Visualización de la Microbiota en agallas de garrapata por Whole-mount In Situ hibridación

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la entomología de las garrapatas, como evaluar la presencia de bacterias viables en la garrapata espacial y temporalmente. Las principales ventajas de esta técnica son que no requiere el seccionamiento de las garrapatas ni equipos costosos, y que permite la visualización espacial y temporal de las transcripciones de genes. Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades porque implica múltiples pasos y reactivos.

Sin embargo, esta técnica no es laboriosa. Aunque puede tardar unos tres días en completarse, el tiempo de manos es de solo unas pocas horas cada día. En preparación, alimente a las garrapatas recolectadas durante 48 a 72 horas antes de la recolección intestinal.

Para diseccionar el intestino de la garrapata, agregue de 20 a 30 microlitros de solución de MEMFA a un portaobjetos de vidrio limpio. A continuación, coloque la garrapata en el MEMFA y ajuste el enfoque a la cabeza de la marca. Ahora, usando un par de hojas de afeitar estériles de acero con alto contenido de carbono, corte la región de la cabeza en el escuto, dejando intacto el cuerpo de la garrapata.

A continuación, presione suavemente el cuerpo para empujar los divertículos intestinales y las glándulas salivales fuera de la cutícula corporal. Luego, sin dañar las tripas, sepárelas con cuidado de las glándulas salivales y coloque con cuidado los cortes en una hoja de afeitar. Recoja todas las vísceras cosechadas en un tubo de 1,5 mililitros en 500 micrómetros de MEMFA.

A continuación, incube el tubo a temperatura ambiente con un suave balanceo durante una hora. Al día siguiente, deshidrate el tejido como se indica en el protocolo de texto y guárdelo a menos 20 grados centígrados. Para preparar una canasta de malla, primero, use una cuchilla de un solo borde calentada en un bisturí para cortar la parte inferior de un tubo de centrífuga de dos mililitros o cinco mililitros con tapa a presión.

Es posible que sea necesario recalentar la hoja varias veces antes de completar el corte. A continuación, corta un cuadrado de una malla de nailon de 110 micras que sea ligeramente más grande que las nuevas aberturas. Luego, pegue la malla a la abertura presionando ligeramente el tubo en la malla en una placa calefactora ajustada a fuego medio/bajo hasta que se haga un buen sellado.

Después de que se enfríe, recorte el exceso de malla y asegúrese de que no haya espacios. Haga 24 de estas canastas para que coincidan con un plato de 24 pocillos. A continuación, corte agujeros en la tapa de una placa de 24 pocillos, de modo que el borde de la cesta de muestras agarre el agujero y no se caiga.

Una vez terminadas, las cestas de muestras ensambladas deben asentarse completamente en los pozos. Ahora, use este soporte de cesta ajustado para transferir cestas de una placa a otra con relativa facilidad durante toda la hibridación in situ. Utilice dos placas de este tipo de modo que, mientras la muestra se incuba en una, la otra pueda prepararse para el siguiente lavado.

Esta sección cubre ciertos pasos de la hibridación in situ. Consulte el protocolo de texto para obtener una descripción completa. Para comenzar, transfiera cada muestra de tejido fija a una canasta de muestras etiquetada.

Organice la placa según las condiciones experimentales y tiña al menos cinco tripas por condición. Primero, rehidrate suavemente las muestras. Evite introducir burbujas de aire aumentando gradualmente la proporción de PBS-T a etanol en cada lavado.

Durante el primer día, después de la etapa de prehibridación de dos horas, en lugar de desechar el tampón de hibridación, guárdelo para su uso futuro durante el ensayo. Más tarde, cuando trate las muestras con solución de hibridación de sonda, cubra la placa cómodamente con papel de aluminio para evitar la evaporación de la solución. El segundo día, cargue el tampón de hibridación reservado en la placa de 24 pocillos y caliente la placa hasta 60 grados centígrados.

Más tarde ese día, para eliminar todos los rastros de sonda y tampón de hibridación, lave las muestras dos veces con 2x SSC durante tres minutos por lavado. A continuación, lave las muestras tres veces con 2x SSC durante 20 minutos por lavado a 60 grados centígrados. A continuación, prepare el anticuerpo primario en tampón de bloqueo.

Cargue 500 microlitros de esta mezcla en cada pocillo. Después de la etapa de bloqueo, incubar a temperatura ambiente durante unas cuatro horas o a cuatro grados centígrados durante la noche. Al tercer día, ejecute la reacción de color en sustrato cromogénico.

Cubra la placa de muestra con papel de aluminio. Y durante la reacción, compruebe periódicamente si hay manchas excesivas con el microscopio de disección. Al cuarto día es importante incubar y blanquear en una caja de luz, ya que esto permite eliminar cualquier pigmentación en las muestras o coloración de la solución de Bouin, y mejora la señal de la sonda para una visualización clara.

Luego, después de lavar con SSC, transfiera cuidadosamente las muestras intestinales invirtiendo la canasta en una nueva placa de 24 pocillos. Mientras esté en los pozos, enjuague bien las cestas con etanol al 70%. A continuación, proceda con la obtención de imágenes de las muestras.

Es fundamental estimar la calidad de las sondas de ARN antes de utilizarlas. Las sondas se pueden comprobar en un gel de formaldehído. Si aparecen como bandas brillantes y discretas, son de buena calidad.

Al tingir, es normal que haya alguna variación en la distribución entre las réplicas biológicas, así como entre los siete pares de divertículos de los intestinos individuales. Por lo tanto, es mejor teñir al menos cinco tripas por condición para tener una idea del patrón de tinción promedio. El éxito general se mide mejor comparando la tinción de las muestras de sentido y antisentido para cada condición.

Ambos deben desarrollarse durante la misma cantidad de tiempo. Las muestras de detección deben tener un color púrpura mínimo o nulo, mientras que las muestras antisentido deben mostrar una tinción robusta con un fondo mínimo. De manera crítica, los tejidos deben estar completamente sumergidos en la mancha para una exposición uniforme.

Es importante evitar el desarrollo excesivo de la reacción de color. Esto puede dar lugar a una gran cantidad de tinción de fondo, y las muestras de sentido pueden empezar a parecer muestras antisentido. Otro factor que afecta a los resultados es la cantidad de alimento previo con las garrapatas.

Las garrapatas que no se alimentan, o que se alimentan solo durante 24 horas, son difíciles de trabajar. Sus tripas se dañan más fácilmente y no se manchan bien. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días y medio o tres si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar tener listos todos los suministros enumerados en la tabla de reactivos y materiales antes de comenzar el experimento. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.