tamaño de RNA. Correr el gel a 100 V o baja hasta que el colorante azul migra aproximadamente el 75% de la bajada del gel. Visualizar el RNA bajo luz UV utilizando un sistema de proyección de imagen del gel. Nota: Una sonda de RNA de buena calidad debe aparecer como una banda discreta con una movilidad corresponde al tamaño esperado de la sonda (figura 2, carril 1). Si la sonda aparece como difusa y graso banda (figura 2carril 2) esto no debe ser utilizado.</li>
</ol>4. colección de tripa y la fijación de la señal
<ol><li>Recoger a ninfas de Ixodes scapularis que han alimentado en ratones para los puntos de tiempo de interés. Nota: Para los efectos de esta técnica, garrapatas alimentan por 48 o 72 h trabajo mejor.</li>
	<li>Disecar el intestino de la garrapata en MEMFA (tabla 1) en un portaobjeto bajo el microscopio de disección, evitando daño al órgano tanto como sea posible. Coloque una marca sobre un portaobjetos limpio en 20-30 μl de MEMFA. Con un par de estéril alto carbono navaja acero #11 rebanada la región central en el escudo de la garrapata dejando el cuerpo de la garrapata. Presione suavemente el cuerpo para empujar la divertículos intestinal y las glándulas salivales a la cutícula del cuerpo. Separe las glándulas salivales y la tripa y sacar las tripas en la hoja de afeitar.</li>
	<li>Recoger vísceras en un tubo de 1,5 mL que contiene 500 μl MEMFA. Incubar el tubo a temperatura ambiente con balanceo suave durante 1 hora o toda la noche a 4 ° C. Nota: Marque las glándulas salivales también puede ser disecadas y semejantemente fijo y manchadas.</li>
	<li>Deshidratar los tejidos lavando suavemente 3 veces con 1 mL helada 100% de etanol. Que las tripas naturalmente se hunden hasta el fondo del tubo entre cada lavado, centrifugación puede dañar el tejido. Para el almacenamiento a largo plazo, mantener las muestras en etanol 100% a-20 ° C.</li>
</ol>5. construcción de malla muestra cestas y soporte de la canasta de 24 pocillos
<ol><li>Cortar los fondos de 2 mL o 5 mL tubos de centrífuga de la encajar a presión-tapa utilizando una hoja de afeitar calentada solo filo de un bisturí. PRECAUCIÓN: La hoja puede necesitar ser recalentado varias veces antes de que se complete el corte.</li>
	<li>Cortar cuadrados de una malla de nylon de 110 μm ligeramente más grande que la nueva apertura del tubo. Adherir la malla en la parte inferior del tubo presionándolos juntos ligeramente en un plato caliente sobre fuego medio-bajo hasta que un buen sello. Deje que se enfríe, asegurar que no quedan huecos entre la malla y el tubo y recortar el exceso de malla alrededor de los bordes.</li>
	<li>Corte agujeros en la tapa de una placa de 24 pocillos tal que el borde de la cesta de la muestra hecho en el paso 5.2 a sentarnos en el agujero y no caer, dando una configuración donde los fondos de las canastas de muestra se sentará en los pozos cuando se colocan en el orificios de la cubierta.</li>
	<li>Utilice este soporte de la canasta equipada para transferir cestas de una placa a otra con relativa facilidad para la totalidad del Protocolo de hibridación en situ . Utilice dos placas de 24 pocillos para que mientras se está produciendo una incubación, la otra placa está preparada para el siguiente lavado.</li>
</ol>6. hibridación in Situ : día 1 (tiempo: 4-5 h)
<ol><li>Valor de transferencia había etiquetado cestas muestra, separados por condición experimental y sonda de RNA la intención. Nota: La mancha por lo menos 5 agallas por condición para tener en cuenta la variación natural entre repeticiones.</li>
	<li>Rehidratar las muestras suavemente para evitar la introducción de burbujas de aire en el tejido aumentando gradualmente la proporción de solución salina con tampón fosfato con 0.1% de tensioactivo no iónico (PTw; Tabla 1) de etanol en los lavados. Nota: Completar los lavados en el soporte de la canasta de 24 pocillos a temperatura ambiente con agitación suave a menos que se indique lo contrario. Alícuotas de 500-600 μl de soluciones de lavado en cada pozo del titular tal que las tripas en cada cesta estén completamente sumergidas. Preparar todas las soluciones con agua tratada con DEPC para evitar la degradación del RNA.<ol>
<li>Lavar las muestras durante 5 minutos en 500 μl 100% de etanol.</li>
		<li>Preparar por lo menos 500 μl por canasta de muestra de 75%, 50% y 25% de etanol en PTw. Rehidratar las muestras de lavado durante 5 minutos en cada solución de etanol, pasando de la concentración de etanol más alto al más bajo.</li>
		<li>Lavar las muestras 4 veces de 5 min en PTw.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Permeabilizar las muestras con proteinasa K (10 μg/mL) en PTw durante 5 minutos.</li>
	<li>Preparar el tejido para hibridación con las sondas de RNA.<ol>
<li>Lavar las muestras dos veces como se describe en 6.2 en el soporte de la canasta de 24 pocillos a temperatura ambiente con agitación suave durante 5 minutos en 500 μl de tampón de trietanolamina (0.1 M, pH 7.0-8.0) (tabla 1) para mantener las muestras en un ambiente libre de Amina.</li>
		<li>Tratar las muestras dos veces con anhídrido acético de 500 μl 0.25% en tampón de trietanolamina (0.1 M, pH 7.0-8.0) durante 5 min, luego lavar las muestras dos veces en PTw por 5 min. Nota: El anhídrido acético acetylates aminas libres para neutralizar la carga positiva, que es fundamental para prevenir interacciones electrostáticas no específicas y garantizar la unión específica de la sonda al mRNA.</li>
		<li>Fijar las agallas por 20 min con paraformaldehido de 4% de 500 μl de PTw, luego lavar 5 veces en PTw durante 5 minutos.</li>
		<li>Prehybridize por incubación de las muestras en 500 μl de hibridación buffer /in el soporte de la canasta de 24 pozos en la placa bien 24 (tabla 1) por 1.5-2.5 h a 60 ° C con agitación suave en un baño. Guardar el buffer de hibridación utilizado por el paso prehybridization para reutilizar en el protocolo del día 2 (paso 7.1).</li>
		<li>Preparar soluciones de hibridación probe diluyendo las sondas de RNA en tampón de hibridación a una concentración final de 1 μg/mL.  Incubar las muestras con soluciones de hibridación de sonda en el soporte de la canasta de 24 pocillos a 60 ° C con agitación suave durante la noche en un baño (tabla 2). Cubra la placa con el soporte de la canasta bien con papel de aluminio para evitar la evaporación de la solución de hibridación.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. hibridación in Situ : día 2 (tiempo: 4.5-5.5 h)
<ol><li>Sacar las muestras de las soluciones de hibridación de la sonda y en el tampón de hibridación reservada del día anterior. Incubar a 60 ° C con agitación suave durante 3 minutos. Nota: Soluciones de sonda de hibridación pueden ser almacenadas a-20 ° C para su reutilización hasta 3 veces.</li>
	<li>Preparar diluyendo 20 2 x de buffer de citrato de sodio solución salina (SSC) x SSC en agua tratada con DEPC (tabla 1). Lavar las muestras dos veces por 3 minutos con 2 x SSC, luego 3 veces durante 20 min con 2 x SSC a 60 º C para eliminar los restos de la sonda y tampón de hibridación.</li>
	<li>Tratamiento con Rnasa (20 μg/mL) y Rnasa T1 (10 μg/mL) en 2 x SSC durante 30 min a 37 ° C para eliminar solo trenzado sonda RNA representando gratis no-cruzado por hibridación RNA.</li>
	<li>Lave una vez con 2 x SSC durante 10 min a temperatura ambiente. Preparar 0.2 x SSC por dilución 2 x SSC en el agua tratada con DEPC, luego lavar dos veces con 0,2 x SSC durante 30 min a 60 ° C para eliminar RNasas exceso.</li>
	<li>Lavar dos veces con 500 μl de tampón de ácido maleico (MAB; Tabla 1) de 10 minutos cada uno.</li>
	<li>Incubar las muestras con solución (reactivo de bloqueo 2% en MAB) 1.5-2 h de bloqueo. Nota: El reactivo de bloqueo puede ser difícil de disolver; calentamiento suave ayuda a la disolución.</li>
	<li>Reemplace la solución de bloqueo con anti-digoxigenina alcalina conjugados con fosfatasa 500 μl del anticuerpo a la dilución de 1:3,000 en solución de bloqueo e incubar a temperatura ambiente por cerca de 4 horas o a 4 ° C durante la noche.</li>
</ol>8. hibridación in Situ : día 3 (tiempo: 6 h hasta toda la noche)
<ol><li>Lavar las muestras por lo menos 5 veces de 30 minutos cada uno con 500 μl de MAB para quitar exceso del anticuerpo. Nota: Estos son flexibles y pueden ampliarse a 1-2 h o 3-4 lavados se pueden sustituir por un lavado durante la noche a 4 ° C con un mínimo efecto sobre la eficacia.</li>
	<li>Lavar dos veces durante 5 minutos con buffer de fosfatasa alcalina, pH 9.5 (tampón de AP; Tabla 1).</li>
	<li>Comenzar la reacción de color mediante la sustitución del último lavado con 500 μl de cromógeno sustrato para fosfatasa alcalina (Tabla de materiales). Cubrir la placa de la muestra con papel de aluminio y dejar que la tinción proceder a temperatura ambiente durante 3 - 5 h o durante la noche a 4 ° C. Monitorear periódicamente la reacción de tinción viendo el tejido bajo un microscopio de disección para evitar overstaining. Nota: Cuando la tinción es completa, un tinte púrpura es detectable por el ojo en las muestras de sondeo antisentido al microscopio, pero el tejido no se debe llegar a ser muy oscuro. La coloración procede muy lentamente a 4 ° C y puede tardar hasta 20-24 h.</li>
	<li>Detenga la reacción de color de lavado durante 5 minutos en 500 μl de MAB y fijar el tejido durante la noche en solución de Bouin. PRECAUCIÓN: Manipule solución de Bouin en una campana de humos; es un carcinógeno corrosivo.</li>
</ol>9. hibridación in Situ : día 4 (tiempo: 3-3,5 h)
<ol><li>Preparar por lo menos 7 mL por canasta de muestra de 1 x SSC por dilución 20 x SSC en el agua tratada con DEPC. Retirar la solución de Bouin lavando las muestras de 4 a 6 veces con etanol al 70% en 1 x SSC hasta que el tejido ya no es de color amarillo.</li>
	<li>Preparar 500 μl por canasta de muestra de soluciones de etanol 75%, 50% y 25% en 1 x SSC. Lavar las muestras durante 5 minutos en cada solución, pasando de más alta concentración de etanol a menor a rehidratar el tejido. Lavar dos veces durante 5 min cada 1 en x SSC.</li>
	<li>Incubar las muestras en la solución de lejía (tabla 1) durante 90 minutos en un lightbox en una campana de humos. Nota: Este paso permite cualquier pigmentación en las muestras o coloración de Bouins solución para quitarse y mejora la señal de la sonda para una visualización clara.</li>
	<li>Lavar las muestras dos veces con 500 μl de 1 x SSC durante 5 minutos.</li>
	<li>Reubicar las tripas con un daño mínimo por inversión de la cesta de la muestra en un pocillo de una placa de 24 pocillos nueva y lave con etanol al 70% a través del fondo de la malla con una pipeta de transferencia. Almacenar a-20 ° C si es necesario.</li>
	<li>Para obtener una visión general de los patrones de tinción de muestras múltiples como se muestra en la figura 3, mantener las tripas en etanol al 70% en la placa de la pozo 24 y la vista con cualquier microscopio de campo brillante. Examinar vísceras individuales bajo un microscopio de campo brillante como se muestra en la figura 4, figura 5, y la figura 6, Monte las tripas en glicerol al 100% bajo el cubreobjetos. Utilice una espátula de plástico para manipular suavemente los tejidos con daño mínimo. Nota: La alta viscosidad de la glicerina ayuda a proteger el tejido del daño por compresión y permite la colocación cuidadosa de divertículos que el tejido puede verse óptimamente con aumentos más altos.</li>
	<li>Captura de imágenes en el microscopio utilizando el software de captura de imagen específica de microscopio (Tabla de materiales) y exportar como una imagen genérica de software de edición de imágenes Tiff. Para cuantificar las diferencias de coloración relativas entre tratamientos experimentales, descargar un software de análisis de imagen genérico (Tabla de materiales). Abre la imagen dentro del software de análisis y siga las instrucciones dentro del software para medir intensidad de píxeles de la tinción y cálculo parcelas histograma de la tinción.</li>
</ol>

<ol><li>Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthropod+Vectors+and+Disease+Transmission%3A+Translational+Aspects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107(2015).</li>
<li>Hooper, L. V., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+host-bacterial+relationships+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Commensal host-bacterial relationships in the gut.</a> Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).</li>
<li>Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worlds+within+worlds%3A+evolution+of+the+vertebrate+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota.</a> Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).</li>
<li>Narasimhan, S., Fikrig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick+microbiome%3A+the+force+within%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Tick microbiome: the force within.</a> Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).</li>
<li>Weiss, B., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiome+influences+on+insect+host+vector+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitoly%22%5BJournal%5D)">Microbiome influences on insect host vector competence.</a> Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).</li>
<li>Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+microbiome+of+arthropods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The functional microbiome of arthropods.</a> PLoS One. 12 (5), e0176573(2017).</li>
<li>Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+ticks%2C+mice+and+men%3A+understanding+the+dual-host+lifestyle+of+Lyme+disease+spirochaetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).</li>
<li>Sojka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+machinery+of+blood+digestion+by+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">New insights into the machinery of blood digestion by ticks.</a> Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).</li>
<li>Grigor'eva, L. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1134/S0013873810030073">Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle.</a> Entomological Review. 90, 405-409 (2010).</li>
<li>Goodrich, J. K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25036628">Conducting a microbiome study.</a> Cell. 158 (2), 250-262 (2014).</li>
<li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biology. 12, 87(2014).</li>
<li>Hemmati-Brivanlou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110 (2), 325-330 (1990).</li>
<li>Frank, D., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+XMyoD+in+non-somitic+mesoderm+of+Xenopus+gastrulae%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae.</a> Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Kernohan, K. D., Berube, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+dimensional+dual+labelled+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+analysis+in+fixed+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections.</a> MethodsX. 1, 30-35 (2014).</li>
<li>Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSonenshine%2C+DE+%22Biology+of+ticks%22">Biology of ticks</a>. , Oxford University Press. (1991).</li>
<li>Narasimhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+of+the+tick+vector+Ixodes+scapularis+modulate+colonization+of+the+lyme+disease+spirochete%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete.</a> Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).</li>
<li>Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Borrelia+burgdorferi+sensu+lato+by+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+on+whole-body+sections+of+Ixodes+ricinus+ticks+and+gerbil+skin+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies.</a> Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).</li>
<li>Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+set+of+16S+rRNA-based+probes+for+detection+of+bacteria+in+human+feces%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces.</a> Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).</li>
<li>Quast, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SILVA+ribosomal+RNA+gene+database+project%3A+improved+data+processing+and+web-based+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools.</a> Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).</li>
<li>Yilmaz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SILVA+and+%26%2334%3BAll-species+Living+Tree+Project+%28LTP%29%26%2334%3B+taxonomic+frameworks%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The SILVA and &#34;All-species Living Tree Project (LTP)&#34; taxonomic frameworks.</a> Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).</li>
<li>Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((probeBase--an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes+and+primers%3A+new+features+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016.</a> Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).</li>
<li>Narasimhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+tick+gut+milieu+by+a+secreted+tick+protein+favors+Borrelia+burgdorferi+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization.</a> Nature Communication. 8 (1), 184(2017).</li>
<li>Bryant, S., Manning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+gel+electrophoresis+of+total+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Bioliogy%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA.</a> Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).</li>
<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li>
<li>Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+ribosomopathy+genes+during+Xenopus+tropicalis+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis.</a> BMC Development Biology. 16 (1), 38(2016).</li>
<li>Khokha, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+and+probes+for+the+study+of+Xenopus+tropicalis+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development.</a> Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).</li>
<li>Jowett, T., Lettice, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridizations+on+zebrafish+embryos+using+a+mixture+of+digoxigenin-+and+fluorescein-labelled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes.</a> Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).</li>
<li>Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+straightforward+DOPE+%28double+labeling+of+oligonucleotide+probes%29-FISH+%28fluorescence+in+situ+hybridization%29+method+for+simultaneous+multicolor+detection+of+six+microbial+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations.</a> Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).</li>
<li>Pai, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCN4+ion+channel+function+is+required+for+early+events+that+regulate+anatomical+left-right+patterning+in+a+nodal+and+lefty+asymmetric+gene+expression-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner.</a> Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).</li>
<li>Legendre, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos.</a> JoVE. (71), e50057(2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

Este es el primer uso de una técnica de hibridación (WMISH) conjunto de montaje en situ para el estudio de la microbiota de un artrópodo vector de agentes patógenos. Nuestro protocolo fue adaptado de uno usado para el estudio de desarrollo en Drosophila y en embriones de rana25,26. Conjunto de montaje RNA en situ el hibridación se ha utilizado rutinariamente para localizar espacialmente las transcripciones del gene y temporal<sup class=...

Patógenos humanos y animales transmitidas por artrópodos vectores se encuentran en todo el mundo y representan aproximadamente el 20% de las enfermedades infecciosas a nivel mundial1, pero efectivo y seguras vacunas contra la mayoría de estos patógenos no están disponibles. Está expandiendo nuestra comprensión de la importancia de los microorganismos comensales, simbióticas y patógenas, colectivamente conocidos como el microbioma2, en la modulación y la configuración de la salud de casi todos los metazoos3 . Ahora es evidente que artrópodos vectores de patógenos también albergan la microbiota intestinal y estos microbiota asociado vector han demostrado influir en diversos agentes patógenos transmitidos por el vector4,5. El microbioma artrópodo se compone de eubacteria, archaea, virus y microbios eucariotas como protozoos, nematodos y hongos6. Sin embargo, el enfoque predominante ha sido en eubacterias debido, en parte, la disponibilidad de genes marcadores y bases de datos de referencia para identificar a miembros bacterianos específicos.
Con un enfoque de scapularis de Ixodes, el vector de señal de múltiples patógenos humanos incluyendo Borrelia burgdorferi7, el agente causal de la enfermedad de Lyme, la optimización de una técnica de visualización microbiano apuntaba a mejorar nuestra comprensión de la señal intestinal microbiota en el contexto de las interacciones patógeno vector. Varias preguntas quedan para ser contestadas en el campo de microbioma de la garrapata. El intestino es el sitio del primer encuentro extendido entre la garrapata y el patógeno entrante en el contexto de patógenos transferidos horizontalmente; por lo tanto, entender el papel de la microbiota intestinal de vector en la modulación de las interacciones patógeno vector revelará información significativa. Las garrapatas tienen un modo único de la digestión de la comida de sangre, donde procesamiento de harina de sangre componentes ocurre intracelularmente lugar8. El lumen de intestino aparentemente sirve como recipiente para contener la harina de sangre como los feeds de la garrapata, y asimilación y digestión de nutrientes sobrevienen a lo largo de los días de la alimentación y continúan después de la repleción. Los patógenos adquiridos por la garrapata durante la alimentación entre el lumen intestinal junto con la harina de sangre y así la luz se convierte en un sitio primario de las interacciones entre la microbiota residente, garrapata y patógeno. Medida que avanza la digestión a través de la repleción y garrapatas Ixodid muda, el intestino sufre cambios estructurales y funcionales9. La composición y la organización espacial de las bacterias del intestino también es probable que varíe en concierto con el cambiante entorno de tripa. Por lo tanto, es importante entender la arquitectura de las bacterias residentes en el intestino de la garrapata para comprender la interacción de garrapatas y patógenos microbiota intestinal.
Técnicas moleculares para describir la microbiota asociada a host rutinariamente utilizan estrategias de secuenciación paralela de alto rendimiento10 para amplificar y secuenciar ADN ribosomal bacteriano 16S (ADNr). Estas estrategias de secuenciación eluden la necesidad de obtener cultivos axénicos de bacterias específicas y proporcionar una descripción más detallada de todos los miembros de bacterias en la muestra. Sin embargo, tales estrategias se confunden por la incapacidad de distinguir la contaminación ambiental de los residentes bona fide . Además, al evaluar muestras, tales como las garrapatas, que son pequeñas en tamaño y por lo tanto, contienen ADN de microbiota específica bajo rendimientos, la probabilidad de amplificación de los contaminantes ambientales es mayor11 y en la interpretación ambigua de los resultados composición del microbioma. Caracterización funcional junto con la visualización de bacterias viables concretas, por lo tanto, será fundamental para definir y discernir el microbioma de la señal temporal y espacial. Hacia esta meta, lo aprovechó el conjunto Monte RNA en situ el hibridación. Esta técnica se usa rutinariamente para evaluar patrones de expresión génica en órganos y embriones12,13,14 y permite el análisis semicuantitativo de la expresión sobre toda la muestra de interés. Esto difiere de la tradicional en situ hibridación técnicas que utilizan secciones de tejidos y a menudo requieren un análisis extenso del material seccionado con un ensamblaje computacional para predecir la expresión en todo los órganos15. Mientras que Monte todo generalmente se refiere a todo los organismos12, aquí todo Monte se refiere a todo vísceras u órganos. Las ventajas de utilizar el conjunto de montaje RNA en situ hibridación enfoque para evaluar la arquitectura de la microbiota intestinal de garrapatas son múltiples. El intestino de la garrapata se compone de 7 pares de divertículos, cada par de variables en tamaño16. Las diferencias funcionales, si alguno, entre estos divertículos, no se entienden en el contexto de la biología de la garrapata, garrapata interacciones microbiota o tick-patógeno. Manipulaciones de la tripa que rompen los divertículos de intestino desplazaría la microbiota presente en el lumen del intestino o los asociados libremente con la tripa y resultar en una mala interpretación de la localización espacial de la microbiota. Marcados con fluorescencia RNA en situ el hibridación se ha utilizado anteriormente para examinar marca gut transcripciones17 mediante la fijación y apertura divertículos intestinales individuales para hibridación de la sonda y localizar del burgdorferi del B. transcripciones de secciones parafina-encajadas de garrapatas todo18. Ambos estos métodos requieren manipulaciones de los tejidos de garrapatas antes de hibridación que pueden afectar a la arquitectura de microbiota intestinal.
En este informe, describimos en detalle el protocolo para examinar garrapata viable intestinal microbiota con conjunto de montaje en situ hibridación (WMISH). El uso del montaje en conjunto RNA en situ hibridación permite una comprensión global de la presencia y abundancia de las bacterias del intestino específicos en las diferentes regiones del intestino y puede estimular nuevos conocimientos sobre biología de tripa de garrapatas en el contexto de la colonización de patógenos y la transmisión. Además, el uso de sondas de RNA dirigida contra ARN bacteriano específico permite la detección de bacterias viables en el intestino de la garrapata.

<table><tbody><tr><td>Sefar NITEX Malla de nylon, 110 micras</td><td>Amazon</td><td>03-110/47</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T Easy Vector System</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>Digoxygenin-11-UTP</td><td>Roche</td><td>1209256910</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I (sin ARNasa)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe SP6 Kit de síntesis de ARN</td><td>New England Biolabs</td><td>E2070S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 Kit de síntesis de ARN de alto rendimiento</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>Agua, sin ARNasa, tratada con DEPC</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02128-00500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0,5 M, pH 8,0</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído, 37%</td><td>JT Baker</td><td>2106-01</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600-00500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 10X</td><td>Gibco</td><td>14300-075</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolamina HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1502-100G</td><td></td></tr><tr><td>Anhídrido acético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>ThermoScientific/Pierce</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>SSC, 20X</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156-01000</td><td></td></tr><tr><td>ARN de levadura</td> <td>torulaSigma Aldrich</td><td>R3629-5G</td><td></td></tr><tr><td>Heparina, sal de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Denhardt, 50X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2532-5ML</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS hidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3023-1G</td><td></td></tr><tr><td>RNasa A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>RNasa T1</td><td>ThermoScientific&nbsp;</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Ácido maleico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0375-100G</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo bloqueante</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenina-AP, Fab fragmentos Sigma</td><td>Aldrich</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de levamisol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31742-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Sustrato cromogénico para fosfatasa alcalina</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de 11442074001 Bouin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT10132-1L</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno</td><td>Mallinkrodt Baker, Inc</td><td>2186-01</td><td></td></tr><tr><td>Escalera de ARN monocatenario</td><td>Ambion -Millenium</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;#11 Cuchillas de acero con alto contenido de carbono&nbsp;</td><td>C y A Estreno Científico</td><td>#11-9411</td><td></td></tr><tr><td>Termociclómetro</td><td>BioRad, CA</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>ThermoScientific&nbsp;</td><td>NanoDrop 2000C</td> Agitador orbital VWR DS-500E <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Agitador</td><td></td>orbital digital</tr><tr><td>Baño de agua agitador</td><td>BELLCO Glass, Inc</td><td>Hot Shaker-7746-12110</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de documentación</td><td>BioRad</td><td>Gel Doc XR+ Sistema</td><td></td>de documentación de gel</tr><tr><td>Microscopio de campo claro&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>NikonSM2745T</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de campo claro&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Scope.A1</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>STEMI 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Caja de luz</td><td>VWR</td><td>102097-658</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificación PCR&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Software de captura de imágenes</td><td>Zeiss</td><td>Zen lite</td><td></td></tr><tr><td>Software de edición de imágenes&nbsp;</td><td>Adobe&nbsp;</td><td>Adobe Photoshop CS4 versión 11.0</td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis de imágenes</td><td>Institutos Nacionales de Salud</td><td>ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Instrumentación compatible con automatización</td><td>Intavis Bioanalytical Instruments, Tubinga, Alemania).&nbsp;</td><td>Intavis, Biolane HT1.16v</td><td></td></tr></tbody></table>

visualización de la microbiota en agallas de garrapata por whole-mount in situ hibridación

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Enfermedades infecciosas transmitidas por vectores artrópodos siguen planteando una amenaza significativa para la salud humana en todo el mundo. Los patógenos que causan estas enfermedades, no existen en aislamiento cuando coloniza el vector; por el contrario, probablemente participan en interacciones con microorganismos residentes en el lumen intestinal. La microbiota del vector se ha demostrado que juegan un papel importante en la transmisión de patógenos de varias enfermedades transmitidas por vectores. No se determina si las bacterias residentes en el intestino de la garrapata de scapularis de Ixodes , el vector de varios patógenos humanos, incluyendo el burgdorferi de Borrelia, influyen en la transmisión de la señal de patógenos. Requieren métodos para caracterizar la composición de las bacterias asociadas con el intestino de la garrapata para facilitar una mejor comprensión de las interacciones entre las especies potenciales en el intestino de la garrapata. Con conjunto de montaje en situ hibridación visualizar transcritos de RNA asociadas a especie bacteriana en particular permite la recolección de datos cualitativos con respecto a la abundancia y distribución de la microbiota en el tejido intacto. Esta técnica puede utilizarse para examinar los cambios en el entorno de microbiota intestinal a lo largo de la señal de alimentación y también puede ser aplicada para analizar la expresión de los genes de la garrapata. La coloración de la garrapata entera guts rendimiento información sobre la distribución espacial bruta de destino RNA en el tejido sin necesidad de reconstrucción tridimensional y es menos afectada por contaminación del medio ambiente, que a menudo confunde basada en la secuenciación métodos utilizados con frecuencia para el estudio de comunidades microbianas complejas. En general, esta técnica es una herramienta valiosa que puede utilizarse para mejor entender las interacciones patógeno-vector-microbiota y su papel en la transmisión de la enfermedad.

La medición y valoración de la calidad de las sondas de RNA son esenciales antes de comenzar con la tinción. Eficiencia de transcripción in vitro depende altamente de la cantidad y calidad de la plantilla de la DNA. Habitualmente visualizamos las sondas de RNA en un gel de formaldehído para verificar la pureza y la cantidad de sonda generada por las reacciones de transcripción. Las sondas deben aparecer como bandas luminosas, discretos (figura 2). Me...

Aquí, presentamos un protocolo evaluar espacial y temporal la presencia de microbiota viable en agallas de señal usando un acercamiento modificado todo montaje de hibridación in situ.

Visualización de la Microbiota en agallas de garrapata por Whole-mount In Situ hibridación

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la entomología de las garrapatas, como evaluar la presencia de bacterias viables en la garrapata espacial y temporalmente. Las principales ventajas de esta técnica son que no requiere el seccionamiento de las garrapatas ni equipos costosos, y que permite la visualización espacial y temporal de las transcripciones de genes. Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades porque implica múltiples pasos y reactivos.Sin embargo, esta técnica no es laboriosa. Aunque puede tardar unos tres días en completarse, el tiempo de manos es de solo unas pocas horas cada día. En preparación, alimente a las garrapatas recolectadas durante 48 a 72 horas antes de la recolección intestinal.Para diseccionar el intestino de la garrapata, agregue de 20 a 30 microlitros de solución de MEMFA a un portaobjetos de vidrio limpio. A continuación, coloque la garrapata en el MEMFA y ajuste el enfoque a la cabeza de la marca. Ahora, usando un par de hojas de afeitar estériles de acero con alto contenido de carbono, corte la región de la cabeza en el escuto, dejando intacto el cuerpo de la garrapata.A continuación, presione suavemente el cuerpo para empujar los divertículos intestinales y las glándulas salivales fuera de la cutícula corporal. Luego, sin dañar las tripas, sepárelas con cuidado de las glándulas salivales y coloque con cuidado los cortes en una hoja de afeitar. Recoja todas las vísceras cosechadas en un tubo de 1,5 mililitros en 500 micrómetros de MEMFA.A continuación, incube el tubo a temperatura ambiente con un suave balanceo durante una hora. Al día siguiente, deshidrate el tejido como se indica en el protocolo de texto y guárdelo a menos 20 grados centígrados. Para preparar una canasta de malla, primero, use una cuchilla de un solo borde calentada en un bisturí para cortar la parte inferior de un tubo de centrífuga de dos mililitros o cinco mililitros con tapa a presión.Es posible que sea necesario recalentar la hoja varias veces antes de completar el corte. A continuación, corta un cuadrado de una malla de nailon de 110 micras que sea ligeramente más grande que las nuevas aberturas. Luego, pegue la malla a la abertura presionando ligeramente el tubo en la malla en una placa calefactora ajustada a fuego medio/bajo hasta que se haga un buen sellado.Después de que se enfríe, recorte el exceso de malla y asegúrese de que no haya espacios. Haga 24 de estas canastas para que coincidan con un plato de 24 pocillos. A continuación, corte agujeros en la tapa de una placa de 24 pocillos, de modo que el borde de la cesta de muestras agarre el agujero y no se caiga.Una vez terminadas, las cestas de muestras ensambladas deben asentarse completamente en los pozos. Ahora, use este soporte de cesta ajustado para transferir cestas de una placa a otra con relativa facilidad durante toda la hibridación in situ. Utilice dos placas de este tipo de modo que, mientras la muestra se incuba en una, la otra pueda prepararse para el siguiente lavado.Esta sección cubre ciertos pasos de la hibridación in situ. Consulte el protocolo de texto para obtener una descripción completa. Para comenzar, transfiera cada muestra de tejido fija a una canasta de muestras etiquetada.Organice la placa según las condiciones experimentales y tiña al menos cinco tripas por condición. Primero, rehidrate suavemente las muestras. Evite introducir burbujas de aire aumentando gradualmente la proporción de PBS-T a etanol en cada lavado.Durante el primer día, después de la etapa de prehibridación de dos horas, en lugar de desechar el tampón de hibridación, guárdelo para su uso futuro durante el ensayo. Más tarde, cuando trate las muestras con solución de hibridación de sonda, cubra la placa cómodamente con papel de aluminio para evitar la evaporación de la solución. El segundo día, cargue el tampón de hibridación reservado en la placa de 24 pocillos y caliente la placa hasta 60 grados centígrados.Más tarde ese día, para eliminar todos los rastros de sonda y tampón de hibridación, lave las muestras dos veces con 2x SSC durante tres minutos por lavado. A continuación, lave las muestras tres veces con 2x SSC durante 20 minutos por lavado a 60 grados centígrados. A continuación, prepare el anticuerpo primario en tampón de bloqueo.Cargue 500 microlitros de esta mezcla en cada pocillo. Después de la etapa de bloqueo, incubar a temperatura ambiente durante unas cuatro horas o a cuatro grados centígrados durante la noche. Al tercer día, ejecute la reacción de color en sustrato cromogénico.Cubra la placa de muestra con papel de aluminio. Y durante la reacción, compruebe periódicamente si hay manchas excesivas con el microscopio de disección. Al cuarto día es importante incubar y blanquear en una caja de luz, ya que esto permite eliminar cualquier pigmentación en las muestras o coloración de la solución de Bouin, y mejora la señal de la sonda para una visualización clara.Luego, después de lavar con SSC, transfiera cuidadosamente las muestras intestinales invirtiendo la canasta en una nueva placa de 24 pocillos. Mientras esté en los pozos, enjuague bien las cestas con etanol al 70%. A continuación, proceda con la obtención de imágenes de las muestras.Es fundamental estimar la calidad de las sondas de ARN antes de utilizarlas. Las sondas se pueden comprobar en un gel de formaldehído. Si aparecen como bandas brillantes y discretas, son de buena calidad.Al tingir, es normal que haya alguna variación en la distribución entre las réplicas biológicas, así como entre los siete pares de divertículos de los intestinos individuales. Por lo tanto, es mejor teñir al menos cinco tripas por condición para tener una idea del patrón de tinción promedio. El éxito general se mide mejor comparando la tinción de las muestras de sentido y antisentido para cada condición.Ambos deben desarrollarse durante la misma cantidad de tiempo. Las muestras de detección deben tener un color púrpura mínimo o nulo, mientras que las muestras antisentido deben mostrar una tinción robusta con un fondo mínimo. De manera crítica, los tejidos deben estar completamente sumergidos en la mancha para una exposición uniforme.Es importante evitar el desarrollo excesivo de la reacción de color. Esto puede dar lugar a una gran cantidad de tinción de fondo, y las muestras de sentido pueden empezar a parecer muestras antisentido. Otro factor que afecta a los resultados es la cantidad de alimento previo con las garrapatas.Las garrapatas que no se alimentan, o que se alimentan solo durante 24 horas, son difíciles de trabajar. Sus tripas se dañan más fácilmente y no se manchan bien. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días y medio o tres si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar tener listos todos los suministros enumerados en la tabla de reactivos y materiales antes de comenzar el experimento. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.

visualization-microbiota-tick-guts-whole-mount-situ

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Lyme estudios de investigación de la enfermedad a menudo requieren la generación de garrapatas infectadas con el patógeno Borrelia burgdorferi, un proceso que suele tardar varias semanas. Aquí se demuestra un procedimiento tick microinyección basado en una infección que se puede lograr en cuestión de horas. También demostramos un método de inmunofluorescencia para la localización in situ de B. burgdorferi en garrapatas.

Métodos para la transferencia rápida y localización de la enfermedad de Lyme patógenos en el intestino garrapatas

Fuente: Ng, K. M., Tropini, C. Visualización de las interacciones microbiota-huésped intestinal mediante hibridación in situ por fluorescencia, tinción de lectinas e imagen. J. Vis. Exp. (2021).Este vídeo demuestra el procedimiento de hibridación fluorescente in situ (FISH) para teñir la microbiota intestinal dentro del tejido intestinal del ratón mediante la hibridación de sondas fluorescentes con ARNr bacteriano (ácido ribonucleico ribosómico) y la contracoloración de las estructuras del...

Hibridación fluorescente in situ de bacterias intestinales en secciones intestinales de ratón

La enfermedad de Lyme es la enfermedad transmitida por vectores más comúnmente reportados en América del Norte. El agente causante, Borrelia burgdorferi es una bacteria espiroqueta transmitida por garrapatas ixódidas. Transmisión y detección de la infección en modelos animales se optimiza mediante el uso de la alimentación de la señal, que se describe aquí.

La alimentación de las garrapatas de los animales para Transmisión y xenodiagnóstico en Lyme Investigación de Enfermedades

PCR anidada es una técnica sensible, específica y directa que se puede aplicar a garrapata que extractos de ADN para sonda de burgdorferi de Borrelia, el agente causativo de la enfermedad de Lyme. El experimento inicial de PCR utiliza cartillas gene-específicas para generar amplicones de largo, que luego se convierten en plantillas para una posterior reacción usando cebadores internos.

Detectar el Spirochete de la enfermedad de Lyme, Burgdorferi de Borrelia, de garrapatas mediante PCR anidado

Aquí presentamos un protocolo de secuenciación de próxima generación para la secuenciación de rRNA 16S que permite la identificación y caracterización de comunidades microbianas en vectores. Este método implica la extracción de ADN, amplificación y código de barras de muestras mediante PCR, secuenciación en una celda de flujo y bioinformática para que coincida con los datos de la secuencia a la información filogenética.

Caracterización de microbioma marca Next-Generation 16S rRNA Amplicon ordenando

Este protocolo simplificado detalla un flujo de trabajo para detectar e obtener imágenes de bacterias en muestras de tejido complejo, desde la fijación del tejido hasta la tinción de microbios con hibridación fluorescente in situ .

Visualización de las interacciones entre la microbiota intestinal y el huésped a través de la hibridación fluorescente in situ , la tinción de lectina y la obtención de imágenes

El presente protocolo describe el aislamiento de microARN de las glándulas salivales de las garrapatas y las vesículas extracelulares purificadas. Este es un procedimiento universal que combina reactivos y suministros de uso común. El método también permite el uso de un pequeño número de garrapatas, lo que resulta en microARN de calidad que se pueden secuenciar fácilmente.

Aislamiento de microARN de cultivos de garrapatas ex vivo de glándulas salivales y vesículas extracelulares

Aquí, describimos un procedimiento que permite la detección de bacterias patógenas en todo el órgano durante la infección y la cuantificación de las actividades de los reporteros fluorescentes.

Tomografía tridimensional de órgano entero de alta resolución de infecciones microbianas

Proponemos un protocolo optimizado de Microscopía Electrónica de Barrido para la visualización de muestras altamente heterogéneas y delicadas que contienen biomasa vegetal y fúngica, junto con microbiota y biofilm. Este protocolo permite describir las dimensiones espaciales de la organización de la microbiota.

Microbiota de los hormigueros de Atine: visualización de un paisaje microbiano mediante microscopía electrónica de barrido

Aquí, presentamos un protocolo para recolectar saliva, hemolinfa, glándulas salivales e intestino medio, después de la disección de una garrapata alimentada individualmente, para estudiar la localización específica del tejido de los patógenos transmitidos por garrapatas para avanzar en la comprensión de la competencia del vector y las interacciones patógeno-microbioma.

Extracción de saliva, hemolinfa, glándulas salivales e intestino medio de garrapatas individuales (Acari: Ixodidae)

Aprende a visualizar la microbiota viable en intestinos de garrapatas mediante hibridación in situ whole-mount. Este método accesible permite el análisis espacial y temporal sin equipos costosos.

Visualización de la Microbiota en agallas de garrapata por Whole-mount In Situ hibridación

Explorar más videos