Asignación de metabolismo: Supervisar la actividad de la deshidrogenasa del lactato directamente en el tejido

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología, como la actividad de las enzimas en diferentes lugares dentro de los tejidos. La principal ventaja de esta técnica es que permite al investigador detectar la actividad enzimática directamente en las muestras de tejido. Para comenzar este procedimiento, retire el pelo del ratón con una recortadora de pelo de animal.

Haz una incisión en la piel de la espalda con unas tijeras. Luego, levanta la piel y córtala. A continuación, llene el Cryomold con compuesto reactivo de congelación.

Con pinzas nasales de aguja, coloque las secciones de piel en el Cryomold del campo. Oriente las secciones de la piel de modo que la sección transversal de la piel desde la epidermis hasta la dermis, la hipodermis y el músculo sea visible. Si es posible, monte los ratones experimentales y de control juntos en el mismo Cryomold, de modo que puedan seccionarse en el mismo portaobjetos y procesarse juntos.

Ten cuidado de no crear burbujas. Coloque el Cryomold sobre una superficie plana de un bloque de hielo seco en una cubeta de hielo. Para el almacenamiento, transfiera el Cryomold a un congelador a 80 grados centígrados negativos.

Las muestras se pueden mantener en el congelador durante aproximadamente tres meses sin pérdida significativa de actividad enzimática. Para el corte, usando un criostato establecido a 20 grados centígrados negativos, corte el tejido para crear secciones de siete a 10 micrómetros de grosor para obtener la mejor morfología de la piel. En este procedimiento, establezca el conjunto de portaobjetos que se van a probar, que incluye un portaobjetos de control en el que se retendrá el NAD, otro portaobjetos de control en el que se retendrá el lactato del sustrato y un portaobjetos de control positivo de un bloque de tejido congelado previamente investigado.

Fije brevemente los portaobjetos que contienen las secciones de piel con formalina al 4% durante cinco minutos. A continuación, lave los portaobjetos con PBS. A continuación, mezcle los reactivos, incluidos el NADP, el PMS, el cloruro de azul de nitrotetrazolio y el lactato para la tinción de la actividad de lactato deshidrogenasa en un tubo de tamaño adecuado.

A continuación, prepare una segunda solución en la que estén presentes todos los reactivos excepto el NAD. Posteriormente, prepare una tercera solución en la que estén presentes todos los reactivos excepto el lactato. Para incubar los portaobjetos y la solución de tinción o las soluciones de control, sumérjalos en la solución al mismo tiempo.

Luego, incubarlos en un ambiente humidificado a 37 grados centígrados en la oscuridad. Supervise la conversión de la solución de tinción de transparente a azul. Cuando las muestras hayan alcanzado el nivel deseado de color azul, detenga la reacción retirando la solución de tinción y enjuagándolas con PBS.

A continuación, una contramancha en los portaobjetos cuando éstos hayan alcanzado un nivel adecuado de azul. Las contratinciones que tiñen el nuclear de rojo o verde proporcionarán un buen contraste con el azul creado por el precipitante de Formosa. A continuación, monte las guías con un medio de montaje acuoso o no acuoso.

De una a tres gotas de medio de montaje es suficiente, dependiendo del tamaño del cubreobjetos. Posteriormente, tome imágenes de los portaobjetos bajo un microscopio óptico. Tome fotografías de muestras experimentales y de control, y de todos los controles negativos con aumentos de 10X, 20X y 40X.

La intensidad de la tinción aumentará con el tiempo a medida que la misma se incube con la solución de tinción. Como se muestra aquí, se observaron altos niveles de actividad de lactato deshidrogenasa en las células madre del folículo piloso en la base del folículo piloso. Las muestras de control que no recibieron el sustrato de lactato no mostraron tinción.

Estos hallazgos fueron corroborados por la clasificación de células activadas fluorescentes de la piel para células madre del folículo piloso y confirmaron una alta actividad de lactato deshidrogenasa en el compartimento de células madre con actividad en las células clasificadas. Sobre la base de los hallazgos de que las células madre del folículo piloso tienen una alta actividad de lactato deshidrogenasa, se probaron células madre embrionarias cultivadas. Los fibroblastos embrionarios de ratón que sirven como capa alimentadora se analizaron en presencia de células madre embrionarias o solos.

Se observó una alta actividad de lactato deshidrogenasa en las células madre embrionarias en comparación con el fibroblasto embrionario de ratón, como se muestra en diferentes puntos temporales. El protocolo de tinción también se aplicó a tejido recién aislado. Se disecaron las aortas de los ratones.

Las muestras se incubaron con la solución salina equilibrada de Hank que contenía 0,5% de Triton X durante 10 minutos. A continuación, con la solución de tinción de lactato deshidrogenasa durante 10 minutos. Las imágenes aquí muestran una solución de lactato deshidrogenasa con y sin lactato.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar rodajas de tejido congelado con actividad enzimática intacta y los bloques congelados no deben ser demasiado viejos. Si se almacenan secciones preparadas, no se debe permitir que las secciones se sequen. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar la actividad de la lactato deshidrogenasa en la piel del ratón.