Tinte de FM ciclismo en la sinapsis: comparación de potasio alto despolarización, eléctrico y Channelrhodopsin estimulación

El objetivo general de este experimento es observar el ciclo de endocitosis y exocitosis de vesículas sinápticas en la preparación viva de la unión neuromuscular de las larvas de Drosophila utilizando colorantes FM fluorescentes. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como ¿qué genes son críticos para la función del ciclo de las vesículas sinápticas? La principal ventaja de esta técnica es que se puede realizar un seguimiento óptico del ciclo de las vesículas en una preparación en vivo utilizando tres tipos diferentes de estímulos, alta despolarización de potasio, estimulación eléctrica o utilizando optogenética.

A este procedimiento se añade el anticuerpo anti-HRP, conjugado a una lexoflor 647 a la solución salina disecante. A continuación, agregue un cubreobjetos recubierto de elastómero a la cámara de disección y luego agregue la solución de disección con anticuerpo HRP para marcar el terminal presináptico NMJ durante la disección. Con un pincel fino, transfiera un tercer estadio errante del vial de alimentos a un cubreobjetos recubierto de elastómero.

A continuación, llene la punta de una micropipeta de vidrio con un pequeño volumen de pegamento, utilizando la presión de aire negativa generada por la boca. A continuación, coloque las larvas, con la dorsal hacia arriba, con pinzas y pegue la cabeza al cubreobjetos recubierto de elastómero con una pequeña gota de pegamento utilizando presión de aire positiva por la boca. Repita este procedimiento con el extremo posterior de las larvas, asegurándose de que el animal esté estirado entre los dos accesorios de pegamento.

Con unas tijeras, haga un corte horizontal de un milímetro en la parte posterior y un corte vertical a lo largo de la línea media dorsal. A continuación, retire suavemente la tráquea dorsal, el intestino, el cuerpo graso y otros órganos internos, cubriendo la musculatura. Repita el procedimiento de pegado para las cuatro solapas de la pared del cuerpo, asegurándose de estirar suavemente el cuerpo tanto horizontal como verticalmente.

Después, levante el VNC y corte con cuidado los nervios motores con las tijeras y retire completamente el VNC. Reemplace la solución salina de disección con solución salina libre de calcio para detener el ciclo de SV. Para la estimulación eléctrica, prepare una pipeta de succión con el extractor de microelectrodos para obtener el cono y el tamaño de punta requeridos.

Después, pule al fuego la punta del microelectrodo con una microforja para crear un ajuste apretado al aspirar un solo nervio motor. Deslice la pipeta de succión sobre el soporte de electrodos en un micromanipulador, que está conectado a un tubo de plástico largo y flexible y una jeringa. A continuación, coloque la preparación con colorante FM en la platina del microscopio y eleve la platina hasta que las larvas y la pipeta de succión estén enfocadas.

A continuación, aspire un bucle de nervio motor cortado, inervando el segmento hemi seleccionado con presión de aire negativa, generada por la jeringa, en el electrodo de succión. Posteriormente, estimular el nervio motor utilizando los parámetros seleccionados para impulsar la endocitosis SV y la absorción del colorante FM 143. El paso más crítico en este punto del procedimiento es aspirar un solo axón del motor en el electrodo de succión con un ajuste apretado.

Esto puede requerir un poco de prueba y error. Una vez que se encuentre un electrodo de succión adecuado, use el mismo para todas las condiciones que se comparan para garantizar una tensión de estimulación constante. Para la descarga del colorante FM, succionar el mismo nervio motor en el mismo electrodo y luego estimular el nervio motor para activar la exocitosis SV y la liberación del tinte FM 143.

Para la estimulación con cidoopsina, conecte un LED azul a un estimulador programable mediante un cable coaxial y coloque el LED en el puerto de la cámara. Enfoque el haz de luz LED azul en la preparación con tinte FM utilizando la función de zoom del microscopio. El paso más crítico en este punto del procedimiento es asegurarse de que los ajustes de los LED se mantengan constantes y que se ilumine la misma parte de cada animal para todas las condiciones que se comparan para garantizar una tensión de estimulación constante.

Inicie la estimulación lumínica y realice un seguimiento con el temporizador durante la duración predeterminada del período de estimulación optogenética. Cuando el temporizador se detenga, retire rápidamente la solución de tinte FM y reemplácela con solución salina sin calcio para detener el ciclo SV. De la descarga de colorante FM, inicie la estimulación lumínica y realice un seguimiento con un temporizador durante la duración predeterminada del período de estimulación optogenética.

Cuando finalice el período del temporizador, retire rápidamente la solución de tinte FM y colóquela con solución salina libre de calcio para detener el ciclo SV. Para cuantificar la imagen fluorescente, cárguela en la imagen J y cree una proyección de intensidad máxima haciendo clic en Imagen, Pilas, Zproject, luego usando el canal anti-HRP 647, vaya a Imagen, Ajustar, Umbral y deslice la barra de herramientas superior hasta que solo se resalte el NMJ. Usando la herramienta de varita, haga clic en el NMJ.

Si el NMJ es discontinuo, mantenga presionado el botón de cambio y seleccione todas las partes. A continuación, cambie la imagen al canal de colorante FM 143 y vaya a Analizar, Medir, para obtener la medición de fluorescencia. Repita estos pasos para la imagen descargada del mismo NMJ.

El FM 143 fluorescente se puede fotoconvertir en un precipitado denso de electrones DAB oxidado para su visualización a través de TEM. Aquí hay un diagrama esquemático del método de conversión de fotos para etiquetar la drosophila NMJ después de la carga de tinte FM 143 dependiente de la actividad. Esta es una imagen TEM representativa de un botón sináptico de tipo salvaje en reposo, que muestra una densa población de SV de tamaño uniforme.

Estas imágenes muestran los botones sinápticos que han sido estimulados con alta despolarización salina de potasio durante cinco minutos sin fotoconversión o con fotoconversión FM 143. Aquí se pueden observar las estructuras homo de extremo grueso. Y estas imágenes muestran los botones sinápticos que han sido estimulados eléctricamente con el electrodo de succión nerviosa a 20 hercios durante cinco minutos sin fotoconversión o con fotoconversión FM 143.

Tenga en cuenta que las vesículas cargadas de tinte parecen mucho más oscuras que las vesículas descargadas adyacentes. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar una disección de pegamento larvario, así como la carga y descarga de tintes FM mediante despolarización de alto potasio, estimulación eléctrica y estimulación optogenética con canalrodopsina. Desde que los colorantes FM fueron sintetizados por primera vez por Fei-Mao, estos colorantes versátiles se han utilizado para estudiar la movilización dependiente de la actividad de distintos grupos de vesículas para estudiar la diferencia entre la endocitosis mediada por clatrina, así como para estudiar las actividades sinápticas evocadas, espontáneas y en miniatura.

Hay muchos factores a tener en cuenta a lo largo de este experimento. Por nombrar algunos, la concentración externa de calcio, el tipo de método de estimulación que utiliza, así como el tiempo que se debe cargar y descargar el tinte FM durante los pasos de absorción y liberación. Tenga en cuenta estos factores cuando planifique su propio experimento.

¡Buena suerte!